תסכולות כגון ELISA נמצאות בשימוש נרחב לאבחון במבחנה, זיהוי חלבונים הקשורים למחלות ובקרת איכות (למשל ניטור אלרגנים למזון). הכנת מדגם אולטראסוניות היא טכניקה מהירה, אמינה וניתנת לשחזור כדי לריס תא ולבודד חלבונים תאיים, DNA, RNA ו organelles. Hielscher אולטרסוניקה מציעה פתרונות אולטרה סאונד שונים עבור הכנה נוחה של דגימות יחיד, בקבוקונים מרובים, כמו גם עבור לוחות microtiter ו 96-well צלחות.

אליסה – אנזים מקושר תסה אימונוסורבנט

ELISA מייצגת אנזים מקושר תסאגת אימונוסורבנט, היא טכניקת ניתוח ביוכימית בשימוש נרחב של הקטגוריה של רצועות ליגנד מחייב. ב- ELISA, מדגם נוזלי מתווסף לשלב מוצק נייח עם מאפייני איגוד מיוחדים. בדרך כלל, שלב מוצק נייח מוחל כמו ציפוי על צלחת היטב או צלחת ELISA. לאחר מכן, ריאגנטים נוזליים שונים מתווספים באופן רצף, דגירה, ושטף, כך שלבסוף שינוי אופטי (למשל, פיתוח צבע על ידי המוצר של תגובה אנזימטית) מתרחש בנוזל הסופי בבאר. השינוי האופטי מאפשר למדוד את כמות האנליטית על-ידי מה שנקרא כמותית “"קורא". לקריאה כמותית, ספקטרופוטומטר, פלואורומטר או מד לומינומטר משמש כדי לזהות ולמדוך את עוצמת האור המשודר. רגישות הגילוי מושפעת מההגברה של האות במהלך התגובות האנליטיות. מאז תגובות אנזימים נחקרים היטב ותהליכים אמין ההגדלה, אנזימים משמשים כדי ליצור את האות. האנזימים מקושרים לריגנטים זיהוי בפרופורציות קבועות כדי לאפשר כימות מדויקת, מה שמסביר גם את השם "אנזים מקושר" esmunosorbent.
כמו ELISA assays מבוצעים צלחות microtiter / 96-גם צלחות, זה ידוע בשם טכניקת תסה מבוססת צלחת והוא משמש למשל באבחון קליני במבחנה, מחקר, פיתוח תרופות וכו 'לאיתור וכימות נוגדנים, פפטידים, חלבונים, והורמונים.
טכניקת ELISA משמשת לעתים קרובות ככלי אבחון ברפואה, ביוטכנולוגיה, פתולוגיה של צמחים והיא גם מדידה חשובה לבקרת איכות בתעשיות מרובות.

הכנה מדגם אולטראסוניות לפני ELISA

לפני ניתן לבצע את ה-ELISA, הדגימות דורשות שלבים של הכנה כגון ליזיס תאים וחילוץ של חלבונים תאיים, DNA, RNA וכו '. היתרון של lysis תא אולטראסוניות ובידוד חלבון הוא יעילות גבוהה שלה, אמינות ורבייה. כל הגורמים הללו חשובים על מנת לקבל תוצאות אבחון ומחקר באיכות גבוהה

פרוטוקול עבור תסיסה תא אולטראסוניות טרום ELISA

• עבור תרבויות תאים: לפני lysis תא אולטראסוניות, תאי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 270 x g במיקרוצנטריפוגה. הסר את supernatant על ידי שאיפה ותאים resuspend ב 30 – 100 μL של מאגר RIPA. לאחר מכן, דגירה את גלולת התא על קרח במשך 30 דקות.
• עכשיו, דגימת התא מוכנה לליזה אולטראסוניות:
  השתמש אולטראסוניות מסוג בדיקה (למשל. Uf200 ः t עם בדיקה S26d2) או מכשיר רב מדגם אולטראסוניות (למשל VialTweeter עבור sonication בו זמנית של עד 10 בקבוקונים או UIP400MPT עבור לוחות microtiter / 96-well צלחות) בהתאם לכמות הדגימות שאתה צריך להכין.
  עבור sonication מסוג בדיקה של מדגם יחיד, למקם את התאים בצינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge.
• הגדר מראש משך אולטראסוניות שלך, קלט אנרגיה כוללת, מצב מחזור ו / או מגבלות טמפרטורה בתפריט הדיגיטלי של ultrasonicator. זה מבטיח sonication אמין מאוד ויכולת חזרה.
• להדליק את sonotrode ולהחליף את המכשיר אולטראסוניות על. בעדינות להעביר את הקצה הזעיר של בדיקה אולטראסוניות דרך המדגם כדי sonicate את המדגם באופן אחיד.
  עבור רוב התאים, פירוק אולטראסוניות יושלם לאחר 2 -4 מחזורים של 10 שניות sonication.
• לאחר sonication, להסיר את sonotrode מהדגימה. הדגימות צריכות להיות מדגירה על קרח במשך 5 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 20 דקות כדי גלולות ההריסות. להעביר את supernatants לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. תייג את האנליטים ואחסן ב- -20°C.
• sonotrode אולטראסוניות ניתן לנקות על ידי ניגוב אותו כראוי עם אלכוהול או sonicate בבקת מלאה באלכוהול, למשל 70% אתנול. כל בדיקות אולטראסוניות עשוי טיטניום הם autoclavable.

