ליזה קולית של דגימות Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster נמצא בשימוש נרחב במעבדות כאורגניזם מודל. לכן, יש לבצע לעתים קרובות שלבי הכנה טרום אנליטיים כגון ליזה, שיבוש תאים, מיצוי חלבונים וגזירת DNA של דגימות Drosophila melanogaster. ממברטורים קוליים הם אמינים ויעילים וניתן להשתמש בהם לביצוע משימות שונות כגון ליזיס, מיצוי חלבונים או פיצול DNA בנחת על ידי התאמת פרמטרים של תהליך קולי בלבד. הומוגנייזרים קוליים הם לפיכך כלים גמישים עם מגוון רחב של יישומים.

ליזה קולית ומיצוי חלבונים

ליזיס, מסיסות תאים, הומוגניזציה של רקמות ומיצוי חלבונים הן משימות אופייניות עבור dismembrators קולי במעבדות ביולוגיות. מפרקים על-קוליים ומשבשי תאים מתאימים היטב להומוגניזציה של רקמות בעלי חיים, חרקים (למשל, Drosophila melanogaster, C. elegans) או דגימות צמחים. יישומים הבאים של ultrasonication הם lysis של תאים השעיות כדורים, כמו גם מיצוי של חלבונים תאיים.
ליזה קולית ומיצוי חלבונים הם תהליכים אמינים ביותר הניתנים לשחזור, אשר יכולים להתבצע על בסיס פרוטוקולים שנקבעו. מכיוון שניתן לכוונן בדיוק את עוצמת התהליך העל-קולי באמצעות פרמטרים של סוניקציה כגון משרעת, מצב מחזור / פולס, טמפרטורה ונפח דגימה, לאחר שהוכחו ניתן לחזור על פרוטוקולים עם אותה תוצאה שוב ושוב.

פיצול DNA ו-RNA על-קולי

לאחר ליזה של תאים ומיצוי חלבונים, שלב נדרש נפוץ בהכנת הדגימה הוא גזירה ופיצול של DNA, RNA וכרומטין, למשל לפני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP). פיצול דנ"א ורנ"א יכול להיות מושג באופן אמין על ידי שבירת הקשרים הקוולנטיים שמחזיקים את הדנ"א יחד על ידי כוחות פיזיקליים. באמצעות גזירה פיזית כגון סוניקציה, בהתחלה גדילי הדנ"א נשברים, ואז הדנ"א מפוצל לחתיכות קטנות יותר.
פיצול דנ"א על-קולי הוא אמין ויעיל בחיתוך DNA לאורך ממוקד, למשל 500bp (זוגות בסיסים). היתרונות העיקריים של פיצול DNA קולי כוללים את השליטה המדויקת של פרמטרים תהליך קולי ועוצמה. ניתן לכוונן את פרמטרי התהליך העל-קולי על ידי כוונון מדויק של עוצמת הסוניקציה, מחזורים וזמן. זה מאפשר ליצור גדלי DNA רצויים ואת אורך ה- DNA היעד ניתן לייצר באופן אמין, כמו גם לשכפל. גזירת DNA קולית היא גם אידיאלית ליצירת מקטעי DNA בעלי משקל מולקולרי גבוה.

פרוטוקולים עבור ליזה קולית של Drosophila melanogaster

להלן תוכל למצוא פרוטוקולים שונים עבור ליזה בסיוע אולטרה-סאונד, מיצוי חלבונים, ופיצול DNA או כרומטין של דגימות דרוזופילה.

ליזה קולית עבור Cross-linking Immunoprecipitation (CLIP) Assay

בדיקת CLIP בוצעה כפי שדווח בעבר עם כמה שינויים. כ-20 מ"ג שחלות מנקבות בר בנות 0 עד 1 יום היו UV crosslinked (3 × 2000 μJ/cm2), הומוגניות על קרח ב-1 מ"ל RCB buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM סוכרוז, 1 mM DTT, 1× מעכבי פרוטאז מלאים ללא EDTA, 1 mM PMSF) בתוספת 300 U RNAseOUT והונחו על קרח למשך 30 דקות. ההומוגנט היה סוני על קרח, בעוצמה של 80%, חמש פעמים בהתפרצויות של 20 שניות עם מנוחה של 60 שניות בין לבין באמצעות מעבד Hielscher Ultrasonic UP100H (100 ואט, 30 קילו-הרץ) וצנטריפוגה (16,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C). תמצית מסיסה נוקתה מראש עם 20 μl Protein-G dynabeads למשך 20 דקות ב-4°C. לאחר הסרת דגימות עבור immunoblotting וכימות של קלט RNA (1%), HP1 היה immunoprecipitated עם נוגדן anti-HP1 9A9 מ 450 μl precleared extract על ידי דגירה במשך 4 שעות עם 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates נשטפו 4 פעמים עם RCB. כדי לנטרל את הרנ"א החיסוני, הורתחו החרוזים הכדוריים ב-100 מיקרוליטר מים שטופלו ב-DEPC UltraPure למשך 5 דקות. מגיב קיזול 900 מיקרוליטר נוסף לסופרנאטנט שהוחזר להכנת RNA. הרנ"א שטוהר שימש כתבנית לסנתוז cDNA באמצעות אוליגו dT, הקסמרים אקראיים ושעתוק הפוך SuperScript III על פי פרוטוקול היצרן.
(Cassale et al. 2019)

