היגישר טכנולוגיית אולטרה סאונד

Ultrasonic DNA גזיזה

  • במהלך גז DNA ו- RNA, מולקולות ה- DNA שבורות לחתיכות קטנות יותר. פיצול ה- DNA / RNA הוא אחד הצעדים הכנים מדגם החשוב נדרשו ליצור ספריות עבור סידור הדור הבא (NGS).
  • גז DNA אולטרסאונד משתמש כוחות cavitation אקוסטי לשבור את ה- DNA או RNA לחתיכות של 100 – BP 5KB.
  • גז Ultrasonic מאפשר פיצול ה- DNA מדויק התאמת אורך ה- DNA הרצוי.

Ultrasonic DNA גזיזה

Hielscher אולטרסוניקה מציעה פתרונות אולטרסאונד שונים המבוסס על DNA, RNA ו גז הכרומטין. תוכלו לבחור בין ultrasonicators-סוג בדיקה (לדוגמה UP100H) עבור sonication ישירה באמצעות microtip, או להשתמש VialTweeeter או cuphorn קולי להכנת דנ"א עקיפה של דגימות שונות בו זמנית. Hielscher מציעה את המכשיר אידיאלי בהתחשב בצרכים שלך: מזג האוויר יש לך 1 או עד 10 דגימות, כרכים מ מיקרוליטר ל כרכים ליטר – מעבדי קולי Hielscher זמינים כדי לענות על הדרישות שלך להכין DNA, RNA ושברי הכרומטין ב באורך הנכון. שחזור, הפעלה קלה שליטה מדויקת לאפשר ספרייה אמינה עבור סידור הדור הבא.
בניגוד פיצול ה- DNA אנזימטי, מריחה קולית חלה כוחות גזירה מכאניים טהורים ללא תוספת כימיקלים. לפי ההגדרה המדויקת של פרמטרי תהליך, מריחה קולית מייצרת שברי DNA משקל מולקולריים גבוהים (פלסמיד דנ"א גנומי).
חומצות גרעין מטוהרים יכולות להיות מוגברות לפני או אחרי צעד פיצול.
פרמטרי Sonication (כוח, מחזור דופק / התפרצויות, זמן וטמפרטורה) ניתן לשלוט בבטחה דרך הגדרות תוכנה.

יתרונות:

  • שליטה מדויקת
  • מחזורי sonication וזמן הסתגלות בדיוק לגודל רצוי DNA
  • שברי DNA משקל מולקולרי גבוה
  • בקרת טמפרטורה
  • מָהִיר
  • תוצאות לשחזור
  • autoclavable
  • פתרונות שונים: Probe-סוג, VialTweeter ו קופלוקס

פרוטוקולים עבור אולטרסאונד DNA גזיזה

עבור הכרומטין immunoprecipitation Assay

בקצרה, התאים היו מצופה ב 60 מ"מ קוטר מנות (400,000 לכל צלחת) ו transfected עם RhoA siRNA (כמתואר); לאחר 72 שעות, הם הודגרו עם פורמלדהיד (ריכוז סופי, 1%) במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס כדי לחצות חלבונים לדנ"א. התגובה המקושרת היתה מרווה על ידי תוספת של עשירית נפח של 1.25 mol / L גליצין, מתן 125 mmol / L ריכוז סופי. תאים שטפו פעמיים עם PBS קר כקרח, resuspended במאגר assay radioimmopopopipitation [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 )] המכיל 1 mmol / L phenylmethylsulfonyl פלואוריד, 1 Ag / mL aprotinin, ו 1 Ag / ml pepstatin A, והמשיך על קרח במשך 30 דקות. ואז, lysates התא היו sonicated על קרח עם הירושר UP200S sonicator אולטרסאונד (3 x 40 s, משרעת 40%, מחזור 1; Hielscher אולטרסוניקה GmbH) עד chromatins הצולב היו טעונים להניב שברי DNA בין 200 ו 1000 BP. עשירית כולו lysate שמש לכמת את הכמות הנוכחית DNA בדגימות שונות נחשב “דנ"א קלט הכולל”. Supernatants הודגרו עם תרחיף סלמון זרע DNA / חלבון agarose-50% להפחתת רקע ספציפי. Immunoprecipitation אז נעשה לילה בשעה 4 ° C עם 5 Ag של p65 אנטי-NF-NB (רחוק מהכרך) או בלי נוגדן (שליטה שלילי). supernatants אלה נוספו עם 5 mol / L NaCl ו מחומם לילה בשעה 65 ° C לחזור צולבות קישורים חלבון-דנ"א. Immunocomplexes טופלו נוספת עם DNase- ו RNase ללא proteinase K, ו DNA היה מטוהר על ידי מיצוי פנול / כלורופורם משקעים אתנול. PCR נעשה עם פריימרים ספציפיים המתאימים לרצף בתוך אזור האמרגן של גן האינוס האנושי (פריימר P1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; יחל P2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

