גזירת DNA אולטראסונית

במהלך גזירת דנ"א ורנ"א, מולקולות דנ"א ארוכות מתפצלות לחתיכות קטנות יותר, צעד מכריע בהכנת דגימות לבניית ספריית ריצוף מהדור הבא (NGS). גזירת DNA על-קולית משתמשת בכוחות קוויטציה אקוסטיים כדי לפרק DNA או RNA למקטעים הנעים בין 100 bp ל -5 kb. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בגודל המקטע, ומאפשרת התאמה אישית לאורך הדנ"א הרצוי לקבלת תוצאות ריצוף אופטימליות.

גזירת DNA באמצעות אולטרסאונד

Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים מבוססי אולטרסאונד עבור DNA, RNA וחיתוך כרומטין. בחר בין אולטרסאונד מסוג בדיקה (למשל UP100H) עבור סוניקציה ישירה באמצעות microtip, או להשתמש VialTweeeter או cuphorn קולי להכנת DNA עקיף של דגימות שונות בו זמנית. Hielscher מציעה את המכשיר האידיאלי בהתחשב בצרכים שלך: אם יש לך 1 או עד 10 דגימות, כרכים מ microliter לליטר כרכים – Hielscher sonicators יעמוד בדרישות שלך כדי להכין DNA, RNA וקטעי כרומטין באורך הנכון. יכולת השחזור, התפעול הקל והשליטה המדויקת מאפשרים ספרייה אמינה לריצוף של הדור הבא.
בניגוד לפיצול DNA אנזימטי, גזירה על-קולית מפעילה כוחות גזירה מכניים טהורים מבלי להוסיף כימיקלים. על ידי הגדרה מדויקת של פרמטרים בתהליך, גזירה קולית מייצרת מקטעי DNA בעלי משקל מולקולרי גבוה (פלסמיד ו- DNA גנומי).
ניתן להגביר חומצות גרעין מטוהרות לפני או אחרי שלב הפיצול.
ניתן לשלוט בבטחה בפרמטרי סוניקציה (הספק, מחזור דופק / התפרצויות, זמן וטמפרטורה) באמצעות הגדרות תוכנה.

פרוטוקולים לחיתוך DNA אולטרסוני

עבור Chromatin Immunoprecipitation Assay

בקצרה, התאים צופו בצלחות בקוטר 60 מ"מ (400,000 למנה) והודבקו ב-RhoA siRNA (כמתואר); לאחר 72 שעות, הם הודגרו עם פורמלדהיד (ריכוז סופי, 1%) במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להצליב חלבונים לדנ"א. תגובת הקישור צולב רוותה על ידי תוספת של עשירית נפח של 1.25 mol/L גליצין, מה שנתן ריכוז סופי של 125 mmol / L. התאים נשטפו פעמיים עם PBS קר כקרח, הושעו מחדש במאגר בדיקת משקעים רדיואימוניים [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0)] המכיל 1 mmol / L phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 Ag / mL aprotinin, ו 1 Ag / mL pepstatin A, ונשמר על קרח במשך 30 דקות. לאחר מכן, ליזטים של תאים הושרו על קרח עם Hielscher UP200S אולטרסאונד סוניקטור (3 x 40 שניות, משרעת 40%, מחזור 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) עד לחיתוך כרומטינים צולבים כדי להניב מקטעי DNA בין 200 ל -1,000 bp. עשירית מליזט שלם שימשה לכימות כמות הדנ"א הקיימת בדגימות שונות ונחשבה כ “סה"כ קלט DNA”. סופרנאטנטים הודגרו עם DNA של זרע סלמון / חלבון אגרוז - 50% slurry כדי להפחית רקע לא ספציפי. לאחר מכן המשקעים החיסוניים נעשו במהלך הלילה ב-4°C עם 5 Ag של anti-NF-nB p65 (Upstate) או ללא נוגדן (בקרה שלילית). סופרנאטנטים אלה קיבלו תוספת של 5mol/L NaCl וחוממו במשך הלילה בטמפרטורה של 65°C כדי להחזיר את הקשרים הצולבים חלבון-DNA. האימונוקומפלקסים טופלו גם בפרוטאינאז K נטול DNase ו-RNase, והדנ"א טוהר על ידי מיצוי פנול/כלורופורם ומשקעים אתנוליים. PCR נעשה עם פריימרים ספציפיים המתאימים לרצף באזור המקדם של הגן iNOS האנושי (פריימר p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; פריימר p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