• לשטוף את הרקמה עם PBS קר כקרח (0.01M, pH = 7.4) כדי להסיר דם המוליזה עודף ביסודיות.
• לשקול את הרקמה (כליות, לב, ריאות, טחול וכו ') וmacerate אותו לחתיכות קטנות, אשר הומוגניים PBS. נפח PBS הנדרש קשור למשקל הרקמה. ככלל אצבע, 1g של רקמה דורש כ. 9mL PBS. מומלץ להוסיף כמה מעכב פרוטאז PBS. (RIPA או מאגר ליזה היפוטונית המכיל פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז יכול לשמש לחילופין.)
• בהתאם לגודל הרקמה, טיפול מערבולת קצר (כ 1-2 דקות ב 15 שניות. פולסים) יכול להיות מועיל כדי לטפל מראש את הרקמה.
• הר מיקרו-קצה, למשל S26d2, כדי ultrasonicator שלך. מניחים את צינור הדגימה עם הרקמה באמבט קרח.
• Sonicate את הדגימה עם ultrasonicator שלך, למשל UP200St (80% משרעת) במשך 1 דקות במצב דופק (15sec on, 15sec הפסקה). שמור את הדגימה באמבטיית הקרח.
• לאחר מכן, ההומוגנאטים צנטריפוגים כדי להשיג בריכות ספציפיות (ציטוסולית, גרעינית, מיטוכונדריאלית או ליזומלית) כדי להעשיר את החלבון לניתוח. על ידי צנטריפוגה הדגימה במשך 5 דקות ב 5000×g, supernatant מאוחזר.

בקרת טמפרטורה אמינה במהלך Sonication

הטמפרטורה היא גורם חיוני המשפיע על תהליך שחשוב במיוחד לטיפול בדגימות ביולוגיות, למשל כדי למנוע השפלה תרמית של חלבונים. כמו כל טכניקות הכנת מדגם מכני, sonication יוצר חום. עם זאת, הטמפרטורה של הדגימות ניתן לשלוט היטב בעת שימוש מכשירי אולטרסוניקה Hielscher. אנו מציגים בפניכם אפשרויות שונות כדי לפקח ולשלוט בטמפרטורה של הדגימות שלך תוך הכנתם עם ultrasonicator מסוג בדיקה או VialTweeter טרום אנליטית.

1. ניטור טמפרטורת המדגם: כל מעבדי אולטראסוניות דיגיטלי Hielscher מצוידים בתוכנה חכמה חיישן טמפרטורה לחיבור. חבר את חיישן הטמפרטורה להתקן אולטראסוניות (למשל, Uf200 ः t, בית Seating, VialTweeterUIP400MTP) והכנס את קצה חיישן הטמפרטורה באחד מצינורות הדגימה., באמצעות תצוגת מגע צבעונית דיגיטלית, אתה יכול להגדיר בתפריט של המעבד אולטראסוניות טווח טמפרטורה ספציפי עבור sonication המדגם שלך. ultrasonicator יעצור באופן אוטומטי כאשר הטמפרטורה המקסימלית מגיעה להשהות עד הטמפרטורה המדגם הוא למטה לערך הנמוך יותר של הטמפרטורה להגדיר ∆. ואז sonication מתחיל באופן אוטומטי שוב. תכונה חכמה זו מונעת השפלה הנגרמת על-ידי חום.
2. לגבי יחידת אולטראסוניות מרובה מדגם VialTweeter, בלוק טיטניום, אשר מחזיקים את צינורות הדגימה, ניתן לקרר מראש. לשים את בלוק VialTweeter (רק sonotrode ללא מתמר!) לתוך המקרר או המקפיא כדי לקרר מראש את בלוק טיטניום עוזר לדחות את עליית הטמפרטורה במדגם. אם הדבר אפשרי, הדגימה עצמה יכולה להיות מקוררת מראש מדי.
3. השתמשו באמבט קרח או בקרח יבש כדי להתקרר במהלך ההתרה. מניחים את הצינורים לדוגמה במהלך sonication לתוך אמבט קרח. עבור VialTweeter, השתמש במגש רדוד מלא קרח יבש והניח את VialTweeter על הקרח היבש, כך שהחום יכול להתפוגג במהירות.

לקוחות ברחבי העולם להשתמש Hielscher בדיקה-ultrasonicators, כמו גם את יחידות sonication מרובה מדגם VialTweeter ו UIP400MTP עבור עבודת הכנת המדגם היומי שלהם במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות, רפואיות וקליניות. התוכנה החכמה ובקרת הטמפרטורה של מעבדי Hielscher, הטמפרטורה נשלטת באופן אמין והשפלה מדגם המושרה בחום נמנעה. הכנת מדגם אולטראסוניות עם פתרונות אולטרה סאונד Hielscher מספק תוצאות אמינות מאוד לשחזור!