מחקרים EGFP ביטוי

עבור מחקרים הביטוי, P10 tarentolae רקומביננטי זן L. :: F9Begfp1.4dBsat 12 # (ביוסיינס Jena, גרמניה) עם הגן EGFP (Enhanced חלבון פלואורסצנטי ירוק), כרומוזומליות Ssu משולבת, טופח באמצעי המדיה השונים כפי שתואר לעיל ו בנוסף בתוספת 100 מ"ג L. אני לא מבין (ביוסיינס Jena, גרמניה) Nourseothricin. במהלך הטיפוח, 1 מ"ל דגימות נלקחו, centrifuged (ז × 2000, 20 ° C, 10 דקות) ורחץ עם פתרון 0.9% NaCl. גלולה היה resuspended במאגר (20 HEPES מ"מ, 5 EDTA מ"מ, 2 מ"מ DTT) והתפרקו ידי sonification עם מעבד קולי UP400S (יישום של אנרגיה ~ 400 Ws). פסולת התא הוסרו על ידי צנטריפוגה (ז × 6000, 4 ° C, 5 דק ') ונותחו על ידי סולפט dodecyl נתרן - ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (SDS-PAGE) בתנאים צמצום לפי שיטת Laemmli (1970) עם 12.5% ​​polyacralamide ג'ל . EGFP הביטוי נבדק בתרבות הנסערת. (ואח Fritsche. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Electrophoretic מנתח של הדנ"א הגנומי של E. coli EDL933 נתון 0 - 15 דק 'ultrasonication. L מציין את סולם DNA. (ואח Basselet. 2008)

בקשת מידע





immunoprecipitation הכרומטין

UP100H המשבש תא הקולי (100W) עבור תמס, שיבוש תא גז DNA.את assay immunoprecipitation הכרומטין בוצע באמצעות שבב ה- ITTM אקספרס (מוטיב פעיל, בקרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) על פי הוראות היצרן עם כמה שינויים. בקצרה, podocytes האנושי הבדיל היו צולבים עם פורמלדהיד 1% עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. תאים נשטפו עם PBS קר כקרח ותגובת הקיבוע הופסקה על ידי הוספת 0.125 מ 'גליצין עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר. תאים נשטפו שוב עם קרים כקרח PBS וגרדו מהצלחת. התאים היו pelleted ידי צנטריפוגה והשעיה במאגר תמוגה. לאחר צנטריפוגה, גרעינים pelleted היו resuspended במאגר הגז, וטופחו על קרח למשך 30 דקות ו הכרומטין היה טעון על ידי sonication, למשל: מעלהay (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, גרמניה) ב 25% כוח 5 פעימות של 20 שניות על כל קרח לתוך שברי של כ 200-600 bp. הכרומטין הגזוז היה אז centrifuged ו supernatant נאסף. עבור immunoprecipitations, 60 μl של הכרומטין הודגר עם 1 מיקרוגרם של SP1 (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניה, ארה"ב), NF-κB p65 (Abcam, קיימברידג ', בריטניה) או NF-κB p50 (Abcam) נוגדנים או עם ארנב IgG (Zymed מעבדות, דרום סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב), כביקורת שלילית, לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. Immunocomplexes קשורה חרוזים מגנטיים נאספו באמצעות מעמד מגנטי, שטף בהרחבה, ואת החלבון / קישורים דנ"א היו הפוך ו- DNA eluted לניתוח בזמן אמת PCR. (Ristola et al. 2009)

