הכנת פלסמיד באמצעות אולטראסוניזציה

אולטראסוניזציה היא טכניקה אמינה לפיצול דנ"א פלסמידי. משרעת הניתנת לשליטה מדויקת, מצב פעימה ובקרת טמפרטורה הם התכונות החשובות ביותר של קוליקטור לפיצול פלסמידים שאינו מזיק. בנוסף, השימוש בסוכנים מסוימים מסייע להגן מפני השפלת פלסמיד. Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים לפיצול פלסמיד מבוקר מבקבוקונים בודדים, בו זמנית סוניקציה של דגימות רבות כמו גם לוחות מרובי בארות. למידע נוסף על פיצול פלסמיד על-קולי מוצלח!

בקשת מידע





פיצול DNA אולטרה סאונד היא טכניקה אמינה ויעילה נפוץ ברצף הדור הבא (NGS)

The UIP400MTP מאפשר אולטרה-סוניזציה מבוקרת במדויק של לוחות מרובי בארות. אחד היישומים של UIP400MTP הוא פיצול של דנ"א פלסמיד על מנת להשיג שברים באורך ממוקד במיוחד.

גזירה של פלסמיד באמצעות אולטראסוניקה

כאשר דגימות דנ"א נתונות לגלים על-קוליים, התנודות האולטרה-סוניות הנוצרות יוצרות קוויטציה אקוסטית בנוזל שגוזזת או שוברת מולקולות דנ"א בעלות משקל מולקולרי גבוה באמצעות כוחות מכניים. סוניקציה היא השיטה הנפוצה ביותר לניסויים בגזירת דנ"א בתפזורת, כולל יישומים, כגון Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), שעבורם גדלי שברים קטנים הם חיוניים לחלוטין להשגת רזולוציה גבוהה. (ראה: Tseng et al., 2012)
דנ"א פלסמידי (pDNA) הוא צורה ספציפית של דנ"א, המאופיין בצורת הטבעת שלו ונמצא בחיידקים ובכמה אאוקריוטים.
pDNA על-קולי הוא הצורה הרצויה של דנ"א פלסמידי מכיוון שהוא מראה את התוצאות הטובות ביותר בתהליכים במורד הזרם כגון ריצוף אוטומטי וטרנספקציה. אולטרה-סוניקציה מתאימה לפיצול pDNA, כולל pDNA עם קולר-על, בהצלחה.
Thompson et al. (2008) הראו כי סוניקציה של פלסמיד, הידועה כמקטעת דנ"א על-קולי, היא דרך יעילה לשפר את אורכי הקריאה של הרצף phred20 עד כדי כך שהם אינם שונים באופן משמעותי מתבנית הבקרה של בקמן קולטר או מפלסמידים ליניאריים אנזימטיים.

היתרונות של פיצול DNA אולטרה סאונד

  • בשליטה מדויקת
  • תוצאות הניתנות לשחזור
  • ניתן לכוונון למיקוד אורכי מקטעי דנ"א
  • בקרת טמפרטורה
  • ניתן להרחבה לכל גודל מדגם
הווידאו מראה את מערכת הכנת מדגם קולי UIP400MTP, המאפשר הכנת מדגם אמין של כל צלחות מרובות טוב סטנדרטי באמצעות אולטרסאונד בעוצמה גבוהה. יישומים אופייניים של UIP400MTP כוללים תמוגה בתא, DNA, RNA, גיזת כרומטין, כמו גם מיצוי חלבון.

