ליזיס אולטרסוני של דגימות Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster משמשת בהיקף נרחב כאורגניזם מודל במעבדות. לכן יש לבצע לעיתים קרובות שלבי הכנה קדם־אנליטיים כגון ליזיס, פירוק תאים, מיצוי חלבונים וגזירת DNA בדגימות Drosophila melanogaster. מכשירי פירוק אולטרסוניים הם אמינים ויעילים, וניתן להשתמש בהם לביצוע מגוון משימות כגון ליזיס, מיצוי חלבונים או קיטוע DNA בקלות, באמצעות התאמת פרמטרי התהליך האולטרסוני בלבד. הומוגנייזרים אולטרסוניים הם אפוא כלים גמישים בעלי מגוון רחב של יישומים.

ליזיס אולטרסוני ומיצוי חלבונים

ליזיס, המסה של תאים, הומוגניזציה של רקמות ומיצוי חלבונים הם משימות אופייניות למכשירי פירוק אולטרסוניים במעבדות ביולוגיות. מכשירי פירוק אולטרסוניים ומכשירים לפירוק תאים מתאימים היטב להומוגניזציה של רקמות בעלי חיים, חרקים (למשל Drosophila melanogaster, C. elegans) או דגימות צמחים. יישומים נוספים של טיפול אולטרסוני הם ליזיס של תרחיפי תאים ומשקעים, וכן מיצוי חלבונים תוך־תאיים.
ליזיס אולטרסוני ומיצוי חלבונים הם תהליכים אמינים ביותר וניתנים לשחזור, שאפשר לבצע על בסיס פרוטוקולים מבוססים. מכיוון שניתן להתאים במדויק את עוצמת התהליך האולטרסוני באמצעות פרמטרי סוניקציה כגון אמפליטודה, מצב מחזור / פעימות, טמפרטורה ונפח הדגימה, אפשר לחזור שוב ושוב על פרוטוקולים שהוכחו ולקבל את אותה התוצאה.

קיטוע אולטרסוני של DNA ו־RNA

לאחר ליזיס של תאים ומיצוי חלבונים, שלב נפוץ הנדרש בהכנת דגימות הוא גזירה וקיטוע של DNA, RNA וכרומטין, למשל לפני אימונופרסיפיטציה של כרומטין (ChIP). ניתן להשיג קיטוע אמין של DNA ו־RNA באמצעות שבירת הקשרים הקוולנטיים המחזיקים את ה־DNA יחד בעזרת כוחות פיזיקליים. בשימוש בגזירה פיזיקלית כגון סוניקציה, תחילה נשברים גדילי ה־DNA, ולאחר מכן ה־DNA מקוטע לחלקים קטנים יותר.
קיטוע אולטרסוני של DNA הוא אמין ויעיל בגזירת DNA לאורך יעד, למשל 500bp (זוגות בסיסים). היתרונות העיקריים של קיטוע אולטרסוני של DNA כוללים שליטה מדויקת בפרמטרי התהליך האולטרסוני ובעוצמתו. ניתן להתאים את פרמטרי התהליך האולטרסוני באמצעות כוונון מדויק של עוצמת הסוניקציה, המחזורים והזמן. כך אפשר ליצור DNA בגדלים הרצויים, ולהפיק באופן אמין את אורך ה־DNA המבוקש וכן לשחזרו. גזירה אולטרסונית של DNA אידאלית גם ליצירת מקטעי DNA בעלי משקל מולקולרי גבוה.

פרוטוקולים לליזיס אולטרסוני של Drosophila melanogaster

להלן פרוטוקולים שונים לליזיס, למיצוי חלבונים ולקיטוע DNA או כרומטין בדגימות Drosophila בסיוע אולטרסאונד.

