הכנת דגימות באולטרסאונד לבדיקות ELISA

בדיקות כגון ELISA נמצאות בשימוש נרחב לאבחון במבחנה, לזיהוי חלבונים הקשורים למחלות ולבקרת איכות (למשל ניטור אלרגנים במזון). הכנת דגימות באולטרסאונד היא שיטה מהירה, אמינה ובת־שחזור לפירוק תאים ולבידוד חלבונים תוך־תאיים, DNA, RNA ואברונים. Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון פתרונות אולטרסוניים להכנה נוחה של דגימות בודדות, בקבוקונים מרובים וכן פלטות מיקרוטיטר ופלטות בעלות 96 באריות.

ELISA – בדיקת ספיחה אימונולוגית קשורת אנזים

ELISA הם ראשי התיבות באנגלית של בדיקת ספיחה אימונולוגית קשורת אנזים, והיא שיטת אנליזה ביוכימית נפוצה המשתייכת לקטגוריית בדיקות הקישור לליגנד. בבדיקת ELISA מוסיפים דגימה נוזלית לפאזה מוצקה נייחת בעלת תכונות קישור מיוחדות. בדרך כלל, הפאזה המוצקה הנייחת מיושמת כציפוי על פלטת באריות או על פלטת ELISA. לאחר מכן מוסיפים בזה אחר זה ריאגנטים נוזליים שונים, מדגירים ושוטפים, כך שבסופו של דבר מתרחש שינוי אופטי (למשל התפתחות צבע כתוצאה מתוצר של תגובה אנזימטית) בנוזל הסופי שבבארית. השינוי האופטי מאפשר למדוד את כמות האנליט באמצעות מה שמכונה "קריאה" כמותית. לצורך הקריאה הכמותית משתמשים בספקטרופוטומטר, בפלואורומטר או בלומינומטר לזיהוי ולמדידה של עוצמת האור העובר. רגישות הזיהוי מושפעת מהגברת האות במהלך התגובות האנליטיות. מכיוון שתגובות אנזימטיות הן תהליכי הגברה שנחקרו היטב ונמצאו אמינים, משתמשים באנזימים ליצירת האות. האנזימים מקושרים לריאגנטים המשמשים לזיהוי ביחסים קבועים כדי לאפשר כימות מדויק, ומכאן גם השם בדיקת ספיחה אימונולוגית "קשורת אנזים".
מכיוון שבדיקות ELISA מבוצעות בפלטות מיקרוטיטר / פלטות בעלות 96 באריות, השיטה מוכרת כשיטת בדיקה מבוססת פלטות ומשמשת, למשל, באבחון קליני במבחנה, במחקר, בפיתוח תרופות וכדומה, לזיהוי ולכימות של נוגדנים, פפטידים, חלבונים והורמונים.
שיטת ELISA משמשת לעיתים קרובות ככלי אבחוני ברפואה, בביוטכנולוגיה ובפתולוגיה של צמחים, והיא גם אמצעי מדידה חשוב לבקרת איכות בתעשיות רבות.

הכנת דגימות באולטרסאונד לפני ELISA

לפני שניתן לבצע את בדיקת ELISA, הדגימות דורשות שלבי הכנה כגון פירוק תאים והפקת חלבונים תוך־תאיים, DNA, RNA וכדומה. היתרון של פירוק תאים ובידוד חלבונים באולטרסאונד הוא היעילות הגבוהה, האמינות ויכולת השחזור. כל הגורמים הללו חשובים לקבלת אבחון ותוצאות מחקר באיכות גבוהה

פרוטוקול לפירוק תאים באולטרסאונד לפני ELISA

• לתרביות תאים: לפני פירוק התאים באולטרסאונד, יש לסרכז את התאים במשך 5 דקות ב־270 x g במיקרוצנטריפוגה. יש להסיר את הנוזל העליון בשאיבה ולהרחיף מחדש את התאים ב־30 – 100 μL של בופר RIPA. לאחר מכן יש להדגיר את משקע התאים על קרח במשך 30 דקות.
• כעת דגימת התאים מוכנה לפירוק באולטרסאונד:
  יש להשתמש במכשיר אולטרסוני מסוג גשוש (למשל UP200Ht עם גשוש S26d2) או במכשיר אולטרסוני לטיפול בדגימות מרובות (למשל VialTweeter לסוניקציה בו־זמנית של עד 10 בקבוקונים או UIP400MPT לפלטות מיקרוטיטר / פלטות בעלות 96 באריות), בהתאם למספר הדגימות שיש להכין.
  לסוניקציה של דגימה בודדת באמצעות גשוש, יש להכניס את התאים למבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.
• יש להגדיר מראש בתפריט הדיגיטלי של המכשיר האולטרסוני את משך הטיפול באולטרסאונד, את סך האנרגיה המושקעת, את מצב המחזור ו/או את גבולות הטמפרטורה. כך מובטחות סוניקציה אמינה ביותר וחזרתיות.
• הכניסו את הסונוטרודה והפעילו את המכשיר האולטרסוני. הניעו בעדינות את קצה המיקרו של הגשוש האולטרסוני בתוך הדגימה כדי לבצע סוניקציה אחידה של הדגימה.
  ברוב סוגי התאים, הליזיס האולטרסוני יושלם לאחר 2–4 מחזורים של סוניקציה במשך 10 sec.
• לאחר הסוניקציה, הוציאו את הסונוטרודה מהדגימה. יש להדגיר את הדגימות על קרח במשך 5 min. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגה ב-10,000 x g במשך 20 min כדי לשקע את שברי התאים. העבירו את הנוזלים העליונים למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה. סמנו את האנליטים ואחסנו ב-‎-20°C.
• ניתן לנקות את הסונוטרודה האולטרסונית באמצעות ניגוב יסודי באלכוהול או באמצעות סוניקציה בכוס מעבדה מלאה באלכוהול, למשל אתנול בריכוז 70%. ניתן לעקר באוטוקלב את כל הגשושים האולטרסוניים העשויים מטיטניום.