הכנת DNA EHEC לניתוח מערך שבבים

סדר של lysates תא DNAs שחולץ
כדורי בקטריאלי מושעה ב PBS לריכוז הסופי הרצוי טופלו UP100H המשבש אולטרסאונד (Hielscher GmbH, גרמניה) מצויד microtip MS1 (1 מ"מ קוטר). תדר ההפעלה היה 30 קילוהרץ וכוח המוצא האפקטיבי היה 100 W. במהלך הניתוח, דגימות התקררו באמבט של מי קרח, מעורבים ו צנטריפוגדים. הדגימות נוצלו עבור מחקרים cytometry זרימה, ואילו לטיפול מאוחר יותר, דגימות היו נתון לטיפול בחום (95 מעלות צלזיוס, 5 דקות). Lysates התא הגולמי עובדו עם תערובת של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1). נפח שווה של תערובת זו נוספה מדגם lysate, הפתרון היה vortexed במרץ עבור 15 ו centrifuged ב XG 15,000 במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT) סביב 22 מעלות צלזיוס. השלב המימי העליון המכיל את הדנ"א הגנומי הופרד בקפידה ואסף בצינור Eppendorf סטרילית חדשה.
לאחר מכן, דגימות היו sonicated לשבור את ה- DNA. הצעד Sonication התממש באותם תנאים כפי שתואר לעיל. כדי להעריך את ההשפעות הפיצול על הדנ"א הגנומי, דגימות נותחו באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל.
(…) דגימות sonicated בעבר במשך 2.5 דקות היו כפופים שלב החילוץ לאחר טיפול בחום צנטריפוגה. DNA שוחרר חולץ פעמיים עם פנול: כלורופורם: תערובת אלכוהול isoamyl, ולאחר מכן נתון sonication השני 0 - 15 דקות. Agarose ג'ל אלקטרופורזה שימש כדי לקבוע את התפלגות גודל של הדנ"א נתון הפיצול שלאחר הפיצוץ קולי (איור בצד ימין למעלה). דנ"א מקוטע ניכר ניכרה בנוכחות של כתם דנ"א ולא בהרכב משקל מולקולרי גבוה, אשר בוטלו מדגימות שנערכו במשך 2.5 דקות או יותר. Sonication ארוכה בהדרגה מופחת אורכי שבר כ 150-1600 bp, ו sonication במשך 15 דקות עוד השפלה אלה שברי, כפי שניתן לראות בעיקר על ידי החלק העליון של המריחה. לפיכך, גודל קטע הדנ"א הממוצע ירד בהדרגה עם הזמן ultrasonication ואת הטיפול 5 דקות מותר לקבל את הגדלים של שברי DNA המתאימים ביותר עבור מבחנים שבב מערך. לבסוף, ההליך אנליזה DNA אנליזה הכוללת הראשון 2 דקות של טיפול קולי, מיצוי דנ"א (2 ×), ו sonication 5 דקות לאחר מכן, הוקמה. (Basselet et al 2008)

הכרומטין immunoprecipitation (שבב)

אולטראסאונד מעבד UP100H עבור DNA, RNA ו כרומטין הגז. (לחצו להגדלה!)HEK293 תאים היו מתורבת כמתואר לעיל קבוע עם 2 mM disuccinimidyl-glutarate במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, התאים נשטפו פעמיים עם PBS. הכרומטין היה צולבות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות 1% (V / V) פורמלדהיד ושטף פעמיים עם PBS קר כקרח. התגובה המקושרת נעצרה על ידי הדגירה עם גליצין בריכוז סופי של 0.125 M במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה עם טריפסין, התאים היו שרטה מן התרבות בתרבית התא שטף פעמיים עם PBS. גלולה התא היה resuspended במאגר תמוגה (5 מ"מ צינורות, pH 8.0, 85 מ"מ KCl, ו 0.5% (v / v) Nonidet P-40), מודגרות על קרח במשך 10 דקות, ו homogenized עם homogenizer Dounce. לאחר מכן, גרעינים היו pelleted על ידי צנטריפוגה (3500 xG, 5 דקות, 4 ° C) resuspended במאגר גרעיני (50 מ"מ טריס HCl, pH 8.1, 10 מ"מ EDTA, ו 1% (w / v) SDS). גרעינים הופרעו על ידי סוניקציה עם שלוש פעימות של 20 שניות UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) בכל הגדרה של מחזור 0.5 ואת משרעת 30%, מניב שברי DNA הגנומי עם גודל עיקר 200 - BP 1000. עבור שבב, 50g של DNA דוללה 4-פי במאגר immunoprecipitation (16.7 מ"מ טריס-HCl, pH 8.1, 167 מ"מ NaCl, 1.2 מ"מ EDTA, 1.1% (v / v) טריטון X-100, ו 0.01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

היסטון ניתוח שינוי על ידי immunoprecipitation הכרומטין (שבב)

