הכנת דגימות באמצעות מכשיר הסוניקציה VialTweeter

הכנת דגימות לפני אנליזה עשויה לדרוש תהליכים קדם־אנליטיים שונים כגון הומוגניזציה של רקמות, ליזיס, מיצוי חלבונים, DNA, RNA, אברונים וחומרים תוך־תאיים אחרים, המסה וסילוק גזים. VialTweeter הוא מכשיר סוניקציה ייחודי המכין מספר מבחנות דגימה בו־זמנית בתנאים זהים בדיוק. הודות לסוניקציה העקיפה של מבחנות סגורות, נמנעים זיהום צולב ואובדן דגימה.

הכנת דגימות באולטרסאונד

טיפול באולטרסאונד הוא טכניקה נפוצה לטיפול בדגימות כדי להכינן לאנליזות כגון תגובת שרשרת של פולימרים (PCR), תספיגי ווסטרן, מבחנים, ריצוף מולקולרי, כרומטוגרפיה וכו׳. טיפול באולטרסאונד הוא טכניקה הנמצאת בשימוש נרחב במעבדות לטיפול קדם־אנליטי בדגימות. יתרון מרכזי של סוניקציה הוא שעקרון הפעולה של אולטרסאונד מבוסס על כוחות מכניים בלבד. ליזיס ופירוק תאים באולטרסאונד מושגים באמצעות כוחות גזירה סונו־מכניים, המקנים לטיפול באולטרסאונד את היתרון שניתן להשתמש בממסים המשמשים למיצוי חלבונים גם במהלך הליזיס. מכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים כגון VialTweeter שוברים את דופנות התאים / ממברנות התאים ומקדמים מעבר מסה בין פנים התא לממס. כך מועברים האנליטים (למשל DNA, RNA, חלבונים, אברונים וכו׳) ביעילות ממטריצת התא אל הממס. משמעות הדבר היא ששלבי עצירת התגובה והמיצוי חופפים לתהליך פירוק התאים באולטרסאונד, ולכן הליזיס האולטרסוני יעיל מאוד. נוסף על כך, הכנת דגימות באולטרסאונד אינה דורשת דטרגנטים וריאגנטים אחרים לליזיס, העלולים לשנות ולהרוס את מבנה הליזט וידועים בקשיים שהם גורמים בהמשך הטיהור. שיטת ליזיס אחרת, פירוק אנזימטי, דורשת זמני הדגרה ארוכים ולעיתים קרובות מניבה תוצאות שאינן ניתנות לשחזור. הכנת דגימות באולטרסאונד מתגברת על בעיות נפוצות בהכנת דגימות כגון הומוגניזציה של רקמות, פירוק תאים, ליזיס, מיצוי חלבונים והמסה של ליזט. מכיוון שניתן לשלוט במדויק בעוצמת הטיפול האולטרסוני ולהתאימה לדגימה הביולוגית, נמנעים פירוק ואובדן דגימה. ניטור ובקרה אוטומטיים של טמפרטורת הדגימה, מצב הפולסים ומשך הסוניקציה מבטיחים תוצאות מיטביות.
 

VialTweeter נוח במיוחד לעבודה במעבדה הדורשת הכנה בו־זמנית של מספר דגימות באותם תנאים. VialTweeter הוא סונוטרודה אולטרסונית בצורת בלוק, שיכולה להכיל עד 10 בקבוקונים (למשל מבחנות Eppendorf, מבחנות צנטריפוגה, מבחנות NUNC ובקבוקוני הקפאה) ומבצעת בהם סוניקציה בעוצמה גבוהה בתנאים מבוקרים במדויק. מכיוון שהאנרגיה האולטרסונית מועברת דרך דופנות הבקבוקונים אל תווך הדגימה, הבקבוקונים נשארים סגורים במהלך הטיפול. כך נמנעים לחלוטין אובדן דגימה וזיהום צולב.

בקבוקונים ומבחנות המתאימים ל־VialTweeter

VialTweeter מתאים להחזקת 10 מבחנות נפוצות בעלות תחתית חרוטית או עגולה, כגון מבחנות Eppendorf, מבחנות צנטריפוגה, בקבוקוני הקפאה וסוגים שונים של בקבוקוני NUNC, אך ניתן להתאים את החורים לגדלים אחרים של בקבוקונים ומבחנות לפי בקשה. אנא הודיעו לנו באיזה סוג של מבחנות ברצונכם להשתמש כדי שנוכל להתאים את ה־VialTweeter שלכם בהתאם. עבור מבחנות גדולות יותר כגון מבחנות Falcon ומכלי בדיקה אחרים, כוסות מעבדה וכלים, VialPress הוא פתרון נוח.
קראו עוד על VialTweeter מדגם VT26dxx המותאם לגודל המבחנה הספציפי שלכם, למשל מבחנות Falcon!

VialTweeter עם VialPress

בעוד ש-VialTweeter עצמו, עם 10 החורים למבחנות, הוא כבר מכשיר אולטרסוני ייחודי ובעל פונקציונליות גבוהה, תוסף VialPress הופך את VialTweeter לרב-תכליתי ולגמיש עוד יותר בתפעול. VialPress הוא אביזר ל-VialTweeter המורכב ממוט הידוק המאפשר לקבע מבחנות דגימה גדולות יותר, כגון מבחנות Falcon, או כוסות מעבדה אחרות בגודל קטן עד בינוני, לחזית של VialTweeter. התמונה משמאל מציגה את VialTweeter כשהוא מחזיק 10 מבחנות Eppendorf בבלוק, בעוד ש-VialPress מקבע מבחנה אחת גדולה יותר לחזית לצורך סוניקציה. VialPress מסוגל להחזיק עד 5 מבחנות גדולות יותר לצורך סוניקציה בעוצמה גבוהה.

פרוטוקולים להכנת דגימות באמצעות VialTweeter

VialTweeter נמצא בשימוש נרחב לסוניקציה של דגימות ביולוגיות. לפני האנליזה יש להכין את הדגימות לאנליזות ולבדיקות ביוכימיות או ביופיזיקליות, למשל באמצעות ליזיס, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי חלבונים, גזירת DNA / RNA, סילוק גזים וכדומה. VialTweeter מבצע תהליכים אולטרסוניים אלה באופן אמין ומספק תוצאות הניתנות לשחזור. יישום נפוץ של VialTweeter הוא ליזיס/פירוק תאים של רקמות יונקים (בני אדם ובעלי חיים), וכן של תאי חיידקים וחלקיקים נגיפיים. דגימות ביולוגיות שטופלו בהצלחה באמצעות VialTweeter כוללות תאי אפיתל מריאות אדם, תאי גזע המטופויאטיים, תאי לוקמיה מיאלואידית, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Streptococcus pyogenes, Caulobacter crescentus, Mycoplasma pneumoniae, מיקובקטריות, קומפלקס Mycobacterium tuberculosis (MTBC) ותאי חיידקים, תאים צמחיים ותאים מיקרוביאליים רבים אחרים.
להלן כמה פרוטוקולים נבחרים המשתמשים ב-VialTweeter.

ליזיס של E.Coli באמצעות VialTweeter לקביעת רמות גלוטתיון בתוך האורגניזם החי

חיידקי Escherichia coli מהזן MG1655 גודלו במצע מינימלי MOPS בנפח כולל של 200ml עד שהתקבל ערך A600 של 0.5. התרבית חולקה לתרביות בנפח 50-ml לצורך טיפול עקה. לאחר הדגרה של 15 min עם אליצין בריכוז 0.79 mM, דיאמיד בריכוז 1 mM או דימתיל סולפוקסיד (ביקורת), התאים נאספו ב-4,000g בטמפרטורה של 4°C במשך 10 min. התאים נשטפו פעמיים בבופר KPE לפני הרחפה מחדש של המשקעים ב-700µl של בופר KPE. להסרת חלבונים נוספו 300µl של חומצה סולפוסליצילית בריכוז 10% (w/v) לפני פירוק התאים באמצעות סוניקציה (3 x 1 min; מכשיר סוניקציה VialTweeter). הנוזלים העליונים נאספו לאחר צנטריפוגה (30 min, 13,000g, 4°C). ריכוזי החומצה הסולפוסליצילית הופחתו ל-1% באמצעות הוספת 3 נפחים של בופר KPE. מדידות של גלוטתיון כולל ושל GSSG בוצעו כמתואר לעיל. ריכוזי הגלוטתיון התוך-תאיים חושבו על בסיס נפח של 6.7×10-15 ליטר לתאי E. coli וצפיפות תאים של A600 0.5 (שוות ערך ל-1×108 תאים ל-ml-1 תרבית). ריכוזי GSH חושבו באמצעות חיסור 2[GSSG] מסך הגלוטתיון. (Müller et al. 2016)

פרגמנטציה של סיבי אלפא-סינוקלאין באמצעות VialTweeter

מכשיר הסוניקציה VialTweeter נמצא בשימוש נרחב לפרגמנטציה אמינה ויעילה של סיבים וסרטים של אלפא-סינוקלאין. לחצו כאן לתיאורים מפורטים, לפרוטוקולים ולמקורות בנושא פרגמנטציה של אלפא-סינוקלאין באמצעות VialTweeter!

ליזיס של תאים באמצעות VialTweeter לפני ספקטרומטריית בליעה אטומית בתנור גרפיט

חיידקי Bacillus subtilis 168 (trpC2) נחשפו לעקה אנטיביוטית במשך 15 min, ולאחר מכן נאספו התאים ב-3,320 x g, נשטפו חמש פעמים בתמיסה של 100 mM Tris/1 mM EDTA, ב-pH 7.5, הורחפו מחדש ב-10 mM Tris, ב-pH 7.5, ופורקו באמצעות סוניקציה במכשיר Hielscher VialTweeter. (Wenzel et al. 2014)

הכנת דגימות באמצעות VialTweeter לפני ספקטרומטריית מסה

משקעי התאים המיובשים בהקפאה של תאי גזע/אב המטופויאטיים אנושיים מסוג CD34􏰀 הורחפו מחדש ב-10µ􏰇l (200µl להכנה בכמות גדולה של HEK293 עבור סדרת מיהולי הפפטידים) של אוריאה בריכוז 8 M באמוניום מימן פחמתי בריכוז 100 mM, ועברו ליזיס בסיוע סוניקציה באמצעות Hielscher VialTweeter באמפליטודה של 60%, במחזור של 60% ולמשך 20s, שלוש פעמים עם קירור ביניים על קרח. (Amon et al. 2019)

פרוטוקולים להכנת דגימות באמצעות VialPress

חסה טרייה (Lactuca sativa) עברה הומוגניזציה בבופר HEPES בריכוז 0.5 M (pH 8, מותאם באמצעות KOH), ביחס של 1 g צמח (משקל טרי) ל-200, 100, 50 או 20 mL תמיסת בופר. היחס בין מסת הצמח לנפח תמיסת הבופר שונה כדי לשמור על נפח כולל של ההומוגנט בין 3.5 ל-12 mL. היחס בין מסת הצמח לנפח תמיסת הבופר שונה כדי לשמור על נפח כולל של ההומוגנט בין 3.5 ל-12 mL, וכך לאפשר הומוגניזציה באמצעות הגשושית. לאחר מכן עברו ההומוגנטים סוניקציה עקיפה באמצעות UP200St עם VialTweeter המצויד ב-200xt VialPress (Hielscher Ultrasonics GmbH, גרמניה) במשך 3 min (80% פולס ו-100% הספק). השימוש במכשיר זה מנע זיהום. (Laughton et al. 2019)

בקרת טמפרטורה אמינה במהלך סוניקציה באמצעות VialTweeter

הטמפרטורה היא גורם מכריע המשפיע על התהליך, וחשיבותה רבה במיוחד בטיפול בדגימות ביולוגיות. כמו כל השיטות המכניות להכנת דגימות, סוניקציה מייצרת חום. עם זאת, בעת השימוש ב-VialTweeter ניתן לשלוט היטב בטמפרטורת הדגימות. אנו מציגים בפניכם אפשרויות שונות לניטור טמפרטורת הדגימות ולבקרה עליה במהלך הכנתן לאנליזה באמצעות VialTweeter ו-VialPress.

1. ניטור טמפרטורת הדגימה: המעבד האולטרסוני UP200St, המפעיל את VialTweeter, מצויד בתוכנה חכמה ובחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. חברו את חיישן הטמפרטורה ל-UP200St והכניסו את קצה החיישן לאחת ממבחנות הדגימה. באמצעות צג מגע דיגיטלי צבעוני תוכלו להגדיר בתפריט של UP200St טווח טמפרטורות מסוים לסוניקציה של הדגימות שלכם. מכשיר הסוניקציה יעצור אוטומטית כאשר תושג הטמפרטורה המרבית, וישהה את פעולתו עד שטמפרטורת הדגימה תרד לערך התחתון של הטמפרטורה ∆ שהוגדרה. לאחר מכן הסוניקציה תתחיל שוב אוטומטית. תכונה חכמה זו מונעת פירוק הנגרם מחום.
2. ניתן לקרר מראש את בלוק ה-VialTweeter. הכניסו את בלוק ה-VialTweeter (רק את הסונוטרודה ללא המתמר!) למקרר או למקפיא כדי לקרר מראש את בלוק הטיטניום ולסייע בעיכוב עליית הטמפרטורה בדגימה. במידת האפשר, ניתן לקרר מראש גם את הדגימה עצמה.
3. השתמשו בקרח יבש לקירור במהלך הסוניקציה. השתמשו במגש רדוד המלא בקרח יבש והניחו את VialTweeter על הקרח היבש כדי שהחום יוכל להתפזר במהירות.

לקוחות ברחבי העולם משתמשים ב-VialTweeter וב-VialPress לעבודתם היומיומית בהכנת דגימות במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות, רפואיות וקליניות. בזכות התוכנה החכמה ובקרת הטמפרטורה של המעבד UP200St, הטמפרטורה מבוקרת באופן אמין ונמנע פירוק הדגימות עקב חום. הכנת דגימות אולטרסונית באמצעות VialTweeter ו-VialPress מספקת תוצאות אמינות ביותר הניתנות לשחזור!

פרטים טכניים של VialTweeter

VialTweeter הוא סונוטרודה בצורת בלוק העשויה מטיטניום, היכולה להכיל עד 10 בקבוקונים בחורים שבבלוק. בנוסף, ניתן להצמיד באמצעות VialPress עד 5 מבחנות גדולות יותר לחזית ה-VialTweeter. VialTweeter מתוכנן כך שאנרגיית הסוניקציה מתפזרת באופן אחיד בכל בקבוקון מוכנס, כדי להבטיח תוצאות סוניקציה אמינות ואחידות. ציר קטן מתאים את סונוטרודת ה-VialTweeter למשטח שאינו ישר ומיישר את המבחנות במאונך.

יתרונות VialTweeter במבט מהיר

• סוניקציה עוצמתית של עד 10 בקבוקונים בו-זמנית
• סוניקציה עקיפה בעוצמה אולטרסונית גבוהה דרך דופן הכלי אל תוך הדגימה
• סוניקציה עקיפה מונעת זיהום צולב ואובדן דגימה
• תוצאות הניתנות לשחזור הודות למשרעת סוניקציה הניתנת לכוונון ולבקרה
• ה־VialPress מאפשר לכם לבצע סוניקציה במבחנות גדולות יותר
• משרעת הניתנת לכוונון מ־20 עד 100%
• מצב פולסים הניתן לכוונון מ־0 עד 100%
• ניתן לעיקור באוטוקלב

ה־VialTweeter מופעל באמצעות UP200St, מעבד אולטרסוני רב־עוצמה בהספק של 200 ואט. ה־UP200St מצויד בתוכנה חכמה המאפשרת שליטה מדויקת בכל הפרמטרים החשובים של התהליך האולטרסוני, כגון משרעת, זמן סוניקציה, פעימה וטמפרטורה. כך הופך ה־VialTweeter לכלי אמין להשגת תוצאות תהליך מוצלחות הניתנות לשחזור במעבדות ביולוגיות וביוכימיות.
ניתן לכוונן את המשרעת בין 20 ל־100% וכך להתאים את העוצמה האולטרסונית לדגימה שלכם. לדוגמה, גזירה וקיטוע של DNA ו־RNA דורשים משרעת מתונה יותר כדי למנוע יצירת מקטעי DNA קטנים מדי, ואילו הומוגניזציה של רקמת מוח של עכבר דורשת סוניקציה בעוצמה גבוהה. בחרו את המשרעת, עוצמת הסוניקציה ומשכה האידיאליים באמצעות התפריט החכם והאינטואיטיבי במעבד UP200St. ניתן לגשת בקלות לתפריט ולהגדרות ולהפעילם באמצעות צג מגע צבעוני. בהגדרות ניתן לקבוע מראש פרמטרים של סוניקציה, כגון משרעת, פעימה, מצב מחזור, משך הסוניקציה, סך האנרגיה המושקעת וגבולות טמפרטורה. במחקר ובייצור, היכולת לחזור על ניסויים ולקבל את אותן תוצאות בדיקה היא חיונית. משמעות הדבר היא שלתיעוד המדויק של תנאי התהליך ופרוטוקולי הסוניקציה יש חשיבות עליונה. תיעוד הנתונים האוטומטי כותב את כל נתוני הסוניקציה לקובץ CSV בכרטיס SD מובנה, כך שתוכלו לבדוק בקלות ולהשוות בין הרצות סוניקציה שונות. ניתן לגשת בקלות לכל נתוני התהליך האולטרסוני ולשתף אותם כקובץ CSV.
Hielscher Ultrasonics שואפת לספק לכם טכנולוגיה מתקדמת שתקל על עבודת המחקר שלכם ותשפר אותה!