ליזה קולית עבור Chromatin Immunoprecipitation Assay

המשקעים החיסוניים של כרומטין בוצעו על פי השיטה שתוארה על ידי מאנה עם שינויים קלים. כ-20 מ"ג שחלות מנקבות בר בנות 0 עד יום עברו הומוגניות ב-1 מ"ל של חיץ NEB (10 מ"מ HEPES-Na ב-pH 8.0, 10 מילימטר NaCl, 0.1 מילימטר EGTA-Na ב-pH 8, 0.5 מילימטר EDTA-Na ב-pH 8, 1 מ"מ DTT, 0.5% NP-40, 0.5 מילימטר זרע, 0.15 מילימטר זרע, 1× מעכבי פרוטאז מלאים ללא EDTA) עם מפזר הומוגנייזר / טבילה דקה אחת (ב-3000 סל"ד). ההומוגנט הועבר לקופצת זכוכית מצוננת מראש ו -15 משיכות מלאות הוחלו עם מזיק הדוק. גרעינים חופשיים הופעלו אז בצנטריפוגה במהירות של 6000xg למשך 10 דקות ב-4°C. הכדוריות המכילות גרעינים הושעו מחדש ב 1 מ"ל של NEB וצנטריפוגות ב 20000 × גרם במשך 20 דקות על שיפוע סוכרוז (0.65 מ"ל של 1.6 מ 'סוכרוז ב NEB, 0.35 מ"ל של 0.8 מ 'סוכרוז ב NEB). הגלולה הושעתה מחדש ב-1 מ"ל של NEB ופורמלדהיד לריכוז סופי של 1%. גרעינים הוצלבו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ורוו על ידי הוספת 1/10 נפח של 1.375 מטר גליצין. הגרעינים נאספו על ידי צנטריפוגה ב 6000 × גרם במשך 5 דקות. גרעינים נשטפו פעמיים ב-1 מ"ל של NEB והושעו מחדש ב-1 מ"ל של חיץ ליזיס (15 mM HEPES-Na ב-pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA ב-pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine ו-1× מעכבי פרוטאז מלאים ללא EDTA). גרעינים היו sonicated באמצעות מעבד קולי Hielscher UP100H (100 ואט, 30 קילו-הרץ) שש פעמים במשך 20 שניות על ודקה על קרח. גרעיני סוניק צוננו במהירות של 13000 × גרם למשך 4 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. רוב הכרומטין הסוני היה באורך של 500 עד 1000 זוגות בסיסים (bp). עבור כל משקעים חיסוניים, 15 מיקרוגרם של כרומטין הודגר בנוכחות 10 מיקרוגרם של נוגדן חד שבטי HP1 9A9 (3 שעות ב 4 מעלות צלזיוס בגלגל מסתובב). לאחר מכן, נוספו 50 מיקרוליטר של חלבון Dynabeads G והדגירה נמשכה במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנאטנטים הושלכו והדגימות נשטפו פעמיים ב-Lysis Buffer (כל שטיפה 15 דקות ב-4°C) ופעמיים ב-TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl ב-pH 8). הכרומטין נמהל מחרוזים בשני שלבים; תחילה ב-100 μl של Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ב-pH 8) ב-65°C למשך 15 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה והתאוששות של הסופר-נטנט. חומר חרוזים הופק מחדש ב 100 μl של TE + 0.67% SDS. האלואט המשולב (200 μl) הודגר במשך הלילה בטמפרטורה של 65°C כדי להפוך קישורים צולבים וטופל על ידי 50 מיקרוגרם/מ"ל RNaseA במשך 15 דקות ב-65°C וב-500 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאינאז K במשך 3 שעות ב-65°C. הדגימות הופקו פנול-כלורופורם וזירז אתנול. הדנ"א הושעה מחדש ב-25 מיקרוליטר מים. כדי למקסם את האנליזות המולקולריות עם DNA immunoprecipitated, גנים מועמדים הוגדלו בזוגות באמצעות פרוטוקול דופלקס-PCR אופטימלי באמצעות שתי קבוצות שונות של פריימרים בעלי טמפרטורות התכה דומות בתגובה אחת.
(Casale et al. 2019)
 