בקצרה, 6 x 106 תאים נשטפו פעמיים עם PBS ו cross-linked על צלחת תרבות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בנוכחות של 0.5% פורמלדהיד. תגובה מקושרת נעצרה על ידי הוספת 0.125 M גליצין. כל הצעדים הבאים בוצעו על 48 מעלות צלזיוס. כל המאגרים היו מראש מעוכבים פרוטאז מצונן הכלול (השלם מיני, Roche). תאים נשטפו פעמיים עם PBS ולאחר מכן גירד. כדורי שנאספו היו מומס חיץ 1 מ"ל תמוגה (1% SDS, 5 מ"מ EDTA, 50 מ"מ טריס pH 8) ו היו sonicated באמבטיה אתנול קר במשך 10 מחזורים ב משרעת 100% באמצעות UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, גרמניה). פיצול הכרומטין היה דמיין ב 1% ג'ל agarose. שברים שהושגו היו בטווח 200-500pb. הכרומטין מסיס הושג על ידי צנטריפוגה דגימות sonicated ב 14,000g עבור 10 דקות ב 48 מעלות צלזיוס. השבר מסיס דוללה 1/10 במאגר דילול (1% Triton X-100, 2 EDTA מ"מ, 20 מ"מ טריס pH 8, 150 מ"מ NaCl) אז aliquoted ומאוחסנים ב 80 ° C עד השימוש. (רודריגז ואח '. 2008)

התקן כוח [W] סוּג נפח [מ"ל]
VialTweeter 200 עצמאי 00.5 1.5
UP50H 50 כף יד או standmounted 00.01 250
מעלהay 100 כף יד או standmounted 00.01 500
Uf200 ः t 200 כף יד או standmounted 00.1 1000
בית Seating 200 מתקן סטנדרטי 00.1 1000
UP400St 400 מתקן סטנדרטי 5.0 2000
קופלוקס 200 בעלי כיתה, סונריאקטור 10 200
GDmini2 200 זיהום ללא תזרים תאים

בקשת מידע





Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter עבור הכנת מדגם קולית

תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!

בקש מידע נוסף

אנא השתמש בטופס להלן, אם אתה רוצה לבקש מידע נוסף על homogenization קולי. נשמח להציע לך מערכת קולי הפגישה הדרישות שלך.









הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.


ספרות / הפניות

  • Basselet פ, וגדין G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): עיבוד המדגם עבור ניתוח מבוסס-מערך השבבים DNA של Escherichia coli enterohemorrhagic (EHEC). מפעלי Cell חידקי 07:29. 2008.
  • . Doublier ס, Riganti Ch, Voena ג, Costamagna ג, Aldieri E., Pescarmona ג, ד Ghigo, Bosia א (008): RhoA השתקת מחזירה את ההתנגדות לדוקסורוביצין ב תאים סרטניים אנושיים קולון. מולקולרית לחקר הסרטן 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund א, אולסן M., Börjesson ט, Spliid NHH, Simonsson M. (2008): הערכה שיטת החילוץ Fusarium דנ"א קורי וחיטה עבור מטה-זרם בזמן אמת PCR כימות קורלציה לרמות mycotoxin . Journal of שיטות מיקרוביולוגיות 2008.
  • Fritsche ג, Sitz M., ווילנד נ, ברייטלינג ר, פוהל H.-D. (2007): אפיון של התנהגות הצמיחה של tarentolae שושנת יריחו - מערכת ביטוי חדש עבור חלבונים רקומביננטיים. Journal of Basic 47 למיקרוביולוגיה, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen ס, סלים מ א, מתיסון פ וו, וולשית G. I., להטונן ס, Holthöfer H. (2009): תקנה של Neph3 גנים podocytes - תפקידי מפתח של שעתוק גורמי NF-κB ו SP1. ביולוגיה מולקולרית BMC 10:83, 2009.
  • רודריגז ג'יי, ויווס L., Jorda M., מוראלס ג, מוניוס M., ונדרל א, א Peinado M. (2008): הגנום כולו מעקב של unmethylated DNA Alu חוזר בתאים נורמליים וסרטן. חומצות גרעין מחקר כרך. 36, מס '3, 2008. 770-784.
  • Weiske ג'יי הובר O. (2006): חלבון Triad היסטידין Hint1 מפעיל אפופטוזיס העצמאי של הפעילות האנזימטית שלו. The Journal of Biological Chemistry. כרך. 281, מס '37, 2006. 27,356-27,366.


עובדות שראוי לדעת

cavitation Ultrasonic / אקוסטי יוצר כוחות אינטנסיביים מאוד שמקדמים גיבוש תהליכי משקעים (לחץ להגדלה!)

גז DNA אולטרסאונד מבוסס על cavitation אקוסטי וכוחות הגזירה הידרודינמית שלה