הכנת פלסמידים באמצעות אולטרסוניקציה
אולטרסוניקציה היא טכניקה אמינה לפרגמנטציה של DNA פלסמידי. אמפליטודה הניתנת לשליטה מדויקת, מצב פולסים ובקרת טמפרטורה הם המאפיינים החשובים ביותר של מכשיר אולטרסוני לפרגמנטציה של פלסמידים ללא גרימת נזק. נוסף על כך, השימוש בחומרים מסוימים מסייע בהגנה מפני פירוק של פלסמידים. Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון פתרונות לפרגמנטציה מבוקרת של פלסמידים, החל בטיפול בבקבוקונים בודדים ועד לסוניקציה בו־זמנית של דגימות רבות ושל פלטות מרובות באריות. למדו עוד על פרגמנטציה אולטרסונית מוצלחת של פלסמידים!
המכשיר UIP400MTP מאפשר אולטרסוניקציה מבוקרת במדויק של פלטות מרובות באריות. אחד היישומים של UIP400MTP הוא פרגמנטציה של DNA פלסמידי לשם קבלת מקטעים באורך יעד מוגדר.
גזירת פלסמידים באמצעות אולטרסוניקציה
כאשר דגימות DNA נחשפות לגלים אולטרסוניים, התנודות הנוצרות באמצעות האולטרסאונד יוצרות קוויטציה אקוסטית בנוזל, הגוזרת או שוברת מולקולות DNA בעלות משקל מולקולרי גבוה באמצעות כוחות מכניים. סוניקציה היא השיטה הנפוצה ביותר בניסויים לגזירת DNA בכמות גדולה, לרבות יישומים כגון אימונופרסיפיטציה של כרומטין (ChIP), שבהם מקטעים קטנים חיוניים לחלוטין להשגת רזולוציה גבוהה. (ראו Tseng et al., 2012)
DNA פלסמידי (pDNA) הוא צורה מסוימת של DNA, המתאפיינת במבנה טבעתי ונמצאת בחיידקים ובחלק מהאיקריוטים.
pDNA בעל פיתול־על הוא הצורה הרצויה של DNA פלסמידי, שכן הוא מניב את התוצאות הטובות ביותר בתהליכי המשך כגון ריצוף אוטומטי וטרנספקציה. אולטרסוניקציה מתאימה לפרגמנטציה מוצלחת של pDNA, לרבות pDNA בעל פיתול־על.
Thompson et al. (2008) הראו שסוניקציה של פלסמידים, הידועה כגורמת לפרגמנטציה של DNA בעל פיתול־על, היא דרך יעילה לשיפור אורכי קריאות הרצף באיכות phred20 עד לרמה שבה הם אינם שונים באופן מובהק מאלה המתקבלים מתבנית הביקורת של Beckman Coulter או מפלסמידים שעברו לינאריזציה אנזימטית.
- ניתנת לשליטה מדויקת
- תוצאות הניתנות לשחזור
- ניתנת להתאמה לאורכי היעד של מקטעי DNA
- בקרת טמפרטורה
- ניתנת להתאמה לכל גודל דגימה
שימוש בווקטורים פלסמידיים
פלסמידים משמשים לעיתים קרובות ככלים לשיבוט, להעברה ולמניפולציה של גנים. כאשר משתמשים בפלסמידים בניסויים למטרות אלה, הם נקראים וקטורים. ניתן להחדיר מקטעי DNA או גנים לווקטור פלסמידי וליצור מה שמכונה פלסמיד רקומביננטי. וקטורים פלסמידיים משמשים כנשאים להחדרת DNA רקומביננטי לתא מארח ומהווים מרכיב מרכזי בשיבוט מולקולרי.
"וקטורים לא־נגיפיים נחקרים בהרחבה בשל הפוטנציאל לשימוש בהם בריפוי גני לטיפול במחלות מורכבות שונות. וקטורים לא־נגיפיים מגינים על DNA פלסמידי מפני פירוק פיזיקלי, כימי ואנזימטי ומעבירים את מולקולת ה־DNA לאתר המטרה. לדוגמה, ליפוזומים קטיוניים, כיטוזן וננו־חלקיקים אחרים בעלי מטען חיובי יוצרים קומפלקסים עם DNA פלסמידי באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות. עם זאת, הקומפלקסים של ליפוזומים קטיוניים ו־DNA פלסמידי, הנוצרים בקלות, גדולים יחסית (כלומר, 300–400 nm) והטרוגניים באופיים, דבר המקשה על השימוש בהם ביישומים פרמצבטיים. באמצעות אולטרסוניקציה ניתן להקטין את הקומפלקסים הגדולים וההטרוגניים של DNA פלסמידי/ליפוזומים, DNA פלסמידי/אירוסולים ו־DNA פלסמידי/פפטידים לחלקיקים קטנים והומוגניים יותר." (Sarker et al., 2019)
דוגמה בולטת לשימוש בווקטורים פלסמידיים היא CRISPR–Cas9. מערכת CRISPR–Cas9 מועברת בדרך כלל לתאים כפלסמיד גדול יחיד או כמספר פלסמידים קטנים יותר, המקודדים לרצף מטרה, למנחה CRISPR ול־Cas9.
הכנה אולטרסונית של ננו־חלקיקי PLGA טעוני DNA באמצעות ננו־שיקוע
Jo et al. (2020) השתמשו בפולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) כדי ליצור נשא ננומטרי להחדרת פלסמיד מודל של CRISPR–Cas9 למקרופאגים ראשוניים שמקורם במח העצם. לצורך שיקוע ננומטרי של ננו-חלקיקי PLGA, נעשה שימוש ב-PLGA בעל שתי קבוצות קצה שונות (קבוצות אסטר ואמין), במטרה שקבוצות קצה האמין בעלות המטען החיובי יגבירו את יעילות הכימוס ואת ההעמסה בשל האינטראקציות החשמליות בינן לבין השלד בעל המטען השלילי של ה-DNA. במבחנת צנטריפוגה חרוטית מפוליפרופילן בנפח 50 mL, הומסו 100 mg של Pluronic F127 ב-20 mL של מים נטולי יונים שעוקרו באוטוקלב, באמצעות ערבול בוורטקס ולאחריו סוניקציה עדינה במשך 30 min באמבט אולטרסוני (ראו CupHorn). הוסף מוט בחישה מגנטי שעוקר באוטוקלב, והתמיסה עורבבה במהירות 600 RPM במשך 30 min בזמן הכנת התמיסות האחרות. לאורך כל התהליך נעשה שימוש בכלי מעבדה מפלסטיק במקום בכלי זכוכית כדי למזער ספיחה בלתי סגולית של DNA. תמיסות של PLGA מומס ב-DMF (44.48 mg/ ml) ושל TIPS pentacene מומס ב-THF (0.667 mg/ml) הוכנו בנפרד. ה-PLGA הושאר ללא תנועה להרטבה ב-DMF במשך 30 min לפני שעבר סוניקציה במשך 30 min. (לפרוטוקול המלא ראו Jo et al., 2020)
- מיצוי DNA
- כימוס DNA
- פיזור DNA המצופה בננו-חלקיקים
- החדרת DNA פלסמידי לתאים
UP200St CupHorn לסוניקציה עקיפה של דגימות, למשל למיצוי DNA ולפרגמנטציה שלו.
הגנה על DNA פלסמידי במהלך סוניקציה
DNA, לרבות פלסמידים ופלסמידים בעלי פיתול-על, רגיש מאוד לפירוק. לכל שיטות הפרגמנטציה הזמינות יש חסרונות מסוימים ידועים. פרגמנטציה אולטרסונית של DNA היא אחת השיטות המועדפות, שכן סוניקציה מבוקרת בשילוב אמצעי הגנה מאפשרת להפחית נזק לגדילי DNA הנגרם מגזירה ומחום.
