גזירת DNA באמצעות אולטרסאונד

במהלך גזירת DNA ו-RNA, מולקולות DNA ארוכות מפורקות למקטעים קטנים יותר, שלב חיוני בהכנת דגימות לבניית ספריות לריצוף הדור הבא (NGS). גזירת DNA באמצעות אולטרסאונד מנצלת כוחות קוויטציה אקוסטית לפירוק DNA או RNA למקטעים בטווח שבין 100 bp ל-5 kb. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בגודל המקטעים, וכך מקלה על ההתאמה לאורך ה-DNA הרצוי לקבלת תוצאות ריצוף מיטביות.

גזירת DNA באמצעות אולטרסאונד

Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון פתרונות המבוססים על אולטרסאונד לגזירת DNA, RNA וכרומטין. בחרו במכשיר אולטרסוני עם גשוש (למשל UP100H) לסוניקציה ישירה באמצעות קצה זעיר, או השתמשו ב-VialTweeeter או ב-cuphorn האולטרסוני להכנה עקיפה של DNA ממגוון דגימות בו-זמנית. Hielscher מציעה את המכשיר האידיאלי בהתאם לצורכיכם: בין שיש לכם דגימה 1 או עד 10 דגימות, בנפחים ממיקרוליטר ועד ליטרים – מכשירי הסוניקציה של Hielscher יענו על דרישותיכם להכנת מקטעי DNA, RNA וכרומטין באורך המתאים. הדירות, תפעול קל ושליטה מדויקת מאפשרים יצירת ספרייה אמינה לריצוף הדור הבא.
בניגוד לפרגמנטציה אנזימטית של DNA, גזירה אולטרסונית מפעילה כוחות גזירה מכניים בלבד ללא הוספת כימיקלים כלשהם. באמצעות הגדרה מדויקת של פרמטרי התהליך, גזירה אולטרסונית מייצרת מקטעי DNA בעלי משקל מולקולרי גבוה (DNA פלסמידי וגנומי).
ניתן להגביר חומצות גרעין מטוהרות לפני שלב הפרגמנטציה או אחריו.
ניתן לשלוט בבטחה בפרמטרי הסוניקציה (הספק, מחזור פעימות / פרצי פעולה, זמן וטמפרטורה) באמצעות הגדרות התוכנה.

פרוטוקולים לגזירת DNA באמצעות אולטרסאונד

לבדיקת אימונופרסיפיטציה של כרומטין

בקצרה, תאים נזרעו בצלחות בקוטר 60mm (400,000 בכל צלחת) ועברו טרנספקציה עם RhoA siRNA (כמתואר); לאחר 72 h, הם הודגרו עם פורמלדהיד (ריכוז סופי, 1%) במשך 10 min ב-37°C ליצירת קשרי צילוב בין חלבונים ל-DNA. תגובת הצילוב הופסקה באמצעות הוספת עשירית מהנפח של גליצין בריכוז 1.25 mol/L, לקבלת ריכוז סופי של 125 mmol/L. התאים נשטפו פעמיים ב-PBS קר כקרח, הורחפו מחדש בבופר לבדיקת רדיואימונופרסיפיטציה [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] המכיל 1 mmol/L פנילמתילסולפוניל פלואוריד, 1 Ag/mL אפרוטינין ו-1 Ag/mL פפסטטין A, והוחזקו על קרח במשך 30 min. לאחר מכן, תוצרי הליזיס של התאים עברו סוניקציה על קרח באמצעות מכשיר Hielscher UP200S לסוניקציה אולטרסונית (3 x 40 s, אמפליטודה 40%, מחזור 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), עד שהכרומטין המצולב נגזר ליצירת מקטעי DNA בטווח שבין 200 ל-1,000 bp. עשירית מכלל תוצר הליזיס שימשה לכימות כמות ה-DNA הקיימת בדגימות השונות ונחשבה ל-"DNA הקלט הכולל". הנוזלים העליונים הודגרו עם תרחיף 50% של DNA מזרע סלמון/חלבון אגרוז כדי להפחית רקע לא ספציפי. לאחר מכן בוצעה אימונופרסיפיטציה במשך הלילה ב-4°C עם 5 Ag של anti-NF-nB p65 (Upstate) או ללא נוגדן (ביקורת שלילית). לנוזלים עליונים אלה הוסף NaCl בריכוז 5 mol/L, והם חוממו במשך הלילה ב-65°C לביטול קשרי הצילוב בין חלבונים ל-DNA. הקומפלקסים החיסוניים טופלו בהמשך בפרוטאינאז K נטול DNase ו-RNase, וה-DNA טוהר באמצעות מיצוי בפנול/כלורופורם ושיקוע באתנול. PCR בוצע באמצעות תחלים ספציפיים התואמים לרצף באזור הפרומוטר של הגן האנושי iNOS (תחל p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; תחל p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

מחקרי ביטוי של EGFP

למחקרי הביטוי, הזן הרקומביננטי L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, גרמניה), הנושא את הגן ל-EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק מוגבר) המשולב ב-ssu הכרומוזומלי, גודל במצעי הגידול השונים כפי שתואר קודם לכן, בתוספת 100 mg l^-1 של Nourseothricin (Jena Bioscience, גרמניה). במהלך הגידול נלקחו דגימות בנפח 1 ml, סורכזו (2000 × g, 20°C, 10 min) ונשטפו בתמיסת 0.9% NaCl. המשקע הורחף מחדש בבופר (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ופורק באמצעות סוניקציה במעבד האולטרסוני UP400S (הפעלת אנרגיה של ∼ 400 Ws). שברי התאים סולקו באמצעות סרכוז (6000 × g, 4°C, 5 min) ונותחו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד בנוכחות נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE), בתנאים מחזרים לפי שיטת Laemmli (1970), עם ג'לים של פוליאקרילאמיד בריכוז 12.5%. ביטוי EGFP נבדק בתרבית מטולטלת. (Fritsche et al. 2007)

אימונופרסיפיטציה של כרומטין

בדיקת האימונופרסיפיטציה של כרומטין בוצעה באמצעות ChIP-IT^TM Express (Active Motif, קרלסבד, קליפורניה, ארה״ב) בהתאם להוראות היצרן, עם כמה שינויים. בקצרה, פודוציטים אנושיים ממוינים עברו צילוב באמצעות פורמלדהיד בריכוז 1% במשך 10 min בטמפרטורת החדר. התאים נשטפו ב-PBS קר כקרח ותגובת הקיבוע הופסקה באמצעות הוספת גליצין בריכוז 0.125 M למשך 5 min בטמפרטורת החדר. התאים נשטפו שוב ב-PBS קר כקרח וגורדו מהצלחת. התאים שוקעו באמצעות סרכוז והורחפו מחדש בבופר ליזיס. לאחר סרכוז, הגרעינים ששקעו הורחפו מחדש בבופר גזירה, הודגרו על קרח במשך 30 min והכרומטין נגזר באמצעות סוניקציה, למשל באמצעות UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, טלטו, גרמניה) בהספק של 25%, ב-5 פעימות של 20 sec כל אחת על קרח, למקטעים בגודל של כ-200–600 bp. לאחר מכן הכרומטין שנגזר סורכז והנוזל העליון נאסף. לצורך אימונופרסיפיטציה, 60 μl של כרומטין הודגרו עם 1 μg של נוגדנים ל-Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, סנטה קרוז, קליפורניה, ארה״ב), ל-NF-κB p65 (Abcam, קיימברידג', בריטניה) או ל-NF-κB p50 (Abcam), או עם IgG של ארנב (Zymed Laboratories) כביקורת שלילית, למשך הלילה ב-4°C תוך סיבוב עדין. קומפלקסים חיסוניים שנקשרו לחרוזים מגנטיים נאספו באמצעות מעמד מגנטי ונשטפו ביסודיות, וקשרי הצילוב בין החלבון ל-DNA בוטלו וה-DNA הופרד באמצעות אלוציה לצורך אנליזת PCR בזמן אמת. (Ristola et al. 2009)

הכנת DNA של EHEC לאנליזה במערך שבבים

הכנת ליזטים של תאים ו-DNA ממוצה
משקעי חיידקים שהורחפו ב-PBS לריכוז הסופי הרצוי טופלו באמצעות מכשיר לפירוק אולטרסוני UP100H (Hielscher GmbH, גרמניה) המצויד במיקרוטיפ MS1 (בקוטר 1mm). תדר העבודה היה 30 kHz והספק המוצא האפקטיבי היה 100 W. במהלך הפעולה הדגימות קוררו באמבט מי קרח, עורבבו וצונטרפגו. הדגימות שימשו למחקרי ציטומטריית זרימה, ואילו לצורך המשך הטיפול הן עברו טיפול בחום (95°C, 5 min). תוצרי הליזיס הגולמיים של התאים עובדו באמצעות תערובת פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1). נפח שווה של תערובת זו נוסף לדגימת תוצר הליזיס, התמיסה עורבלה בעוצמה במערבל וורטקס במשך 15 s וצונטרפגה ב־15,000 x g במשך 2 min בטמפרטורת החדר (RT), כ־22°C. הפאזה המימית העליונה, שהכילה את ה־DNA הגנומי, הופרדה בזהירות ונאספה במבחנת Eppendorf סטרילית חדשה.
לאחר מכן הדגימות עברו סוניקציה כדי לקטע את ה־DNA. שלב הסוניקציה בוצע באותם התנאים שתוארו לעיל. כדי להעריך את השפעות הקיטוע על ה־DNA הגנומי, הדגימות נותחו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.
(…) הדגימות שעברו קודם לכן סוניקציה במשך 2.5 min עברו שלב מיצוי לאחר טיפול בחום וצנטריפוגה. ה־DNA שהשתחרר מוצה פעמיים באמצעות תערובת פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול, ולאחר מכן עבר סוניקציה שנייה במשך 0 – 15 min. אלקטרופורזה בג'ל אגרוז שימשה לקביעת התפלגות הגדלים של DNA שעבר קיטוע אולטרסוני לאחר המיצוי (איור בצד ימין למעלה). נוכחותו של DNA מקוטע מאוד ניכרה בהופעת מריחת DNA במקום פסים בעלי משקל מולקולרי גבוה, שנעלמו בדגימות שעברו סוניקציה במשך 2.5 min או יותר. סוניקציה ממושכת יותר הפחיתה בהדרגה את אורכי המקטעים לכ־150 – 600 bp, וסוניקציה במשך 15 min פירקה מקטעים אלה עוד יותר, כפי שניתן לראות בעיקר בחלקה העליון של המריחה. לפיכך, הגודל הממוצע של מקטעי ה־DNA פחת בהדרגה עם משך הטיפול האולטרסוני, והטיפול במשך 5 min אפשר לקבל את גדלי מקטעי ה־DNA המתאימים ביותר לבדיקות במערכי שבבים. לבסוף נקבע נוהל הכנת אנליט ה־DNA, הכולל תחילה טיפול אולטרסוני במשך 2 min, מיצוי DNA ‏(2×), ולאחר מכן סוניקציה במשך 5 min. (Basselet et al. 2008)

אימונופרסיפיטציה של כרומטין (ChIP)

תאי HEK293 גודלו כמתואר לעיל וקובעו באמצעות 2 mM דיסוקצינימידיל־גלוטראט במשך 45 min בטמפרטורת החדר. לאחר מכן התאים נשטפו פעמיים ב־PBS. הכרומטין עבר צילוב במשך 10 min בטמפרטורת החדר באמצעות 1% (v/v) פורמלדהיד ונשטף פעמיים ב־PBS קר כקרח. תגובת הצילוב הופסקה באמצעות הדגרה עם גליצין בריכוז סופי של 0.125 M במשך 5 min בטמפרטורת החדר. לאחר הדגרה עם טריפסין, התאים גורדו מצלחת תרבית התאים ונשטפו פעמיים ב־PBS. משקע התאים הורחף מחדש בבופר ליזיס (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, ו־0.5% (v/v) Nonidet P-40), הודגר על קרח במשך 10 min ועבר הומוגניזציה באמצעות הומוגנייזר Dounce. לאחר מכן הגרעינים שוקעו בצנטריפוגה (3500 x g, 5 min, 4 °C) והורחפו מחדש בבופר גרעינים (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, ו־1% (w/v) SDS). הגרעינים פורקו באמצעות סוניקציה בשלושה פולסים בני 20-s באמצעות מכשיר הסוניקציה UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) בהגדרת מחזור של 0.5 ומשרעת של 30%, שהניבו מקטעי DNA גנומי שגודלם העיקרי היה 200 – 1000 bp. לצורך ChIP, כמות של 50g DNA דוללה פי 4 בבופר אימונופרסיפיטציה (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100, ו־0.01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

ניתוח מודיפיקציות של היסטונים באמצעות אימונופרסיפיטציה של כרומטין (ChIP)

בקצרה, 6 x 10⁶ תאים נשטפו פעמיים ב-PBS ועברו צילוב על צלחת התרבית במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בנוכחות 0.5% פורמלדהיד. תגובת הצילוב הופסקה באמצעות הוספת גליצין בריכוז 0.125 M. כל השלבים הבאים בוצעו ב-48°C. כל תמיסות הבופר קוררו מראש והכילו מעכבי פרוטאזות (Complete Mini, Roche). התאים נשטפו פעמיים ב-PBS ולאחר מכן גורדו. המשקעים שנאספו הומסו ב-1 ml בופר ליזיס (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ועברו סוניקציה באמבט אתנול קר במשך 10 מחזורים באמפליטודה של 100% באמצעות מכשיר סוניקציה UP50H (Hielscher, Teltow, גרמניה). פרגמנטציית הכרומטין הודגמה בג'ל אגרוז בריכוז 1%. המקטעים שהתקבלו היו בטווח 200–500pb. כרומטין מסיס התקבל באמצעות צנטריפוגה של הדגימות שעברו סוניקציה ב-14,000g במשך 10 דקות ב-48°C. המקטע המסיס דולל ביחס 1/10 בבופר דילול (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), ולאחר מכן חולק למנות ואוחסן ב-80°C עד לשימוש. (Rodriguez et al. 2008)