ליזיס אולטרסוני לבדיקת אימונופרסיפיטציה בקישור צולב (CLIP)

בדיקת CLIP בוצעה כפי שדווח בעבר, עם כמה שינויים. כ־20 mg של שחלות מנקבות מטיפוס הבר בנות 0 עד 1 ימים עברו קישור צולב באמצעות UV ‏(3 × 2000 μJ/cm2), הומוגניזציה על קרח ב־1 mL של בופר RCB ‏(50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM סוכרוז, 1 mM DTT, 1× מעכבי פרוטאזות Complete ללא EDTA, 1 mM PMSF) בתוספת 300 U RNAseOUT, והונחו על קרח למשך 30 min. ההומוגנט עבר סוניקציה על קרח בהספק של 80%, חמש פעמים בפעימות של 20 s עם מנוחה של 60 s ביניהן, באמצעות המעבד האולטרסוני של Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) ועבר צנטריפוגה (16,000 × g למשך 5 min בטמפרטורה של 4°C). התמצית המסיסה עברה ניקוי מקדים באמצעות 20 μl של חרוזי Protein-G dynabeads למשך 20 min בטמפרטורה של 4°C. לאחר נטילת דגימות לתספיג אימונולוגי ולכימות ה-RNA ההתחלתי (1%), בוצע שיקוע אימוני של HP1 באמצעות הנוגדן anti-HP1 9A9 מתוך 450 μl של תמצית שעברה ניקוי מקדים, באמצעות הדגרה למשך 4 h עם 50 μl של חרוזי Protein-G dynabeads. המשקעים האימוניים נשטפו 4 פעמים ב-RCB. כדי לשחרר באלוציה את מולקולות ה-RNA ששוקעו בשיקוע אימוני, החרוזים ששוקעו הורתחו ב-100 μL של מים מסוג UltraPure שטופלו ב-DEPC למשך 5 min. לנוזל העליון שנאסף לצורך הכנת RNA נוספו 900 μL של ריאגנט Qiazol. ה-RNA שטוהר שימש כתבנית לסינתזת cDNA באמצעות oligo dT, הקסמרים אקראיים והאנזים SuperScript reverse transcriptase III, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
(Cassale et al. 2019)