אולטרה סאונד UIP400MTP עבור sonication צלחת רב-באר

שימוש בווקטורים של פלסמיד

פלסמידים משמשים לעתים קרובות ככלים לשיבוט, העברה ומניפולציה של גנים. כאשר פלסמידים משמשים באופן ניסיוני למטרות אלה, הם נקראים וקטורים. ניתן להחדיר מקטעי דנ"א או גנים לווקטור פלסמיד, וליצור מה שמכונה פלסמיד רקומביננטי. וקטורים של פלסמיד משמשים ככלי להנעת דנ"א רקומביננטי לתוך תא מארח והם מרכיב מרכזי בשיבוט מולקולרי.
“וקטורים לא ויראליים נחקרים בהרחבה על השימוש הפוטנציאלי שלהם בריפוי גנטי לטיפול במחלות מסובכות שונות. וקטורים שאינם נגיפיים מגנים על דנ"א פלסמידי מפני השפלה פיזיקלית, כימית ואנזימטית ומעבירים את מולקולת הדנ"א לאתר המטרה. לדוגמה, ליפוזומים קטיוניים, צ'יטוזן וננו-חלקיקים אחרים הטעונים חיובית יוצרים קומפלקסים עם דנ"א פלסמידי באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות. עם זאת, הליפוזומים הקטיוניים/קומפלקסי הדנ"א הפלסמידיים הנוצרים בקלות הם גדולים יחסית (כלומר, 300-400 ננומטר) והטרוגניים באופיים, מה שמקשה על השימוש בהם ביישומים פרמצבטיים. ניתן לצמצם את קומפלקסי הדנ"א/ליפוזומים הגדולים וההטרוגניים של הפלסמידים, פלסמיד DNA/אירוסולים וקומפלקסים של פלסמיד DNA/פפטידים לקטנים יותר, ולחלקיקים הומוגניים באמצעות אולטרה-סוניזציה.” (Sarker et al., 2019)
דוגמה בולטת לשימוש בווקטורים של פלסמיד היא CRISPR–Cas9. מערכת הקריספר-Cas9 מועברת בדרך כלל לתאים כפלסמיד יחיד גדול או כמספר פלסמידים קטנים יותר המקודדים רצף מטרה, מדריך קריספר ו-Cas9.

הכנה קולית של ננו-חלקיקי PLGA טעונים בדנ"א על ידי ננו-ארכיטקטורה

Jo et al. (2020) השתמשו בחומצה פולית(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) על מנת ליצור נשא ננו-חלקיקי להעברת מודל של פלסמיד CRISPR-Cas9 למקרופאג'ים שמקורם במח עצם ראשוני. עבור ננו-ארכיטקטורה של ננו-חלקיקי PLGA, נעשה שימוש ב-PLGA עם שתי קבוצות קצה שונות (קבוצות אסטר ואמין) במטרה שכובעי הקצה של האמין הטעונים חיובית יגבירו את יעילות האנקפסולציה ואת העומס בשל אינטראקציות המטען בינו לבין עמוד השדרה הטעון שלילית של הדנ"א. בצינור צנטריפוגה חרוטי פוליפרופילן של 50 מ"ל, 100 מ"ג פלורוני F127 הומס במים DI אוטוקלביים של 20 מ"ל על ידי ערבוב מערבולת ואחריו 30 דקות של סוניקציה עדינה באמצעות אמבטיה קולית (ראה קופהורן). מוט ערבוב מגנטי אוטוקלאב נוסף והתמיסה הייתה מעורבבת ב-600 סל"ד למשך 30 דקות בזמן שהפתרונות האחרים יוצרו. כלי מעבדה מפלסטיק שימשו במקום כלי זכוכית לכל אורכו כדי למזער את הספיחה הלא ספציפית של הדנ"א. תמיסות של PLGA המומסות ב-DMF (44.48 מ"ג/מ"ל) ו-TIPS פנטקן המומס ב-THF (0.667 מ"ג/מ"ל) יוצרו בנפרד. ה-PLGA הושאר רטוב ב-DMF במשך 30 דקות לפני שהוטבע במשך 30 דקות (לפרוטוקול מלא ראו Jo et al., 2020)

יישומים קשורים:

  • מיצוי דנ"א
  • אנקפסולציה של דנ"א
  • פיזור דנ"א מצופה ננו-חלקיקים
  • העברת דנ"א פלסמיד לתאים
UP200st TD_CupHorn עבור sonication עקיף של דגימות

ה-UP200St CupHorn לצליל עקיף של דגימות, למשל לצורך מיצוי ופיצול DNA.