מחקרי ביטוי EGFP

לצורך מחקרי הבעה, הזן הרקומביננטי L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, גרמניה) עם הגן ל-EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר), משולב כרומוזומלי ssu, טופח במדיות השונות כמתואר קודם ובנוסף בתוספת 100 מ"ג ליטר^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, גרמניה). במהלך הגידול, נלקחו דגימות של 1 מ"ל, צנטריפוגות (2000 × גרם, 20 מעלות צלזיוס, 10 דקות) ונשטפו בתמיסת NaCl 0.9%. הגלולה הושעתה מחדש בחיץ (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) והתפוררה על ידי סונפיקציה עם המעבד העל-קולי UP400S (יישום אנרגיה ∼ 400 Ws). פסולת התאים הוסרה על ידי צנטריפוגה (6000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות) ונותחה על ידי נתרן דודציל סולפט – אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) בתנאי חיזור על פי שיטת Laemmli (1970) עם 12.5% ג'ל פוליאקרלמיד. ביטוי EGFP נבדק בתרבות נסערת. (Fritsche et al. 2007)

כרומטין משקעים חיסוניים

בדיקת המשקעים החיסוניים של הכרומטין בוצעה באמצעות ChIP-IT^TM אקספרס (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) בהתאם להוראות היצרן עם כמה שינויים. בקצרה, פודוציטים אנושיים מובחנים הוצלבו עם פורמלדהיד 1% במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. התאים נשטפו ב-PBS קר כקרח ותגובת הקיבוע נעצרה על ידי הוספת 0.125 מ' גליצין למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. התאים נשטפו שוב עם PBS קר כקרח וגרדו מהצלחת. התאים נפלטו על ידי צנטריפוגה והושעו מחדש בחיץ הליזיס. לאחר הצנטריפוגה, גרעיני הכדוריות הושעו מחדש בחיץ הגזירה, הודגרו על קרח במשך 30 דקות והכרומטין נחתך על ידי סוניקציה, למשל. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, גרמניה) בעוצמה של 25% 5 פולסים של 20 שניות כל אחד על קרח לרסיסים של כ 200-600 bp. הכרומטין הגזור עבר אז צנטריפוגה והסופרנאטנט נאסף. עבור משקעים חיסוניים, 60 μl של כרומטין הודגר עם 1 מיקרוגרם של Sp1 (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניה, ארה"ב), NF-κB p65 (Abcam, קיימברידג ', בריטניה) או NF-κB p50 (Abcam) נוגדנים או עם ארנב IgG (מעבדות Zymed), כביקורת שלילית, לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. אימונוקומפלקסים הקשורים לחרוזים מגנטיים נאספו באמצעות מעמד מגנטי, נשטפו בהרחבה, והצלבות החלבון/דנ"א התהפכו והדנ"א דולל לצורך ניתוח PCR בזמן אמת. (Ristola et al. 2009)

