הכנת דגימה קולית לבדיקות ELISA

בדיקות כגון ELISA נמצאות בשימוש נרחב לאבחון במבחנה, זיהוי חלבונים הקשורים למחלות ובקרת איכות (למשל ניטור אלרגנים במזון). הכנת דגימה קולית היא טכניקה מהירה, אמינה וניתנת לשחזור כדי לבודד תאים ולבודד חלבונים תוך תאיים, DNA, RNA ואברונים. Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות קוליים שונים להכנת נוח של דגימות בודדות, בקבוקונים מרובים, כמו גם עבור לוחות microtiter ו 96 צלחות באר.

אליסה – בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

ELISA מייצג בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים והיא טכניקת ניתוח ביוכימית נפוצה של הקטגוריה של בדיקות קושרות ליגנד. ב- ELISA, דגימה נוזלית מתווספת לשלב מוצק נייח עם תכונות קשירה מיוחדות. בדרך כלל, השלב המוצק הנייח מוחל כציפוי על צלחת באר או צלחת ELISA. לאחר מכן, ריאגנטים נוזליים שונים מתווספים, מודגרים ונשטפים ברצף, כך שלבסוף מתרחש שינוי אופטי (למשל, התפתחות צבע על ידי תוצר של תגובה אנזימטית) בנוזל הסופי בבאר. השינוי האופטי מאפשר למדוד את כמות האנליטה על ידי מה שנקרא כמותי “קריאה". לצורך הקריאה הכמותית, ספקטרופוטומטר, פלואורומטר או לומינומטר משמשים לזיהוי ומדידה של עוצמת האור המשודר. רגישות הזיהוי מושפעת מהגברת האות במהלך התגובות האנליטיות. מכיוון שתגובות אנזימים נחקרות היטב ותהליכי הגברה אמינים, אנזימים משמשים ליצירת האות. האנזימים מקושרים לריאגנטים לגילוי בפרופורציות קבועות כדי לאפשר כימות מדויק, מה שמסביר גם את השם "אנזים מקושר" immunosorbent assay.
מכיוון שמבחני ELISA מבוצעים בצלחות מיקרוטיטר / צלחות 96 באר, היא ידועה כטכניקת בדיקה מבוססת צלחות ומשמשת למשל באבחון קליני במבחנה, מחקר, פיתוח תרופות וכו 'לאיתור וכימות נוגדנים, פפטידים, חלבונים והורמונים.
טכניקת ELISA משמשת לעתים קרובות ככלי אבחון ברפואה, ביוטק, פתולוגיה של צמחים והיא גם מדידת בקרת איכות חשובה בתעשיות רבות.

הכנת דגימה קולית לפני ELISA

לפני שניתן לבצע את בדיקת ELISA, הדגימות דורשות שלבי הכנה כגון ליזה תאית ומיצוי חלבונים תוך תאיים, DNA, RNA וכו '. היתרון של ליזה תאים קוליים ובידוד חלבון הוא יעילות גבוהה, אמינות ויכולת שחזור. כל הגורמים הללו חשובים על מנת להשיג אבחון איכותי ותוצאות מחקר

פרוטוקול עבור Pre-ELISA Ultrasonic Cell Lysis

• לתרביות תאים: לפני ליזה התא קולי, תאי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 270 x גרם במיקרוצנטריפוגה. הסר את supernatant על ידי שאיפה ותאי resuspend ב 30 – 100 μL של חיץ RIPA. לאחר מכן, לדגור את גלולת התא על קרח במשך 30 דקות.
• כעת, דגימת התא מוכנה לליזה קולית:
  השתמש באולטרה-סאונד מסוג בדיקה (למשל, UP200Ht עם בדיקה S26d2) או מכשיר רב-דגימה על-קולי (למשל VialTweeter לסוניק סימולטני של עד 10 בקבוקונים או UIP400MPT לצלחות מיקרוטיטר / צלחות 96 באר) בהתאם לכמות הדגימות שאתה צריך להכין.
  עבור סוניקציה מסוג בדיקה של דגימה אחת, מקם את התאים בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
• הגדר מראש את משך הזמן האולטרסוני, קלט האנרגיה הכולל, מצב מחזור ו / או מגבלות טמפרטורה בתפריט הדיגיטלי של האולטרסוניקטור. זה מבטיח סוניקציה וחזרתיות אמינות ביותר.
• הכנס את הסונוטרוד והפעל את המכשיר העל-קולי. העבר בעדינות את קצה המיקרו של הבדיקה העל-קולית דרך הדגימה כדי לסניק את הדגימה באופן אחיד.
  עבור רוב התאים, ליזה קולית תושלם לאחר 2 -4 מחזורים של סוניקציה של 10 שניות.
• לאחר סוניקציה, להסיר את sonotrode מן הדגימה. הדגימות צריכות להיות מודגרות על קרח במשך 5 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 20 דקות כדי להשליך את הפסולת. מעבירים את הסופרנאטנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. יש לתייג את האנליטים ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
• ניתן לנקות את הסונוטרוד העל-קולי על ידי ניגובו כראוי עם אלכוהול או סוניקט בכד מלא באלכוהול, למשל 70% אתנול. כל בדיקות קולי עשוי טיטניום הם autoclavable.