בקשת מידע





הגנת דנ"א של פלסמיד במהלך סוניקציה

דנ"א הכולל פלסמידים ופלסמידים על-קוליים הם השפלה רגישה ביותר. כל שיטות הפיצול הזמינות ידועות בחסרונות מסוימים. פיצול דנ"א על-קולי הוא אחת השיטות המועדפות, שכן סוניקציה מבוקרת בשילוב עם אמצעי הגנה מאפשרת להפחית את הנזק שנגרם על ידי גזירה וחום של גדילי דנ"א.
מלבד הגדרות משרעת נמוכות, מצב פעימה ובקרת טמפרטורה במהלך גזירת דנ"א על-קולית, השימוש בחומרים מסוימים הראה השפעה מגנה משמעותית מפני השפלת הדנ"א. לדוגמה, פולימרים, פפטידים ושומנים שונים מגנים על הדנ"א הפלסמידי במהלך האולטרה-סוניזציה.

נוזלים יוניים יכולים להגן על דנ"א פלסמיד מפני נזקים במהלך סוניקציה.

היציבות של דנ"א פלסמידי, וננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL נגד עקת גזירה על-קולית, נחקרה באמצעות בדיקת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. הן הדנ"א של הפלסמיד והן ננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי במשך נקודות זמן שונות. הדנ"א של הפלסמיד נחשף ללחץ גזירה על-קולי במשך 0, 10, 20, 30 ו-40 דקות. עם זאת, הננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL נחשפו ללחץ גזירה על-קולי במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו-120 דקות.
(מחקר ותמונה: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) הראו כי כאשר ננו-מבנים של דנ"א פלסמיד / נוזל יוני (pDNA /IL) היו נתונים ללחץ גזירה קולי במשך 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ו -120 דקות ומורכבים עם חומר העברת הגנים הקטיוני הזמין מסחרית lipofectamine, אחוז התאים החיוביים הפלואורסצנטיים היו 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, ו-50%, בהתאמה (ראו תרשים בהמשך). אחוז התאים החיוביים הפלואורסצנטיים עלה כאשר הננו-מבנים היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי במשך 10, ו-20 דקות, ולאחר מכן ירד באיטיות.

פיצול קולי של דנ"א פלסמידי

השפעת נוזל יוני [Bmim][PF6] על העברת דנ"א פלסמיד לתאי COS7. ננו-קומפלקסים של פלסמיד DNA/IL (נוזל יוני) היו נתונים ללחץ גזירה על-קולי למשך עד 120 דקות והורכבו עם LA לפני שהועברו לתאי COS7. הנתונים מראים שהמספר הממוצע (%) של תאי HeLa חיוביים ל-GFP נספרו ב-10 שדות מיקרוסקופיים שונים והניסוי בוצע מספר פעמים בשלושה ימים שונים. (מחקר ותרשים: ©Sarker et al., 2019)

ניתן להגן על דנ"א של פלסמיד ולהוסיף סוכן לפני פיצול על-קולי.

ניתן להגן על דנ"א פלסמידי בהוספת סוכן לפני פיצול קולי: השפלה הנגרמת על ידי סוניקציה של pDNA עירום (A) ושל pDNA מנוסח עם 1.5 mM של CaCl2 ו-20% (v/v) t-butanol (B)
הדגימות הועתקו עם גשושית של 20W במשך עד 120 שניות, כפי שמצוין בחלק העליון של כל נתיב. ליין H מתאים לסמן Hyperladder I ™️. להקות הפלסמיד OC ו- SC מסומנות.
(מחקר ותמונות: ©Wu et al., 2009)

הכנה לליסאט קולית

פרוטוקול ליזיס של תאים על-קוליים
Ultrasonicator UP200Ht עם microtip S26d2 עבור תמוגה קולית של דגימות ביולוגיותהתחילו עם דגימה מועשרת של תאים שהוכנה בשיטת הפרדת תאים (למשל, הפרדת תאים אימונומגנטיים, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS), צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, בידוד תאי אימונודנסיביות).
דגימות התאים חייבות להראות נפח של מאגר ליזה המתאים למטרת הניסוי ולאלטראסוניקטור מסוג גשושית.
מאגרים היפוטוניים מועדפים מכיוון שהם משפרים את התזה של תאים על-קוליים. חשוב כי תוספים וריכוז מלח משמשים באופן מתאים.
בחר את מכשיר הליזיס העל-קולי שלך: לצורך צלילה עקיפה של בקבוקונים, מומלץ להשתמש ב-VialTweeter או ב-CupHorn. עבור לוחות multiwell, UIP400MTP הוא ultrasonicator האידיאלי. וסוניקה קלאסית מסוג בדיקה, הומוגנייזר קולי כמו UP100H או UP200Ht עם קצה מיקרו מתאימים ביותר.
פרוטוקול לסוניקה מסוג גשושית: ממקמים את הגשושית האולטרה-סוניקטורית לתוך נפח הדגימה בצינור מיקרו-צנטריפוגה וסוניקטים למשך כ-10 שניות. בהתאם לדגימת הדנ"א, הסאונדציה עשויה לחזור על עצמה פעם או פעמיים נוספות. קלט האנרגיה העל-קולי הנדרש (Ws/mL) תלוי בצמיגות הדגימה ובסוג הדנ"א. קירור באמצעות אמבט קרח ומצב פעימה של האולטרה-סוניקטור מסייע למנוע שהדגימה מתפרקת תרמית.
לאחר תזה קולית, הדגימה עוברת צנטריפוגה להפרדת פסולת כדורית (המכילה תאים, גרעינים ואברונים לא משופעים)
אם הדגימה אינה מעובדת מיד הלאה, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה מתאימה כדי לשמור על הכדאיות שלה.

אולטראסוקטורים לפיצול דנ"א

Hielscher אולטרסוניקה מציעה פלטפורמות שונות מבוססות אולטרסאונד עבור DNA, RNA, ו כרומטין פיצול. פלטפורמות שונות אלה כוללות בדיקות קוליות (sonotrodes), פתרונות sonication עקיף להכנת מדגם בו זמנית של צינורות מרובים או לוחות רבים באר (למשל, 96-באר צלחות, לוחות microtiter), sonoreactors, וכוסות קוליות. כל הפלטפורמות לגיזוי DNA מופעלות על ידי תדרים מכווננים, מעבדים קוליים בעלי ביצועים גבוהים, אשר ניתנים לשליטה מדויקת ומספקים תוצאות הניתנות לשחזור.

מעבדי אולטרה סאונד עבור כל מספר וגודל לדוגמה

עם האולטרה-סוניקטורים מרובי הדגימות של Hielscher, VialTweeter (עבור עד 10 מבחנות) ו-UIP400MTP (עבור מיקרו-לוחות/ לוחות מולטי-וול) ניתן בקלות לקצר את זמן עיבוד הדגימה עקב אולטרה-סוניקציה אינטנסיבית וניתנת לשליטה מדויקת תוך קבלת התפלגות ותפוקת גודל מקטע הדנ"א הרצויים. פיצול דנ"א על-קולי הופך את שלבי הכנת הפלסמיד ליעילים, אמינים וניתנים להרחבה. ניתן לשנות את קנה המידה של הפרוטוקולים באופן ליניארי מדגימה אחת למספר רב על ידי החלת פרמטרים קבועים של אולטרסאונד.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

יחידת ההכנה מרובת הדגימות הקולית VialTweeter מאפשר sonication בו זמנית של עד 10 בקבוקונים. עם מכשיר הידוק VialPress, עד 4 צינורות נוספים ניתן ללחוץ לחזית עבור sonication אינטנסיבי.

בקרת תהליכים מדויקת

Hielscher ultrasonicators ניתן לשלוט מרחוק באמצעות בקרת דפדפן. ניתן לעקוב אחר פרמטרי Sonication ולהתאים בדיוק לדרישות התהליך.הגדרות sonication לשליטה בדיוק הם קריטיים מאז sonification ממצה יכול להרוס DNA, RNA ו chromatin, אבל תוצאות גיזת קולי לקוי ב- DNA ארוך מדי שברי כרומטין. ultrasonicators הדיגיטלי של Hielscher ניתן להגדיר בקלות פרמטר sonication מדויק. ניתן גם לשמור הגדרות sonication ספציפיות כהגדרה מתוכנתת לחזרה מהירה של אותו הליך.
כל sonication הם פרוטוקול אוטומטי ומאוחסן כקובץ CSV על כרטיס SD מובנה. זה מאפשר תיעוד מדויק של ניסויים שבוצעו ומאפשר לתקן sonication פועל בקלות.
באמצעות שלט רחוק בדפדפן, כל ultrasonicators דיגיטלי ניתן להפעיל ולנטר באמצעות כל דפדפן סטנדרטי. התקנה של תוכנה נוספת אינה נדרשת, שכן חיבור LAN הוא התקנה פשוטה מאוד plug-n-play.