ליזיס אולטרסוני לבדיקת שיקוע אימוני של כרומטין

שיקוע אימוני של כרומטין בוצע לפי השיטה שתוארה על ידי Menet, בשינויים קלים. כ-20 mg של שחלות מנקבות מזן הבר בנות 0–1 ימים עברו הומוגניזציה ב-1 mL של בופר NEB ‏(10 mM HEPES-Na ב-pH 8.0, ‏10 mM NaCl, ‏0.1 mM EGTA-Na ב-pH 8, ‏0.5 mM EDTA-Na ב-pH 8, ‏1 mM DTT, ‏0.5% NP-40, ‏0.5 mM ספרמידין, 0.15 mM ספרמין, 1× מעכבי פרוטאז Complete ללא EDTA) באמצעות הומוגנייזר / דיספרסר טבילה למשך 1 min (ב-3000 rpm). ההומוגנט הועבר להומוגנייזר Dounce מזכוכית שקורר מראש, ובוצעו 15 מהלכים מלאים באמצעות עלי בעל התאמה הדוקה. לאחר מכן הגרעינים החופשיים עברו צנטריפוגה ב-6000xg למשך 10 min בטמפרטורה של 4°C. המשקעים שהכילו את הגרעינים הורחפו מחדש ב-1 mL של NEB ועברו צנטריפוגה ב-20,000 × g למשך 20 min על גרדיאנט סוכרוז (0.65 mL של סוכרוז בריכוז 1.6 M ב-NEB, ‏0.35 mL של סוכרוז בריכוז 0.8 M ב-NEB). המשקע הורחף מחדש ב-1 mL של NEB ובפורמלדהיד בריכוז סופי של 1%. הגרעינים עברו צילוב למשך 10 min בטמפרטורת החדר, ותגובת הצילוב נעצרה באמצעות הוספת 1/10 מהנפח של גליצין בריכוז 1.375 M. הגרעינים נאספו באמצעות צנטריפוגה ב-6000 × g למשך 5 min. הגרעינים נשטפו פעמיים ב-1 mL של NEB והורחפו מחדש ב-1 mL של בופר ליזיס (15 mM HEPES-Na ב-pH 7.6, ‏140 mM NaCl, ‏0.5 mM EGTA, ‏1 mM EDTA ב-pH 8, ‏1% Triton X-100, ‏0.5 mM DTT, ‏0.1% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, ‏0.5% N-lauroylsarcosine ו-1× מעכבי פרוטאז Complete ללא EDTA). הגרעינים עברו סוניקציה באמצעות מעבד אולטרסוני של Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) שש פעמים, בכל פעם 20 s של הפעלה ו-1 min על קרח. הגרעינים שעברו סוניקציה עברו צנטריפוגה ב-13,000 × g למשך 4 min בטמפרטורה של 4°C. רוב הכרומטין שעבר סוניקציה היה באורך של 500 עד 1000 זוגות בסיסים (bp). לכל שיקוע אימוני הודגרו 15 μg של כרומטין בנוכחות 10 μg של הנוגדן החד-שבטי HP1 9A9 ‏(3 h בטמפרטורה של 4°C בגלגל מסתובב). לאחר מכן נוספו 50 μl של חרוזי dynabeads protein G וההדגרה נמשכה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. הנוזלים העליונים סולקו והדגימות נשטפו פעמיים בבופר ליזיס (כל שטיפה למשך 15 min בטמפרטורה של 4 °C) ופעמיים בבופר TE ‏(1 mM EDTA, ‏10 mM TrisHCl ב-pH 8). הכרומטין שוחרר מהחרוזים באלוציה בשני שלבים; תחילה ב-100 μl של בופר אלוציה 1 (10 mM EDTA, ‏1% SDS, ‏50 mM TrisHCl ב-pH 8) בטמפרטורה של 65°C למשך 15 min, ולאחר מכן בוצעו צנטריפוגה ואיסוף הנוזל העליון. החומר שעל החרוזים מוצה שוב ב-100 μl של TE + 0.67% SDS. האלואט המאוחד (200 μl) הודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 65°C כדי לפרק את קשרי הצילוב, וטופל ב-50 μg/ml RNaseA למשך 15 min בטמפרטורה של 65°C וב-500 μg/ml Proteinase K למשך 3 h בטמפרטורה של 65°C. הדגימות עברו מיצוי בפנול–כלורופורם ושיקוע באתנול. ה-DNA הורחף מחדש ב-25 μl של מים. כדי למקסם את האנליזות המולקולריות באמצעות ה-DNA ששוקע בשיקוע אימוני, גנים מועמדים הוגברו בזוגות באמצעות פרוטוקול duplex-PCR ממוטב, תוך שימוש בשתי ערכות שונות של תחלים בעלי טמפרטורות התכה דומות בתגובה אחת.
(Casale et al. 2019)
 

מכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים בביצועים גבוהים עבור דגימות ביולוגיות

Hielscher Ultrasonics היא השותפה עתירת הניסיון שלכם בכל הנוגע למכשירים אולטרסוניים עתירי ביצועים לפירוק תאים, ליזיס, מיצוי חלבונים, פרגמנטציה של DNA, RNA וכרומטין וכן לשלבים אחרים בהכנת דגימות לפני אנליזה. עם מגוון מקיף של הומוגנייזרים אולטרסוניים למעבדה ויחידות להכנת דגימות, ל-Hielscher יש המכשיר האולטרסוני האידיאלי ליישום הביולוגי ולדרישות שלכם.
מכשיר אולטרסוני קלאסי מסוג גשוש עם קצה זעיר, כגון UP200St (200W; ראו תמונה משמאל), או אחת מיחידות הכנת הדגימות האולטרסוניות VialTweeter או UP200ST_TD_CupHorn עם VialHolder הם דגמים מועדפים במעבדות מחקר ואנליזה. הגשוש האולטרסוני הקלאסי אידיאלי כאשר יש לבצע ליזיס, מיצוי או פרגמנטציה במספר קטן יותר של דגימות. יחידות הכנת הדגימות VialTweeter ו-UP200St_TD_CupHorn מאפשרות סוניקציה בו-זמנית של עד 10 או 5 בקבוקונים, בהתאמה.
אם יש לעבד מספר רב של דגימות (למשל פלטות בעלות 96 באריות, פלטות מיקרוטיטר וכו'), UIP400MTP הוא מערך הסוניקציה האידיאלי. UIP400MTP פועל כמו cuphorn גדול יותר, הממולא במים ויש בו די מקום להכיל פלטות מיקרו-באריות. UIP400MTP מופעל באמצעות מעבד אולטרסוני רב-עוצמה בהספק של 400 ואט ומספק סוניקציה אחידה מאוד ואינטנסיבית של פלטות מרובות באריות לצורך פירוק תאים, ליזיס של דגימות, המסה של משקעים, מיצוי חלבונים או גזירת DNA.