• שטפו את הרקמה עם PBS קר כקרח (0.01M, pH=7.4) כדי להסיר דם עודף המוליזה ביסודיות.
• שוקלים את הרקמה (כליה, לב, ריאה, טחול וכו ') ומייסרים אותה לחתיכות קטנות, אשר הומוגניות ב- PBS. נפח PBS הנדרש קשור למשקל הרקמה. ככלל אצבע, 1g של רקמה דורש כ. 9mL PBS. מומלץ להוסיף מעכב פרוטאז כלשהו ל- PBS. (ניתן להשתמש לחלופין ב-RIPA או בחיץ ליזה היפוטוני המכיל פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז).
• בהתאם לגודל הרקמה, טיפול מערבולת קצרה (כ 1-2 דקות ב 15 שניות. פולסים) יכול להיות מועיל לטיפול מראש ברקמה.
• הרכיבו מיקרו-טיפ, למשל S26d2, על האולטרסוניקטור שלכם. מניחים את צינור הדגימה עם הרקמה באמבט קרח.
• בצע סוניקציה של הדגימה באמצעות האולטר-סוניקטור, למשל UP200St (משרעת של 80%) למשך דקה אחת במצב פולס (15 שניות על, הפסקה של 15 שניות). שמור את הדגימה באמבט הקרח.
• לאחר מכן ההומוגנטים עוברים צנטריפוגה כדי לקבל מאגרים ספציפיים (ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים או ליזוזומליים) על מנת להעשיר את החלבון לניתוח. על ידי צנטריפוגה של הדגימה במשך 5 דקות ב 5000×g, supernatant מאוחזר.

בקרת טמפרטורה אמינה במהלך סוניקציה

טמפרטורה היא גורם מכריע המשפיע על התהליך וחשוב במיוחד לטיפול בדגימות ביולוגיות, למשל כדי למנוע פירוק תרמי של חלבונים. כמו כל טכניקות הכנת הדגימות המכניות, סוניקציה יוצרת חום. עם זאת, הטמפרטורה של הדגימות יכול להיות נשלט היטב בעת שימוש במכשירי Hielscher Ultrasonics. אנו מציגים בפניך אפשרויות שונות לניטור ושליטה בטמפרטורה של הדגימות שלך תוך כדי הכנתם עם אולטרסאונד מסוג בדיקה או VialTweeter באופן טרום אנליטי.

1. ניטור טמפרטורת המדגם: כל המעבדים האולטרסוניים הדיגיטליים של Hielscher מצוידים בתוכנה חכמה ובחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. חבר את חיישן הטמפרטורה למכשיר העל-קולי (לדוגמה, UP200Ht, UP200ST, VialTweeter, סוניק צלחת רב באר UIP400MTP) והכנס את קצה חיישן הטמפרטורה לאחד מצינורות הדגימה. באמצעות תצוגת מגע צבעונית דיגיטלית, תוכל להגדיר בתפריט של המעבד העל-קולי טווח טמפרטורות ספציפי עבור הסוניקציה לדוגמה שלך. האולטרסאונד יעצור אוטומטית כאשר תגיע לטמפרטורה המקסימלית וישהה עד שטמפרטורת הדגימה תרד לערך הנמוך יותר של הטמפרטורה שנקבעה ∆. ואז הסוניקציה מתחילה שוב באופן אוטומטי. תכונה חכמה זו מונעת התפרקות הנגרמת על ידי חום.
2. לגבי יחידת Multi-sample קולי VialTweeter, בלוק טיטניום, אשר מחזיקים את צינורות הדגימה, יכול להיות מקורר מראש. הכניסו את בלוק VialTweeter (רק הסונוטרוד ללא מתמר!) למקרר או למקפיא כדי לקרר מראש את בלוק הטיטניום עוזר לדחות את עליית הטמפרטורה בדגימה. במידת האפשר, ניתן גם לקרר מראש את הדגימה עצמה.
3. השתמש באמבט קרח או קרח יבש כדי להתקרר במהלך סוניקציה. הניחו את שפופרת הדגימה שלכם במהלך הסוניקציה לתוך אמבט קרח. עבור VialTweeter, השתמש במגש רדוד מלא בקרח יבש והנח את ה- VialTweeter על הקרח היבש כך שהחום יוכל להתפזר במהירות.

לקוחות ברחבי העולם משתמשים באולטרסוניקטורים מסוג Hielscher Probe, כמו גם ביחידות הסוניקציה מרובות הדגימות VialTweeter ו- UIP400MTP לעבודת הכנת הדגימות היומית שלהם במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות, רפואיות וקליניות. התוכנה החכמה ובקרת הטמפרטורה של מעבדי Hielscher, הטמפרטורה נשלטת באופן אמין ונמנעת השפלת מדגם הנגרמת על ידי חום. הכנת מדגם קולי עם פתרונות קוליים Hielscher מספק תוצאות אמינות ביותר לשחזור!
קרא עוד על הסוניקציה בעלת התפוקה הגבוהה באמצעות UIP400MTP הסוניקטור Multi-Well Plate Sonicator למבחנים!