מלבד הגדרות משרעת נמוכה, מצב פעימות ובקרת טמפרטורה במהלך גזירה אולטרסונית של DNA, השימוש בחומרים מסוימים הראה השפעה מגינה משמעותית מפני פירוק DNA. למשל, פולימרים, פפטידים וליפידים שונים מגינים על ה-DNA הפלסמידי במהלך הטיפול האולטרסוני.
יציבותם של DNA פלסמידי ושל ננו-קומפלקסים של DNA פלסמידי/IL כנגד מאמץ גזירה אולטרסוני נבדקה באמצעות בדיקת אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. הן ה-DNA הפלסמידי והן ננו-הקומפלקסים של DNA פלסמידי/IL נחשפו למאמץ גזירה אולטרסוני לפרקי זמן שונים. ה-DNA הפלסמידי נחשף למאמץ גזירה אולטרסוני במשך 0, 10, 20, 30 ו-40 דקות. לעומת זאת, ננו-הקומפלקסים של DNA פלסמידי/IL נחשפו למאמץ גזירה אולטרסוני במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו-120 דקות.
(מחקר ותמונה: ©Sarker et al., 2019)
Sarker et al. (2019) הדגימו שכאשר ננו-מבנים של DNA פלסמידי / נוזל יוני (pDNA/IL) נחשפו למאמץ גזירה אולטרסוני במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו-120 min ונוצרו מהם קומפלקסים עם lipofectamine, חומר קטיוני להחדרת גנים הזמין מסחרית, שיעור התאים החיוביים לפלואורסצנציה היה 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% ו-50%, בהתאמה (ראו תרשים להלן). שיעור התאים החיוביים לפלואורסצנציה עלה כאשר ננו-המבנים נחשפו למאמץ גזירה אולטרסוני במשך 10 ו-20 min, ולאחר מכן ירד באיטיות.
השפעת הנוזל היוני [Bmim][PF6] על החדרת DNA פלסמידי לתאי COS7. ננו-קומפלקסים של DNA פלסמידי/IL (נוזל יוני) נחשפו למאמץ גזירה אולטרסוני במשך עד 120 דקות ונוצרו מהם קומפלקסים עם LA לפני החדרתם לתאי COS7. הנתונים מציגים את המספר הממוצע (%) של תאי HeLa החיוביים ל-GFP שנספרו ב-10 שדות מיקרוסקופיים שונים, והניסוי בוצע פעמים רבות בשלושה ימים שונים. (מחקר ותרשים: ©Sarker et al., 2019)
ניתן להגן על DNA פלסמידי באמצעות הוספת חומר לפני פרגמנטציה אולטרסונית: פירוק המושרה בסוניקציה של pDNA חשוף (A) ושל pDNA בפורמולציה עם 1.5 mM של CaCl2 ו-20 % (v/v) של t-butanol (B)
הדגימות עברו סוניקציה באמצעות גשוש בהספק 20W למשך עד 120s, כפי שמצוין בראש כל נתיב. נתיב H תואם לסמן Hyperladder I ™️. פסי הפלסמידים OC ו-SC מסומנים.
(מחקר ותמונות: ©Wu et al., 2009)
הכנת ליזט באמצעות אולטרסאונד
פרוטוקול לליזיס תאים באמצעות אולטרסאונד
התחילו בדגימה מועשרת בתאים שהוכנה באמצעות שיטה להפרדת תאים (למשל, הפרדת תאים אימונומגנטית, מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), צנטריפוגה במפל צפיפות או בידוד תאים בשיטת צפיפות אימונולוגית).
דגימות התאים חייבות להכיל נפח של בופר ליזיס המתאים למטרת הניסוי ולמכשיר האולטרסוני מסוג גשוש.
עדיפים בופרים היפוטוניים, שכן הם מגבירים את ליזיס התאים באמצעות אולטרסאונד. חשוב להשתמש בתוספים ובריכוז המלח באופן מתאים.