בקרה מדויקת באמצעות תוכנה חכמה

כל פתרונות הסוניקציה של Hielscher בהספק של 200 ואט ומעלה מצוידים במסך מגע דיגיטלי צבעוני ובתוכנה חכמה. באמצעות תיעוד הנתונים החכם, כל הפרמטרים של התהליך האולטרסוני נשמרים אוטומטית בקובץ CSV בכרטיס SD מובנה מיד עם הפעלת המכשיר האולטרסוני. כך המחקר והתיעוד נעשים נוחים הרבה יותר. לאחר ניסויי הסוניקציה או הכנת הדגימות, תוכלו לעיין בקלות בפרמטרי הסוניקציה של כל הרצה ולהשוות ביניהם.
באמצעות התפריט האינטואיטיבי ניתן להגדיר מראש פרמטרים רבים לפני הסוניקציה: למשל, כדי לשלוט בטמפרטורת הדגימה ולמנוע את פירוקה התרמי, ניתן להגדיר גבול עליון לטמפרטורת הדגימה. חיישן טמפרטורה הניתן לחיבור, המסופק עם היחידה האולטרסונית, מספק למעבד האולטרסוני משוב על טמפרטורת הסוניקציה בפועל. כאשר הטמפרטורה מגיעה לגבול העליון, המכשיר האולטרסוני משהה את פעולתו עד שהטמפרטורה מגיעה לגבול התחתון של ∆T שהוגדר, ואז מחדש את הסוניקציה באופן אוטומטי.
אם נדרשת סוניקציה עם תשומת אנרגיה מסוימת, תוכלו להגדיר מראש את האנרגיה האולטרסונית הסופית של הרצת הסוניקציה. כמובן, ניתן גם להגדיר בנפרד פעימות אולטרסוניות ומצב מחזורי.
כדי להשתמש שוב בפרמטרי הסוניקציה המוצלחים ביותר שלכם, תוכלו לשמור מצבי סוניקציה שונים (למשל זמן סוניקציה, עוצמה, מצב מחזורי וכו') כמצבים מוגדרים מראש, כך שניתן יהיה להפעילם שוב בקלות ובמהירות.
לנוחות תפעולית רבה יותר, ניתן להפעיל את כל היחידות האולטרסוניות הדיגיטליות באמצעות שליטה מרחוק דרך כל דפדפן נפוץ (למשל InternetExplorer, Safari, Chrome וכו'). חיבור ה-LAN מבוסס על התקנה פשוטה בשיטת חבר והפעל ואינו דורש התקנת תוכנה נוספת.
אנו ב-Hielscher יודעים שסוניקציה מוצלחת של דגימות ביולוגיות דורשת דיוק וחזרתיות. לכן תכננו את המכשירים האולטרסוניים שלנו כמכשירים חכמים עם כל התכונות המאפשרות הכנת דגימות יעילה, אמינה, ניתנת לשחזור ונוחה.

הטבלה שלהלן מספקת אומדן של כושר העיבוד המשוער של המערכות האולטרסוניות שלנו, החל בקצוות אולטרסוניים זעירים ובהומוגנייזרים אולטרסוניים קלאסיים ועד למכשירים אולטרסוניים מסוג MultiSample להכנה נוחה ואמינה של דגימות רבות: