אולטראסוניזציה היא טכניקה אמינה לפיצול דנ"א פלסמידי. משרעת הניתנת לשליטה מדויקת, מצב פעימה ובקרת טמפרטורה הם התכונות החשובות ביותר של קוליקטור לפיצול פלסמידים שאינו מזיק. בנוסף, השימוש בסוכנים מסוימים מסייע להגן מפני השפלת פלסמיד. Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים לפיצול פלסמיד מבוקר מבקבוקונים בודדים, בו זמנית סוניקציה של דגימות רבות כמו גם לוחות מרובי בארות. למידע נוסף על פיצול פלסמיד על-קולי מוצלח!

גזירה של פלסמיד באמצעות אולטראסוניקה

כאשר דגימות דנ"א נתונות לגלים על-קוליים, התנודות האולטרה-סוניות הנוצרות יוצרות קוויטציה אקוסטית בנוזל שגוזזת או שוברת מולקולות דנ"א בעלות משקל מולקולרי גבוה באמצעות כוחות מכניים. סוניקציה היא השיטה הנפוצה ביותר לניסויים בגזירת דנ"א בתפזורת, כולל יישומים, כגון Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), שעבורם גדלי שברים קטנים הם חיוניים לחלוטין להשגת רזולוציה גבוהה. (ראה: Tseng et al., 2012)
דנ"א פלסמידי (pDNA) הוא צורה ספציפית של דנ"א, המאופיין בצורת הטבעת שלו ונמצא בחיידקים ובכמה אאוקריוטים.
pDNA על-קולי הוא הצורה הרצויה של דנ"א פלסמידי מכיוון שהוא מראה את התוצאות הטובות ביותר בתהליכים במורד הזרם כגון ריצוף אוטומטי וטרנספקציה. אולטרה-סוניקציה מתאימה לפיצול pDNA, כולל pDNA עם קולר-על, בהצלחה.
Thompson et al. (2008) הראו כי סוניקציה של פלסמיד, הידועה כמקטעת דנ"א על-קולי, היא דרך יעילה לשפר את אורכי הקריאה של הרצף phred20 עד כדי כך שהם אינם שונים באופן משמעותי מתבנית הבקרה של בקמן קולטר או מפלסמידים ליניאריים אנזימטיים.

שימוש בווקטורים של פלסמיד

פלסמידים משמשים לעתים קרובות ככלים לשיבוט, העברה ומניפולציה של גנים. כאשר פלסמידים משמשים באופן ניסיוני למטרות אלה, הם נקראים וקטורים. ניתן להחדיר מקטעי דנ"א או גנים לווקטור פלסמיד, וליצור מה שמכונה פלסמיד רקומביננטי. וקטורים של פלסמיד משמשים ככלי להנעת דנ"א רקומביננטי לתוך תא מארח והם מרכיב מרכזי בשיבוט מולקולרי.
“וקטורים לא ויראליים נחקרים בהרחבה על השימוש הפוטנציאלי שלהם בריפוי גנטי לטיפול במחלות מסובכות שונות. וקטורים שאינם נגיפיים מגנים על דנ"א פלסמידי מפני השפלה פיזיקלית, כימית ואנזימטית ומעבירים את מולקולת הדנ"א לאתר המטרה. לדוגמה, ליפוזומים קטיוניים, צ'יטוזן וננו-חלקיקים אחרים הטעונים חיובית יוצרים קומפלקסים עם דנ"א פלסמידי באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות. עם זאת, הליפוזומים הקטיוניים/קומפלקסי הדנ"א הפלסמידיים הנוצרים בקלות הם גדולים יחסית (כלומר, 300-400 ננומטר) והטרוגניים באופיים, מה שמקשה על השימוש בהם ביישומים פרמצבטיים. ניתן לצמצם את קומפלקסי הדנ"א/ליפוזומים הגדולים וההטרוגניים של הפלסמידים, פלסמיד DNA/אירוסולים וקומפלקסים של פלסמיד DNA/פפטידים לקטנים יותר, ולחלקיקים הומוגניים באמצעות אולטרה-סוניזציה.” (Sarker et al., 2019)
דוגמה בולטת לשימוש בווקטורים של פלסמיד היא CRISPR–Cas9. מערכת הקריספר-Cas9 מועברת בדרך כלל לתאים כפלסמיד יחיד גדול או כמספר פלסמידים קטנים יותר המקודדים רצף מטרה, מדריך קריספר ו-Cas9.

הכנה קולית של ננו-חלקיקי PLGA טעונים בדנ"א על ידי ננו-ארכיטקטורה

Jo et al. (2020) השתמשו בחומצה פולית(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) על מנת ליצור נשא ננו-חלקיקי להעברת מודל של פלסמיד CRISPR-Cas9 למקרופאג'ים שמקורם במח עצם ראשוני. עבור ננו-ארכיטקטורה של ננו-חלקיקי PLGA, נעשה שימוש ב-PLGA עם שתי קבוצות קצה שונות (קבוצות אסטר ואמין) במטרה שכובעי הקצה של האמין הטעונים חיובית יגבירו את יעילות האנקפסולציה ואת העומס בשל אינטראקציות המטען בינו לבין עמוד השדרה הטעון שלילית של הדנ"א. בצינור צנטריפוגה חרוטי פוליפרופילן של 50 מ"ל, 100 מ"ג פלורוני F127 הומס במים DI אוטוקלביים של 20 מ"ל על ידי ערבוב מערבולת ואחריו 30 דקות של סוניקציה עדינה באמצעות אמבטיה קולית (ראה קופהורן). מוט ערבוב מגנטי אוטוקלאב נוסף והתמיסה הייתה מעורבבת ב-600 סל"ד למשך 30 דקות בזמן שהפתרונות האחרים יוצרו. כלי מעבדה מפלסטיק שימשו במקום כלי זכוכית לכל אורכו כדי למזער את הספיחה הלא ספציפית של הדנ"א. תמיסות של PLGA המומסות ב-DMF (44.48 מ"ג/מ"ל) ו-TIPS פנטקן המומס ב-THF (0.667 מ"ג/מ"ל) יוצרו בנפרד. ה-PLGA הושאר רטוב ב-DMF במשך 30 דקות לפני שהוטבע במשך 30 דקות (לפרוטוקול מלא ראו Jo et al., 2020)

הגנת דנ"א של פלסמיד במהלך סוניקציה

דנ"א הכולל פלסמידים ופלסמידים על-קוליים הם השפלה רגישה ביותר. כל שיטות הפיצול הזמינות ידועות בחסרונות מסוימים. פיצול דנ"א על-קולי הוא אחת השיטות המועדפות, שכן סוניקציה מבוקרת בשילוב עם אמצעי הגנה מאפשרת להפחית את הנזק שנגרם על ידי גזירה וחום של גדילי דנ"א.
מלבד הגדרות משרעת נמוכות, מצב פעימה ובקרת טמפרטורה במהלך גזירת דנ"א על-קולית, השימוש בחומרים מסוימים הראה השפעה מגנה משמעותית מפני השפלת הדנ"א. לדוגמה, פולימרים, פפטידים ושומנים שונים מגנים על הדנ"א הפלסמידי במהלך האולטרה-סוניזציה.

היציבות של דנ"א פלסמידי, וננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL נגד עקת גזירה על-קולית, נחקרה באמצעות בדיקת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. הן הדנ"א של הפלסמיד והן ננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי במשך נקודות זמן שונות. הדנ"א של הפלסמיד נחשף ללחץ גזירה על-קולי במשך 0, 10, 20, 30 ו-40 דקות. עם זאת, הננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL נחשפו ללחץ גזירה על-קולי במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו-120 דקות.
(מחקר ותמונה: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) הראו כי כאשר ננו-מבנים של דנ"א פלסמיד / נוזל יוני (pDNA /IL) היו נתונים ללחץ גזירה קולי במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו -120 דקות ומורכבים עם חומר העברת הגנים הקטיוני הזמין מסחרית lipofectamine, אחוז התאים החיוביים הפלואורסצנטיים היו 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, ו-50%, בהתאמה (ראו תרשים בהמשך). אחוז התאים החיוביים הפלואורסצנטיים עלה כאשר הננו-מבנים היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי במשך 10, ו-20 דקות, ולאחר מכן ירד באיטיות.