בחרו את מכשיר הליזיס האולטרסוני שלכם: לסוניקציה עקיפה של בקבוקונים מומלצים VialTweeter או CupHorn. עבור פלטות מרובות באריות, UIP400MTP הוא המכשיר האולטרסוני האידיאלי. ולסוניקציה קלאסית באמצעות גשוש, הומוגנייזר אולטרסוני כגון UP100H או UP200Ht עם קצה זעיר הוא המתאים ביותר.
פרוטוקול לסוניקציה באמצעות גשוש: הכניסו את גשוש המכשיר האולטרסוני לתוך נפח הדגימה שבמבחנת מיקרוצנטריפוגה ובצעו סוניקציה במשך כ-10 שניות. בהתאם לדגימת ה-DNA, ייתכן שיהיה צורך לחזור על הסוניקציה פעם או פעמיים נוספות. קלט האנרגיה האולטרסונית הנדרש (Ws/mL) תלוי בצמיגות הדגימה ובסוג ה-DNA. קירור באמצעות אמבט קרח ומצב הפעימות של המכשיר האולטרסוני מסייעים במניעת פירוק הדגימה עקב חום.
לאחר ליזיס באמצעות אולטרסאונד, הדגימה עוברת צנטריפוגה להפרדת משקע השברים (המכיל תאים שלא עברו ליזיס, גרעינים ואברונים שלא עברו ליזיס)
אם הדגימה אינה עוברת מיד עיבוד נוסף, ניתן ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה מתאימה כדי לשמר את חיותה.
מכשירים אולטרסוניים לפרגמנטציה של DNA
Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון פלטפורמות מבוססות אולטרסאונד לפרגמנטציה של DNA, RNA וכרומטין. הפלטפורמות השונות כוללות גשושים אולטרסוניים (סונוטרודות), פתרונות לסוניקציה עקיפה להכנה בו־זמנית של דגימות במבחנות מרובות או בפלטות מרובות באריות (למשל, פלטות בעלות 96 באריות ופלטות מיקרוטיטר), כורים אולטרסוניים והתקני CupHorn אולטרסוניים. כל הפלטפורמות לגזירת DNA מופעלות באמצעות מעבדים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים המכווננים לתדר, הניתנים לשליטה מדויקת ומספקים תוצאות הניתנות לשחזור.
מעבדים אולטרסוניים לכל מספר וגודל של דגימות
באמצעות המכשירים האולטרסוניים של Hielscher לטיפול בדגימות מרובות, VialTweeter (לעד 10 מבחנות) ו-UIP400MTP (לפלטות מיקרו/פלטות מרובות באריות), ניתן בקלות לקצר את זמן עיבוד הדגימות הודות לסוניקציה עוצמתית הניתנת לשליטה מדויקת, תוך קבלת התפלגות הגדלים והתפוקה הרצויות של מקטעי ה-DNA. פרגמנטציה אולטרסונית של DNA הופכת את שלבי הכנת הפלסמידים ליעילים, אמינים וניתנים להרחבת קנה המידה. ניתן להגדיל באופן ליניארי את קנה המידה של הפרוטוקולים מדגימה אחת לדגימות רבות באמצעות שימוש בפרמטרים קבועים של אולטרסאונד.
מכשירים אולטרסוניים מסוג גשוש בעלי אצבע אחת עד חמש אצבעות אידיאליים להכנת מספרים קטנים יותר של דגימות. המכשירים האולטרסוניים המעבדתיים של Hielscher זמינים ברמות הספק שונות, כך שתוכלו לבחור את מכשיר הפירוק האולטרסוני האידיאלי ליישום שלכם הקשור ל-DNA.
היחידה האולטרסונית להכנת דגימות מרובות VialTweeter מאפשרת סוניקציה בו-זמנית של עד 10 בקבוקונים. בעזרת התקן ההידוק VialPress ניתן להצמיד עד 4 מבחנות נוספות לחזית לצורך סוניקציה עוצמתית.
בקרת תהליך מדויקת
הגדרות סוניקציה הניתנות לשליטה מדויקת הן חיוניות, שכן סוניקציה ממושכת מדי עלולה להרוס DNA, RNA וכרומטין, ואילו גזירה אולטרסונית בלתי מספקת גורמת להיווצרות מקטעי DNA וכרומטין ארוכים מדי. במכשירים האולטרסוניים הדיגיטליים של Hielscher ניתן להגדיר בקלות פרמטרים מדויקים של סוניקציה. ניתן גם לשמור הגדרות סוניקציה מסוימות כהגדרות מתוכנתות לצורך חזרה מהירה על אותו הליך.
כל טיפולי הסוניקציה מתועדים אוטומטית ונשמרים כקובץ CSV בכרטיס SD מובנה. כך מתאפשר תיעוד מדויק של הניסויים שבוצעו ועיון חוזר בקלות בטיפולי הסוניקציה.
באמצעות שליטה מרחוק דרך הדפדפן, ניתן להפעיל ולנטר את כל המכשירים האולטרסוניים הדיגיטליים דרך כל דפדפן סטנדרטי. אין צורך בהתקנת תוכנה נוספת, שכן חיבור ה-LAN מאפשר התקנה פשוטה מאוד בשיטת חבר והפעל.
נוחות השימוש הגבוהה ביותר במהלך הכנת DNA באולטרסאונד
כל המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מתוכננים לספק אולטרסאונד בעל ביצועים גבוהים, ובה בעת להיות תמיד ידידותיים מאוד למשתמש וקלים להפעלה. כל ההגדרות מאורגנות היטב בתפריט ברור, שניתן לגשת אליו בקלות דרך מסך מגע צבעוני או באמצעות שליטה מרחוק דרך הדפדפן. התוכנה החכמה, הכוללת הגדרות מתוכנתות ורישום נתונים אוטומטי, מבטיחה הגדרות סוניקציה מיטביות לקבלת תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. ממשק התפריט הנקי והקל לשימוש הופך את המכשירים האולטרסוניים של Hielscher למכשירים ידידותיים למשתמש ויעילים.
הטבלה שלהלן נותנת מושג על קיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים המעבדתיים שלנו לליזיס של תאים ולפרגמנטציה של DNA:
| נפח אצווה | ספיקת זרימה | מכשירים מומלצים |
|---|---|---|
| פלטות מרובות באריות | n/a | UIP400MTP |
| בקבוקונים, כוס כימית קטנה | n/a | CupHorn אולטרסוני |
| עד 10 בקבוקונים | n/a | VialTweeter |
| 1 עד 500mL | 10 עד 200mL/min | UP100H |
| 10 עד 2000mL | 20 עד 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
צרו קשר! / שאלו אותנו!
ספרות / מקורות
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O'Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D'Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
עובדות שכדאי לדעת
מהם פלסמידים?
פלסמיד הוא מולקולת DNA מעגלית קטנה, הנפרדת פיזית מה-DNA הכרומוזומלי ומשתכפלת באופן עצמאי. פלסמידים קשורים לעיתים קרובות לגנים התורמים להישרדותו של אורגניזם ומקנים יתרונות מסוימים, למשל עמידות לאנטיביוטיקה. פלסמידים מצויים לרוב בחיידקים כמולקולות DNA מעגליות קטנות ודו-גדיליות; עם זאת, פלסמידים מצויים לעיתים גם בארכאונים ובאורגניזמים איקריוטיים. פלסמידים הם כלים חשובים בביולוגיה מולקולרית, בגנטיקה, בביוכימיה ובמדעי החיים. בהנדסה גנטית הם מוכרים כווקטורים ומשמשים לשכפול או לביטוי של גנים מסוימים. שינוי מכוון של וקטור נקרא תכנון וקטור.
אנליזת GFP במחקר תאים
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא סמן ביולוגי רב-תכליתי לניטור תהליכים פיזיולוגיים, להמחשת מיקום חלבונים ולזיהוי ביטוי טרנסגני בתוך אורגניזם חי. ניתן לעורר את GFP באמצעות קו לייזר של 488 nm, והגילוי המיטבי שלו הוא ב-510 nm.