הידידותיות הגבוהה ביותר למשתמש במהלך הכנת DNA על-קולי

כל ultrasonicators Hielscher נועדו לספק אולטרסאונד ביצועים גבוהים, בעוד באותו זמן תמיד להיות מאוד ידידותי למשתמש וקל לתפעול. כל ההגדרות בנויות היטב בתפריט ברור, אליו ניתן לגשת בקלות באמצעות צג מגע צבעוני או שלט רחוק של הדפדפן. התוכנה החכמה עם הגדרות ניתנות לתכנות והקלטת נתונים אוטומטית מבטיחה הגדרות sonication אופטימליות לתוצאות אמינות הניתנות לשחזור. ממשק התפריט הנקי והקלה לשימוש הופך ultrasonicators Hielscher למכשירים ידידותיים למשתמש ויעילים.
הטבלה שלהלן נותנת לך אינדיקציה לכושר העיבוד המשוער של האולטרה-סוניקטורים במעבדה שלנו עבור תזה של תאים ופיצול DNA:

נפח תצווה קצב זרימה התקנים מומלצים
צלחות מרובות בארות n/a UIP400MTP
בקבוקונים, קטנה n/a cuphorn אולטרסאונד
עד 10 בקבוקונים n/a VialTweeter
1 עד 500mL 10 עד 200mL / min מעלהay
10 עד 2000mL 20 עד 400mL / min Uf200 ः t, UP400St

תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!

בקש מידע נוסף

אנא השתמש בטופס שלהלן כדי לבקש מידע נוסף על הומוגנייזרים קוליים למיצוי ופיצול DNA, פרוטוקולי יישום ומחירים. נשמח לדון איתך בתהליך שלך ולהציע לך מערכת קולית העונה על דרישותיך!









הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.




ספרות/הפניות

עובדות שראוי לדעת

מהם פלסמידים?
פלסמיד הוא מולקולת דנ"א מעגלית קטנה הנפרדת פיזית מהדנ"א הכרומוזומלי ומשתכפלת באופן עצמאי. פלסמידים קשורים לעתים קרובות לגנים התורמים להישרדותו של אורגניזם ומעניקים יתרונות ספציפיים, למשל עמידות לאנטיביוטיקה. פלסמידים נמצאים בדרך כלל כמולקולות דנ"א עגולות קטנות, דו-גדיליות, בחיידקים; עם זאת, פלסמידים נמצאים לעתים באורגניזמים ארכאיים ואאוקריוטים. פלסמידים הם כלים חשובים בביולוגיה מולקולרית, גנטיקה, ביוכימיה ומדעי החיים. ידועים כווקטורים בהנדסה גנטית, פלסמידים משמשים לשכפול או לביטוי של גנים מסוימים. השינוי הממוקד של וקטור נקרא עיצוב וקטורי.

ניתוח GFP בחקר התאים
חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא סמן ביולוגי רב-תכליתי לניטור תהליכים פיזיולוגיים, הדמיה של לוקליזציה של חלבונים וזיהוי ביטוי מהונדס in vivo. GFP יכול להתרגש מקו הלייזר של 488 ננומטר והוא מזוהה בצורה אופטימלית ב-510 ננומטר.


אולטרסוניקה ביצועים גבוהים! מגוון המוצרים של Hielscher מכסה את הספקטרום המלא מן ultrasonicator המעבדה קומפקטית על יחידות ספסל העליון למערכות אולטראסאונד תעשייתי מלא.

Hielscher אולטרסוניקה מייצרת homogenizers קולי ביצועים גבוהים מ מַעבָּדָה ל גודל תעשייתי.