• שטפו את הרקמה ב-PBS קר כקרח (0.01M, pH=7.4) כדי להסיר ביסודיות את עודפי הדם שעבר המוליזה.
• שקלו את הרקמה (כליה, לב, ריאה, טחול וכו') ופוררו אותה לחתיכות קטנות, שאותן יש להעביר הומוגניזציה ב-PBS. נפח ה-PBS הדרוש תלוי במשקל הרקמה. ככלל אצבע, עבור 1g של רקמה נדרשים כ-9mL של PBS. מומלץ להוסיף ל-PBS מעכב פרוטאז כלשהו. (לחלופין, ניתן להשתמש ב-RIPA או בבופר ליזיס היפוטוני המכיל תערובת של מעכבי פרוטאז ופוספטאז.)
• בהתאם לגודל הרקמה, טיפול קצר בוורטקס (כ-1–2 min בפולסים של 15 sec) עשוי לסייע בטיפול המקדים ברקמה.
• הרכיבו קצה מיקרו, למשל S26d2, על המכשיר האולטרסוני. הניחו את מבחנת הדגימה המכילה את הרקמה באמבט קרח.
• בצעו סוניקציה של הדגימה באמצעות המכשיר האולטרסוני, למשל UP200St (משרעת של 80%), במשך 1 min במצב פולסים (15sec הפעלה, 15sec הפסקה). השאירו את הדגימה באמבט הקרח.
• לאחר מכן, ההומוגנטים עוברים צנטריפוגה לקבלת מקטעים ספציפיים (ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים או ליזוזומליים), כדי להעשיר את החלבון לצורך האנליזה. לאחר צנטריפוגה של הדגימה במשך 5 דקות ב-5000×g, אוספים את הנוזל העליון.

בקרת טמפרטורה אמינה במהלך סוניקציה

הטמפרטורה היא גורם מכריע המשפיע על התהליך, והיא חשובה במיוחד בטיפול בדגימות ביולוגיות, למשל למניעת פירוק תרמי של חלבונים. כמו כל השיטות המכניות להכנת דגימות, סוניקציה מייצרת חום. עם זאת, ניתן לשלוט היטב בטמפרטורת הדגימות בעת שימוש במכשירי Hielscher Ultrasonics. אנו מציגים בפניכם אפשרויות שונות לניטור ולבקרה של טמפרטורת הדגימות במהלך הכנתן לפני האנליזה באמצעות מכשיר אולטרסוני מסוג גשוש או באמצעות VialTweeter.

1. ניטור טמפרטורת הדגימה: כל המעבדים האולטרסוניים הדיגיטליים של Hielscher מצוידים בתוכנה חכמה ובחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. חברו את חיישן הטמפרטורה למכשיר האולטרסוני (למשל, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP) והכניסו את קצה חיישן הטמפרטורה לאחת ממבחנות הדגימה. באמצעות צג מגע דיגיטלי צבעוני, תוכלו להגדיר בתפריט המעבד האולטרסוני טווח טמפרטורה ספציפי לסוניקציה של הדגימה. המכשיר האולטרסוני יעצור אוטומטית כאשר הטמפרטורה תגיע לערך המרבי, וישהה את הפעולה עד שטמפרטורת הדגימה תרד לערך התחתון של הטמפרטורה המוגדרת ∆. לאחר מכן הסוניקציה תתחיל שוב באופן אוטומטי. תכונה חכמה זו מונעת פירוק הנגרם מחום.
2. ביחידה האולטרסונית לטיפול בדגימות מרובות VialTweeter, ניתן לקרר מראש את גוש הטיטניום המחזיק את מבחנות הדגימה. הכניסו את גוש ה-VialTweeter (רק את הסונוטרודה ללא המתמר!) למקרר או למקפיא כדי לקרר מראש את גוש הטיטניום ולסייע בעיכוב עליית הטמפרטורה בדגימה. אם אפשר, ניתן לקרר מראש גם את הדגימה עצמה.
3. השתמשו באמבט קרח או בקרח יבש לקירור במהלך הסוניקציה. הניחו את מבחנות הדגימה באמבט קרח במהלך הסוניקציה. עבור VialTweeter, השתמשו במגש רדוד מלא בקרח יבש והניחו את VialTweeter על הקרח היבש כדי שהחום יוכל להתפזר במהירות.

לקוחות ברחבי העולם משתמשים במכשירים האולטרסוניים של Hielscher המצוידים בגשושית, וכן ביחידות הסוניקציה למספר דגימות VialTweeter ו-UIP400MTP, להכנת הדגימות היומיומית שלהם במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות, רפואיות וקליניות. באמצעות התוכנה החכמה ובקרת הטמפרטורה של המעבדים של Hielscher, הטמפרטורה מבוקרת באופן אמין ונמנעת התפרקות של הדגימות עקב חום. הכנת דגימות אולטרסונית באמצעות הפתרונות האולטרסוניים של Hielscher מספקת תוצאות אמינות ביותר וניתנות לשחזור!
קראו עוד על סוניקציה בתפוקה גבוהה באמצעות מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP לבדיקות!