הכנת DNA של EHEC לניתוח מערך שבבים

סידור של ליזטים של תאים ו- DNA שחולץ
כדוריות חיידקיות המרחפות ב-PBS לריכוז הסופי הרצוי טופלו ב משבש אולטרסאונד UP100H (Hielscher GmbH, גרמניה) מצויד microtip MS1 (1mm קוטר). תדר ההפעלה היה 30 קילוהרץ והספק היציאה האפקטיבי היה 100 W. במהלך המבצע התקררו הדגימות באמבט מי קרח, מעורבבות וצנטריפוגות. הדגימות שימשו למחקרי ציטומטריית זרימה, ואילו לטיפול מאוחר יותר, הדגימות היו נתונות לטיפול בחום (95 מעלות צלזיוס, 5 דקות). הליזטים הגולמיים עובדו עם תערובת של פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1). נפח שווה של תערובת זו נוסף לדגימת הליזט, התמיסה עוררה במרץ במשך 15 שניות וצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT) סביב 22 מעלות צלזיוס. השלב המימי העליון המכיל את הדנ"א הגנומי הופרד בקפידה ונאסף בצינור אפנדורף סטרילי חדש.
לאחר מכן, דגימות סונקו כדי לפצל את הדנ"א. שלב הסוניקציה מומש באותם תנאים שתוארו לעיל. כדי להעריך את השפעות הפיצול על הדנ"א הגנומי, דגימות נותחו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
(…הדגימות שהוסטו קודם לכן במשך 2.5 דקות היו נתונות לשלב מיצוי לאחר טיפול בחום וצנטריפוגה. DNA ששוחרר הופק פעמיים עם תערובת אלכוהול פנול:כלורופורם:איזואמיל, ולאחר מכן עבר סוניקציה שנייה במשך 0 – 15 דקות. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז שימשה לקביעת התפלגות הגודל של DNA שהיה נתון לפיצול על-קולי לאחר מיצוי (איור בצד ימין למעלה). דנ"א מקוטע מאוד ניכר מנוכחות של כתם דנ"א ולא רצועות בעלות משקל מולקולרי גבוה שסולקו מדגימות שהונעו במשך 2.5 דקות או יותר. סוניקציה ארוכה יותר הפחיתה בהדרגה את אורכי השברים לכ-150-600 bp, וסוניקציה למשך 15 דקות פגעה עוד יותר בשברים אלה, כפי שניתן לראות בעיקר בחלק העליון של המריחה. לפיכך, גודל מקטע ה- DNA הממוצע ירד בהדרגה עם זמן האולטרה-סוניקציה והטיפול בן 5 הדקות איפשר להשיג את הגדלים של מקטעי DNA המתאימים ביותר לבדיקות מערך שבבים. לבסוף, נקבע הליך הכנת ניתוח DNA הכולל 2 דקות ראשונות של טיפול קולי, מיצוי DNA (2×), ולאחר מכן 5 דקות סוניקציה. (Basselet et al. 2008)

כרומטין משקעים חיסוניים (ChIP)

תאי HEK293 גודלו בתרבית כמתואר לעיל ותוקנו עם 2 mM disuccinimidyl-glutarate למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, התאים נשטפו פעמיים עם PBS. הכרומטין הוצלב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות פורמלדהיד 1% (v/v) ונשטף פעמיים עם PBS קר כקרח. תגובת הקישור הצולבת נעצרה על ידי דגירה עם גליצין בריכוז סופי של 0.125 מ 'למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה עם טריפסין, התאים נשרטו מצלחת תרבית התאים ונשטפו פעמיים עם PBS. גלולת התא הושעתה מחדש בחיץ ליזיס (צינורות 5 mM, pH 8.0, 85 mM KCl ו-0.5% (v/v) Nonidet P-40), הודגרה על קרח במשך 10 דקות, והומוגנית עם הומוגנייזר Dounce. לאחר מכן, גרעינים נפלטו על ידי צנטריפוגה (3500 x גרם, 5 דקות, 4 ° C) והושעו מחדש בחיץ גרעינים (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA, ו 1% (w / v) SDS). גרעינים הופרעו על ידי סוניקציה עם שלוש פעימות של 20 שניות ב UP50H סוניקטור (Hielscher Ultraschall Technologie) בהגדרה של מחזור 0.5 ומשרעת 30%, המניב מקטעי DNA גנומיים בגודל תפזורת של 200 – 1000 bp. עבור ChIP, 50 גרם של DNA דוללו פי 4 במאגר משקעים חיסוניים (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100, ו-0.01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

ניתוח שינוי היסטון על ידי משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

בקצרה, 6 x 10⁶ התאים נשטפו פעמיים עם PBS והוצלבו על צלחת התרבית במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בנוכחות 0.5% פורמלדהיד. תגובת קישור צולב נעצרה על ידי הוספת 0.125 M גליצין. כל השלבים הבאים בוצעו בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס. כל החוצצים היו מקוררים מראש והכילו מעכבי פרוטאז (Complete Mini, Roche). התאים נשטפו פעמיים עם PBS ולאחר מכן נשרטו. הכדוריות שנאספו הומסו במאגר ליזה של 1 מ"ל (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) והושרו באמבט אתנול קר במשך 10 מחזורים באמפליטודה של 100% באמצעות UP50H סוניקטור (היילשר, טלטוב, גרמניה). פיצול כרומטין הודגם בג'ל אגרוז 1%. השברים שהתקבלו היו בטווח של 200–500pb. כרומטין מסיס הושג על ידי צנטריפוגה של הדגימות הסוניק ב-14,000 גרם למשך 10 דקות ב-48 מעלות צלזיוס. החלק המסיס דולל 1/10 במאגר דילול (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) ולאחר מכן דולל ואוחסן ב-80°C עד לשימוש. (רודריגז ואחרים 2008)