השפעת נוזל יוני [Bmim][PF6] על העברת דנ"א פלסמיד לתאי COS7. ננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL (נוזל יוני) היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי למשך עד 120 דקות והורכבו עם LA לפני שהועברו לתאי COS7. הנתונים מראים שהמספר הממוצע (%) של תאי HeLa חיוביים ל-GFP נספרו ב-10 שדות מיקרוסקופיים שונים והניסוי בוצע מספר פעמים בשלושה ימים שונים. (מחקר ותרשים: ©Sarker et al., 2019)

הכנה לליסאט קולית

פרוטוקול ליזיס של תאים על-קוליים
התחילו עם דגימה מועשרת של תאים שהוכנה בשיטת הפרדת תאים (למשל, הפרדת תאים אימונומגנטיים, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS), צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, בידוד תאי אימונודנסיביות).
דגימות התאים חייבות להראות נפח של מאגר ליזה המתאים למטרת הניסוי ולאלטראסוניקטור מסוג גשושית.
מאגרים היפוטוניים מועדפים מכיוון שהם משפרים את התזה של תאים על-קוליים. חשוב כי תוספים וריכוז מלח משמשים באופן מתאים.
בחר את מכשיר הליזיס העל-קולי שלך: לצורך צלילה עקיפה של בקבוקונים, מומלץ להשתמש ב-VialTweeter או ב-CupHorn. עבור לוחות multiwell, UIP400MTP הוא ultrasonicator האידיאלי. וסוניקה קלאסית מסוג בדיקה, הומוגנייזר קולי כמו UP100H או UP200Ht עם קצה מיקרו מתאימים ביותר.
פרוטוקול לסוניקה מסוג גשושית: ממקמים את הגשושית האולטרה-סוניקטורית לתוך נפח הדגימה בצינור מיקרו-צנטריפוגה וסוניקטים למשך כ-10 שניות. בהתאם לדגימת הדנ"א, הסאונדציה עשויה לחזור על עצמה פעם או פעמיים נוספות. קלט האנרגיה העל-קולי הנדרש (Ws/mL) תלוי בצמיגות הדגימה ובסוג הדנ"א. קירור באמצעות אמבט קרח ומצב פעימה של האולטרה-סוניקטור מסייע למנוע שהדגימה מתפרקת תרמית.
לאחר תזה קולית, הדגימה עוברת צנטריפוגה להפרדת פסולת כדורית (המכילה תאים, גרעינים ואברונים לא משופעים)
אם הדגימה אינה מעובדת מיד הלאה, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה מתאימה כדי לשמור על הכדאיות שלה.

אולטראסוקטורים לפיצול דנ"א

Hielscher אולטרסוניקה מציעה פלטפורמות שונות מבוססות אולטרסאונד עבור DNA, RNA, ו כרומטין פיצול. פלטפורמות שונות אלה כוללות בדיקות קוליות (sonotrodes), פתרונות sonication עקיף להכנת מדגם בו זמנית של צינורות מרובים או לוחות רבים באר (למשל, 96-באר צלחות, לוחות microtiter), sonoreactors, וכוסות קוליות. כל הפלטפורמות לגיזוי DNA מופעלות על ידי תדרים מכווננים, מעבדים קוליים בעלי ביצועים גבוהים, אשר ניתנים לשליטה מדויקת ומספקים תוצאות הניתנות לשחזור.

מעבדי אולטרה סאונד עבור כל מספר וגודל לדוגמה

עם האולטרה-סוניקטורים מרובי הדגימות של Hielscher, VialTweeter (עבור עד 10 מבחנות) ו-UIP400MTP (עבור מיקרו-לוחות/ לוחות מולטי-וול) ניתן בקלות לקצר את זמן עיבוד הדגימה עקב אולטרה-סוניקציה אינטנסיבית וניתנת לשליטה מדויקת תוך קבלת התפלגות ותפוקת גודל מקטע הדנ"א הרצויים. פיצול דנ"א על-קולי הופך את שלבי הכנת הפלסמיד ליעילים, אמינים וניתנים להרחבה. ניתן לשנות את קנה המידה של הפרוטוקולים באופן ליניארי מדגימה אחת למספר רב על ידי החלת פרמטרים קבועים של אולטרסאונד.
בדיקה ultrasonicators עם אצבע אחת עד חמש אצבעות אידיאליים להכנת מספרי דגימה קטנים יותר. האולטרה-סוניקטורים של המעבדה של Hielscher זמינים עם רמות הספק שונות, כך שתוכלו לבחור את המשבש העל-קולי האידיאלי עבור היישום הקשור לדנ"א שלכם.