הכנת פלסמיד באמצעות אולטרסוניקציה
Ultrasonication היא טכניקה אמינה כדי שבר DNA פלסמיד. משרעת ניתנת לשליטה מדויקת, מצב פעימה ובקרת טמפרטורה הם התכונות החשובות ביותר של אולטרסוניקטור לפיצול פלסמיד שאינו מזיק. בנוסף, השימוש של סוכנים מסוימים לעזור להגן מפני השפלה פלסמיד. Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים עבור פיצול פלסמיד מבוקר מבקבוקונים בודדים, בו זמנית סוניקציה של דגימות רבות, כמו גם לוחות רב באר. למידע נוסף על פיצול פלסמיד קולי מוצלח!
גזירה פלסמידית באמצעות אולטרסוניקציה
כאשר דגימות דנ"א נתונות לגלים על-קוליים, התנודות הנוצרות באולטרה-סאונד יוצרות קוויטציה אקוסטית בנוזל שחותכת או שוברת מולקולות דנ"א בעלות משקל מולקולרי גבוה באמצעות כוחות מכניים. סוניקציה היא השיטה הנפוצה ביותר לניסויי גזירת דנ"א בתפזורת, כולל יישומים, כגון Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), שעבורה גדלי מקטעים קטנים חיוניים לחלוטין להשגת רזולוציה גבוהה. (ראה: Tseng et al., 2012)
דנ"א פלסמיד (pDNA) הוא צורה ספציפית של דנ"א, המאופיינת בצורתו הטבעתית ומצויה בחיידקים ובכמה איקריוטים.
pDNA מפותל הוא הצורה הרצויה של דנ"א פלסמיד מכיוון שהוא מראה את התוצאות הטובות ביותר בתהליכים במורד הזרם כגון ריצוף אוטומטי וטרנספקציה. אולטרה-סוניקציה מתאימה לפיצול pDNA, כולל pDNA מקודש-על, בהצלחה.
Thompson et al. (2008) הראו כי סוניקציה פלסמידית, הידועה כמפרק דנ"א מפותל-על, היא דרך יעילה לשפר את אורכי הקריאה של רצף phred20 עד כדי כך שהם אינם שונים באופן משמעותי מתבנית הבקרה של בקמן קולטר או מפלסמידים ליניאריים אנזימטיים.
- ניתן לשליטה מדויקת
- תוצאות ניתנות לשחזור
- מתכוונן לאורכי מקטעי DNA ממוקדים
- בקרת טמפרטורה
- ניתן להרחבה לכל גודל מדגם
שימוש בווקטורי פלסמיד
פלסמידים משמשים לעתים קרובות ככלים לשיבוט, העברה ומניפולציה של גנים. כאשר פלסמידים משמשים באופן ניסיוני למטרות אלה, הם נקראים וקטורים. מקטעי DNA או גנים יכולים להיות מוחדרים לתוך וקטור פלסמיד, יצירת מה שנקרא פלסמיד רקומביננטי. וקטורי פלסמיד משמשים ככלי להנעת דנ"א רקומביננטי לתוך תא מארח והם מרכיב מרכזי בשיבוט מולקולרי.
“וקטורים לא נגיפיים נחקרים בהרחבה על השימוש הפוטנציאלי שלהם בריפוי גנטי לטיפול במחלות מורכבות שונות. וקטורים שאינם נגיפיים מגנים על הדנ"א של פלסמיד מפני התפרקות פיזית, כימית ואנזימטית ומעבירים את מולקולת הדנ"א לאתר המטרה. לדוגמה, ליפוזומים קטיוניים, צ'יטוזן וננו-חלקיקים אחרים בעלי מטען חיובי יוצרים קומפלקסים עם דנ"א פלסמיד באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות. עם זאת, קומפלקסי הדנ"א הקטיוניים / פלסמיד הנוצרים בקלות הם גדולים יחסית (כלומר, 300-400 ננומטר) והטרוגניים באופיים, מה שמקשה על השימוש בהם ביישומים פרמצבטיים. ניתן לצמצם את הדנ"א / ליפוזומים של פלסמיד / ליפוזומים גדולים והטרוגניים, דנ"א פלסמיד / אירוסולים וקומפלקסים של דנ"א / פפטידים של פלסמיד לחלקיקים קטנים והומוגניים באמצעות אולטרסוניקציה.” (Sarker et al., 2019)
דוגמה בולטת לשימוש בווקטורי פלסמיד היא CRISPR–Cas9. מערכת CRISPR-Cas9 מועברת בדרך כלל לתאים כפלסמיד גדול יחיד או מספר פלסמידים קטנים יותר המקודדים רצף מטרה, מדריך CRISPR ו- Cas9.
הכנה קולית של ננו-חלקיקי PLGA טעונים בדנ"א על ידי ננו-משקעים
Jo et al. (2020) השתמשו בחומצה פולי(לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) על מנת ליצור נשא ננו-חלקיקים להעברת פלסמיד מודל CRISPR-Cas9 למקרופאגים שמקורם במח עצם ראשוני. עבור ננו-משקעים של ננו-חלקיקי PLGA, PLGA עם שתי קבוצות קצה שונות (קבוצות אסטר ואמין) שימשו במטרה שמכסי קצה האמין הטעונים חיובית יגבירו את יעילות האנקפסולציה והטעינה עקב אינטראקציות המטען בינה לבין עמוד השדרה הטעון שלילית של הדנ"א. בצינור צנטריפוגה חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל, 100 מ"ג פלורוני F127 הומס במי DI אוטוקלאביים של 20 מ"ל על ידי ערבוב מערבולות ואחריו 30 דקות של סוניקציה עדינה באמצעות אמבטיה קולית (ראה CupHorn). נוסף מוט ערבוב מגנטי אוטוקלאבי והתמיסה עורבבה ב-600 סל"ד למשך 30 דקות בזמן ששאר הפתרונות יוצרו כלי מעבדה מפלסטיק שימשו במקום כלי זכוכית לכל אורכם כדי למזער ספיחה לא ספציפית של DNA. תמיסות של PLGA מומס ב- DMF (44.48 מ"ג / מ"ל) ו- TIPS pentacene מומס ב- THF (0.667 מ"ג / מ"ל) יוצרו בנפרד. ה-PLGA הושאר רטוב ב-DMF במשך 30 דקות לפני שהופעל במשך 30 דקות (לפרוטוקול המלא ראו Jo et al., 2020)
- מיצוי DNA
- אנקפסולציה של DNA
- פיזור DNA מצופה ננו-חלקיקים
- העברת DNA פלסמיד לתאים
הגנת DNA פלסמיד במהלך סוניקציה
דנ"א כולל פלסמידים ופלסמידים סופר-סליליים הם השפלה רגישה ביותר. כל שיטות הפיצול הזמינות ידועות בחסרונות מסוימים. פיצול DNA על-קולי הוא אחת השיטות המועדפות, שכן סוניקציה מבוקרת בשילוב עם אמצעי הגנה מאפשרת להפחית את הנזק הנגרם על ידי גזירה וחום של גדילי DNA.
מלבד הגדרות משרעת נמוכה, מצב פעימה ובקרת טמפרטורה במהלך גזירת DNA על-קולית, השימוש בחומרים מסוימים הראה השפעה מגנה משמעותית מפני התפרקות DNA. לדוגמה, פולימרים, פפטידים ושומנים שונים מגנים על הדנ"א של פלסמיד במהלך אולטרה-סוניקציה.
Sarker et al. (2019) הראו כי כאשר ננו-מבנים של פלסמיד DNA / נוזל יוני (pDNA / IL) היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו -120 דקות ומורכבים עם סוכן העברת הגן הקטיוני הזמין מסחרית Lipofectamine, אחוז התאים החיוביים הפלואורסצנטיים היה 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% ו-50%, בהתאמה (ראו תרשים בהמשך). אחוז התאים החיוביים הפלואורסצנטיים גדל כאשר הננו-מבנים היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי במשך 10 ו-20 דקות, ולאחר מכן ירד לאט.
הכנת ליזט קולי
פרוטוקול ליזה של תאים אולטראסוניים
התחל עם דגימה מועשרת של תאים שהוכנה בשיטת הפרדת תאים (למשל, הפרדת תאים אימונומגנטית, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, בידוד תאים בצפיפות חיסונית).
דגימות התא חייבות להראות נפח של חיץ ליזיס המתאים למטרת הניסוי ולאולטרסאונד מסוג בדיקה.
מאגרים היפוטוניים מועדפים מכיוון שהם משפרים ליזה של תאים על-קוליים. חשוב כי תוספים וריכוז מלח משמשים בצורה מתאימה.
בחר את התקן הליזה העל-קולי שלך: לסוניק עקיף של בקבוקונים, מומלץ להשתמש ב- VialTweeter או CupHorn. עבור צלחות multiwells, UIP400MTP הוא ultrasonicator אידיאלי. וסוניקציה קלאסית מסוג בדיקה, הומוגנייזר קולי כמו UP100H או UP200Ht עם קצה מיקרו מתאימים ביותר.
פרוטוקול עבור סוניקציה מסוג בדיקה: הכניסו את הגשושית האולטרה-סוניקטורית לנפח הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה ובצעו סוניקציה למשך כ-10 שניות. בהתאם לדגימת הדנ"א, הסוניקציה עשויה לחזור על עצמה פעם או פעמיים נוספות. קלט האנרגיה העל-קולי הנדרש (Ws/mL) תלוי בצמיגות הדגימה ובסוג ה- DNA. קירור באמצעות אמבט קרח ומצב פעימה של האולטרסאונד מסייע למנוע פירוק תרמי של הדגימה.
לאחר ליזה על-קולית, הדגימה עוברת צנטריפוגה כדי להפריד פסולת כדורית (המכילה תאים לא מפורקים, גרעינים ואברונים שלא עברו ניתוח)
אם הדגימה אינה מעובדת באופן מיידי נוסף, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה מתאימה כדי לשמור על כדאיותה.
אולטרסאונד לפיצול DNA
Hielscher Ultrasonics מציעה פלטפורמות שונות מבוססות אולטרסאונד עבור DNA, RNA, פיצול כרומטין. פלטפורמות שונות אלה כוללות בדיקות על-קוליות (סונוטרודים), פתרונות סוניקציה עקיפים להכנת דגימה בו זמנית של צינורות מרובים או לוחות מרובי בארות (למשל, לוחות 96 בארות, לוחות מיקרוטיטר), סונורקטורים וכוסות קוליות. כל הפלטפורמות לגזירת DNA מופעלות על ידי מעבדים על-קוליים מכווני תדר ובעלי ביצועים גבוהים, הניתנים לשליטה מדויקת ומספקים תוצאות הניתנות לשחזור.
מעבדים קוליים עבור כל מספר מדגם וגודל
עם האולטרסוניקטורים מרובי הדגימות של Hielscher VialTweeter (עבור עד 10 מבחנות) ו- UIP400MTP (עבור צלחות מיקרו / צלחות מרובות) ניתן בקלות להפחית את זמן עיבוד הדגימה עקב אולטרה-סוניקציה אינטנסיבית וניתנת לשליטה מדויקת תוך השגת התפלגות גודל מקטע ה- DNA הרצויה ותפוקה. פיצול DNA קולי הופך את שלבי הכנת הפלסמיד ליעילים, אמינים וניתנים להרחבה. ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקולים באופן ליניארי מדגימה אחת למספר דגימות על ידי החלת פרמטרים קבועים של אולטרסאונד.
בדיקה ultrasonicators עם אחת עד חמש אצבעות הם אידיאליים להכנת מספרי מדגם קטנים יותר. אולטרסאונד המעבדה של Hielscher זמינים עם רמות כוח שונות, כך שתוכל לבחור את משבש קולי אידיאלי עבור היישום הקשור ל- DNA שלך.
בקרת תהליכים מדויקת
הגדרות סוניקציה הניתנות לשליטה מדויקת הן חיוניות מכיוון שסוניפיקציה ממצה יכולה להרוס DNA, RNA וכרומטין, אך גזירה קולית לא מספקת גורמת למקטעי DNA וכרומטין ארוכים מדי. ניתן להגדיר בקלות את האולטרסוניקטורים הדיגיטליים של Hielscher לפרמטר סוניקציה מדויק. ניתן לשמור הגדרות סוניקציה ספציפיות גם כהגדרה מתוכנתת לחזרה מהירה על אותו הליך.
כל הסוניקציה מפרוטוקולת אוטומטית ומאוחסנת כקובץ CSV בכרטיס SD מובנה. זה מאפשר תיעוד מדויק של ניסויים שבוצעו ומאפשר לשנות את ריצות הסוניק בקלות.
באמצעות שלט רחוק של דפדפן, ניתן להפעיל ולנטר את כל האולטרסוניקטורים הדיגיטליים באמצעות כל דפדפן סטנדרטי. התקנה של תוכנה נוספת אינה נדרשת, שכן חיבור LAN הוא פשוט מאוד plug-n-play התקנה.
הידידותיות הגבוהה ביותר למשתמש במהלך הכנת DNA על-קולי
כל Hielscher ultrasonicators נועדו לספק אולטרסאונד ביצועים גבוהים, תוך באותו זמן תמיד להיות מאוד ידידותי למשתמש וקל לתפעול. כל ההגדרות בנויות היטב בתפריט ברור, שניתן לגשת אליו בקלות באמצעות צג מגע צבעוני או שלט רחוק של הדפדפן. התוכנה החכמה עם הגדרות ניתנות לתכנות והקלטת נתונים אוטומטית מבטיחה הגדרות סוניקציה אופטימליות לתוצאות אמינות וניתנות לשחזור. ממשק התפריט הנקי והקל לשימוש הופך את האולטרסוניקטורים של Hielscher למכשירים ידידותיים ויעילים למשתמש.
הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה לגבי יכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד במעבדה שלנו עבור ליזה של תאים ופיצול DNA:
נפח אצווה | קצב זרימה | מכשירים מומלצים |
---|---|---|
צלחות מרובות בארות | לא ישים | UIP400MTP |
בקבוקונים, קטנה | לא ישים | כוסית אולטראסונית |
עד 10 בקבוקונים | לא ישים | VialTweeter |
1 עד 500 מ"ל | 10 עד 200 מ"ל/דקה | UP100H |
10 עד 2000 מ"ל | 20 עד 400 מ"ל/דקה | UP200Ht, UP400ST |
צרו קשר! / שאל אותנו!
ספרות / מקורות
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
עובדות שכדאי לדעת
מה הם פלסמידים?
פלסמיד היא מולקולת דנ"א מעגלית קטנה הנפרדת פיזית מהדנ"א הכרומוזומלי ומשתכפלת באופן עצמאי. פלסמידים קשורים לעתים קרובות לגנים התורמים להישרדותו של אורגניזם ומקנים יתרונות ספציפיים, למשל עמידות לאנטיביוטיקה. פלסמידים נמצאים לרוב כמולקולות דנ"א קטנות עגולות ודו-גדיליות בחיידקים; עם זאת, פלסמידים נמצאים לפעמים באורגניזמים ארכאונים ואיקריוטים. פלסמידים הם כלים חשובים בביולוגיה מולקולרית, גנטיקה, ביוכימיה ומדעי החיים. פלסמידים, המכונים וקטורים בהנדסה גנטית, משמשים לשכפול או ביטוי של גנים מסוימים. השינוי הממוקד של וקטור נקרא עיצוב וקטורי.
ניתוח GFP בחקר התא
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא סמן ביולוגי רב-תכליתי לניטור תהליכים פיזיולוגיים, הדמיה של לוקליזציה של חלבונים וזיהוי ביטוי טרנסגני in vivo. GFP יכול להיות מעורר על ידי קו לייזר 488 ננומטר והוא מזוהה בצורה אופטימלית ב 510 ננומטר.