משבשי תאים על-קוליים בעלי ביצועים גבוהים עבור דגימות ביולוגיות

Hielscher Ultrasonics הוא השותף המנוסה שלך מזה זמן רב כשמדובר ultrasonicators ביצועים גבוהים עבור שיבוש תאים, ליזה, מיצוי חלבון, DNA, RNA, פיצול כרומטין, כמו גם שלבי הכנת דגימה טרום אנליטיים אחרים. מציע תיק מקיף של homogenizers מעבדה קולי ויחידות הכנת דגימה, Hielscher יש את המכשיר קולי האידיאלי עבור היישום הביולוגי שלך ואת הדרישות.
אולטרסאונד קלאסי מסוג בדיקה עם מיקרו-טיפ כגון UP200ST (200W; ראו תמונה משמאל) או אחת מיחידות הכנת הדגימה האולטרסוניות VialTweeter או UP200ST_TD_CupHorn עם VialHolder הם מודלים מועדפים במעבדות מחקר ואנליטיקה. הבדיקה הקולית הקלאסית היא אידיאלית, כאשר להכין פחות דגימות חייב להיות lysed, חילוץ או מקוטע. יחידות הכנת הדגימה VialTweeter ו- UP200St_TD_CupHorn מאפשרות סוניקציה בו זמנית של עד 10 או 5 בקבוקונים, בהתאמה.
אם יש לעבד מספרי מדגם גבוהים (למשל לוחות 96 בארות, לוחות מיקרוטיטר וכו '), יש לעבד את UIP400MTP הוא מערך הסוניק האידיאלי. UIP400MTP מתפקד כמו גדולה יותר, אשר מלאה במים ויש לה מספיק מקום להחזיק צלחות מיקרו-באר. מופעל על ידי מעבד קולי רב עוצמה של 400 וואט, UIP400MTP מספק סוניקציה אחידה ואינטנסיבית מאוד של לוחות מרובי בארות על מנת לשבש תאים, דגימות ליז, להמיס כדורים, לחלץ חלבונים או לגזור DNA.

שליטה מדויקת באמצעות תוכנה חכמה

כל פתרונות הסוניקציה של Hielscher מ -200 וואט ומעלה מצוידים במסך מגע צבעוני דיגיטלי ובתוכנה חכמה. באמצעות פרוטוקול הנתונים החכם, כל פרמטרי התהליך הקולי נשמרים אוטומטית כקובץ CSV בכרטיס SD מובנה ברגע שהאולטראסוניק מופעל. זה הופך את המחקר והפרוטוקול להרבה יותר נוחים. לאחר ניסויי הסוניקציה או הכנת הדגימה, אתה יכול פשוט לסקור את פרמטרי הסוניקציה של כל ריצת סוניקציה ולהשוות ביניהם.
באמצעות התפריט האינטואיטיבי, ניתן להגדיר מראש פרמטרים רבים לפני סוניקציה: לדוגמה, כדי לשלוט בטמפרטורה בדגימה ולמנוע את השפלתה התרמית, ניתן להגדיר גבול עליון של טמפרטורת הדגימה. חיישן טמפרטורה הניתן לחיבור, המגיע עם היחידה העל-קולית, נותן למעבד העל-קולי משוב על טמפרטורת הסוניק בפועל. כאשר מגיעים למגבלת הטמפרטורה העליונה, המכשיר העל-קולי מושהה עד שמגיעים לגבול התחתון של ערכת ∆T ומתחיל שוב לסוניק באופן אוטומטי.
אם נדרשת סוניקציה עם קלט אנרגיה ספציפי, ניתן להגדיר מראש את האנרגיה העל-קולית הסופית של ריצת הסוניקציה. כמובן, פעימה קולית מצב מחזור ניתן להגדיר בנפרד, מדי.
כדי להשתמש מחדש בפרמטרי הסוניקציה המוצלחים ביותר שלך, אתה יכול לשמור מצבי סוניקציה שונים (למשל זמן סוניקציה, עוצמה, מצב מחזור וכו ') כמצבים מוגדרים מראש, כך שניתן יהיה להפעיל אותם שוב בקלות ובמהירות.
לנוחות תפעולית יותר, ניתן להפעיל את כל היחידות העל-קוליות הדיגיטליות באמצעות שלט רחוק של הדפדפן בכל דפדפן נפוץ (למשל, InternetExplorer, Safari, Chrome וכו '). חיבור ה- LAN הוא הגדרת plug-n-play פשוטה ואינו דורש התקנת תוכנה נוספת.
אנו בהיילשר יודעים כי סוניקציה מוצלחת של דגימות ביולוגיות דורשת דיוק וחזרתיות. לכן, תכננו את האולטרסאונד שלנו כמכשירים חכמים עם כל התכונות המאפשרות הכנת דגימה יעילה, אמינה, ניתנת לשחזור ונוחה.

הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה ליכולת העיבוד המשוערת של המערכות העל-קוליות שלנו, החל ממיקרו-טיפים על-קוליים והומוגנייזרים על-קוליים קלאסיים וכלה באולטרסוניקטורים MultiSample להכנה נוחה ואמינה של דגימות רבות: