היגישר טכנולוגיית אולטרה סאונד

Ultrasonic תמוגה של E. קולי

  • חיידקי E. coli הם החיידקים הנפוצים ביותר במיקרוביולוגיה הביוטכנולוגיה.
  • משבשים תא קולי לספק תוצאות אמינות לשחזור עבור תמס של החיידק.
  • כוחות cavitation ו גזירת Intense עדיין לשליטה לגרום דווקא שיבוש מוחלט תשואות מיצוי גבוהות (חלבונים למשל: DNA).

שיבוש Cell ידי Cavitation

חיידקי קולי Escherichia הם lysed מהימנה באמצעות homogenizers רקמות קולי.homogenizers בדיקה מסוג אולטרה סאונד לפעול עם כ. 20,000 מחזורים בשניים (ב 20kHz) ולגרום cavitation נוזלים או supsensions. אזורים מיקרוסקופיים cavitation אקוסטי של לחצים ואקום דמוי וטמפרטורות גבוהות כי לקרוע תאים בנפרד. למרות טמפרטורות עשויות להגיע לכמה אלף מעלות צלזיוס, כרכי cavitation כל כך קטנים שהם לא לחמם את התהליך באופן משמעותי. אולטרסאונד שנוצר cavitation אקוסטי וכוחות גזירה לנקב או לשבור את קרום התא של E.coli – בהתאם להגדרת ההתקן של homogenizer הקולי.

יתרונות לתמס אולטרסאונד

  • שליטה מדויקת של תמס (עוצמת, משרעת, טמפרטורה)
  • התאמה אופטימלית דגימות ספציפיות
  • בקרת טמפרטורה
  • עבור קטנות מאוד כדי דגימות גדולות מאוד (μL כדי ליטרים)
  • טיפול מכני טהור
  • סולם למעלה ליניארי ממעבדת הייצור
המכשיר הקולי VialTweeter מאפשר הכנת מדגם בו זמני של עד 10 בקבוקונים באותם תנאי תהליך. (לחץ להגדלה!)

VialTweeter עבור תמס קולים

בקשת מידע





בעוד תמס כימי enzymtic יכול להיות בעייתי – מאז ימס כימי יכול לשנות מבנים חלבוניים ולהציג בעיות הטיהור תמס אנזימטי דורש פעמי דגירה ארוכה אינו לשחזור – שיבוש קולי הוא שיטת שיבוש מתוחכמת, מהיר תא.
לליזה אולטרה סאונד מבוססת על כוחות מכניים בלבד. לא נוספו כימיקלים, sonication שובר את קיר התא על ידי הטיית כוחות. הפירוק הכימי יכול לשנות את מבנה החלבון ולהחדיר בעיות טיהור. הפרעה אנזימטית דורשת זמני דגירה ארוכים ואינם מתוכנים.

המלצות כלליות

UP400St ultrasonicator עם כור זרימהSonication היא השיטה הפופולרית ביותר עבור lysing בכמויות קטנות מאוד, בינוניות וגדולות של השעיות תא – מ-ליטר פיקו עד 100L / hr (באמצעות תא זרימה קולי). התאים lysed ידי גזירה ומעט מאוד קריסת נוזלי. DNA הוא טעון גם במהלך sonication, ולכן אין צורך להוסיף DNase השעית התא.
בקרת טמפרטורת הגוף:
By טרום קירור המדגם ושמירה המדגם במהלך sonication על הקרח, לטעום השפלה תרמית של המדגם ניתן למנוע בקלות.
באופן אידיאלי, יש לשמור על הקרח קר בזמן הליזה, אבל ברוב הדגימות זה מספיק אם הטמפרטורה אינה עולה מעל לטמפרטורת התרבות או המקור של הרקמה. לכן מומלץ, כדי לשמור על ההשעיה על קרח ולsonicate עם פולסים מספר האולטרסונים קצרים של 5-10 שניות והפסקות של 10-30 שניות. במהלך ההפסקות, החום יכול להתפזר כדי ליצור מחדש טמפרטורה נמוכה. לדגימות תאים גדולות יותר, כורים מסוגים שונים של תאי זרימה עם מעילי קירור זמינים.

הפרוטוקולים של הכנת E. Coli Lysates

ניתוח ביטוי וטיהור של חלבון רקומביננטי

גלולת החיידק הייתה sonicated עם מערכה קולית מעלהay (Hielscher). לשם כך, תא גלולה היה resuspended במאגר תמוגה צונן (50 מ"מ טריס HCl pH 7.5 =, 100 מ"מ NaCl, 5 מ"מ DTT, 1 מ"מ PMSF) ו מקורר על הקרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, ההשעיה התא היה sonicated עם 10 התפרצויות קצרות של 10 שניות ואחריו מרווח של 30 עבור קירור. לבסוף, פסולת התא הוסר על ידי ultracentrifugation ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בסל"ד 14000. לאישור של ביטוי RPR, supernatant היה לרוץ על ג'ל polyacrylamide 12% ונותחו על ידי SDS-PAGE המערבי סופג. טיהור של rPR נעשה באמצעות Ni2 +שרף -NTA (Invitrogen, ארה"ב) על פי המדריך של היצרן. בשלב זה, שיטת טיהור ילידים שמשה. טוהר החלבון המטוהר הוערך באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל polyacrylamide 12% ו מכתים כחול Coomassie עוקב. ריכוז חלבון מטוהר נמדד על ידי ערכת assay חלבון מייקרו BCA (פירס, ארה"ב). (Azarnezhad et al. 2016)

UP100H המשבש תא הקולי (100W) עבור תמס, שיבוש תא גז DNA.

homogenizer Ultrasonic מעלהay 100W

צמיחת תאים, Crosslinking ואת הכנת תמציות תא החיידק

עבור SeqA וה- RNA פולימראז באסימונים E. coli MG1655 או MG1655 ΔseqA היה גדל ב 37 ° C ל OD600 של כ 0.15 ב 50 מ"ל LB (+ 0.2% גלוקוז) לפני 27 μl של פורמלדהיד (37%) לכל בינוני מ"ל נוספו (ריכוז סופי 1%). Crosslinking בוצעה בטלטול אטי (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ואחריו מרווה עם 10 מ"ל של 2.5 M גליצין (ריכוז סופי 0.5 M). עבור ניסויים בהלם חום, E. coli MG1655 גדל בינוני 65 מ"ל LB ב 30 מעלות צלזיוס ל OD600 של כ 0.3. לאחר מכן 30 מ"ל של התרבות הועבר בקבוק חם מחומם על 43 מעלות צלזיוס והשאר שמר על 30 מעלות צלזיוס. Crosslinking ו מרווה היה כפי שתואר לעיל למעט תאים נשמרו על 30 או 43 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני עוד רועד איטי בטמפרטורת החדר. תאים נאספו על ידי צנטריפוגה ושטף פעמיים עם TBS קר (pH7.5). לאחר resuspension ב 1 מ"ל תמוגה חיץ (10 מ"מ טריס (pH 8.0), סוכרוז 20%, 50 מ"מ NaCl, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"ג / מ"ל ​​lyssoymym) ו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ואחריו תוספת של 4 מ"ל IP חיץ, תאים היו sonicated על קרח עם 12 פעמים 30 שניות ו 30 שניות הפסקות ב UP400St מעבד קולי (GmbH אולטרסוניקה Hielscher) עם כוח 100%. לאחר צנטריפוגה עבור 10 דקות ב g 9000, 800 aliquotes μl של supernatant אוחסנו ב -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

ייצור יתר וטיהור אנזימים.

עבור יתר של decahistidine (His10) חלבונים -tagged, BL21 coli (DE3) הפך עם pET19b בונה. Preculture לילה היה לקצור ידי צנטריפוגה, ו 1% שימש לחסן תרבות הביטוי. תאים הנושאים pET19mgtB גדלו ב 22 ° C עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) של 0.7. התרבות הועברה 17 ° C ו המושרה על ידי 100 מיקרומטר IPTG. לאחר 16 שעות, התרבות היה לקצור ידי צנטריפוגה ב g 7500 × ב- C 4 °. תאים היו resuspended ב 50 מ"מ פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עם 0.3 M NaCl ב- pH 7.4 ו שיבשו ידי ultrasonication עם sonotrode מיקרו-טיפ S2 בבית בית Seating ultrasonicator (Hielscher, Teltow, גרמניה) בכל מחזור של 0.5 ו משרעת של 75%.
ייצור היתר של decahistidine-tagged GtfC הושר על 37 מעלות צלזיוס ב OD של600 של 0.6 עם 100 מיקרומטר IPTG. התאים הודגרו אז עבור 4 h, שנקטפו, ו lysed כאמור לעיל MgtB.
תמציות תאים גולמיים היו centrifuged ב g 15,000 × ו 4 מעלות צלזיוס עד משקעי הריסות התא. התמציות הבהירות הועמסו על 1 מיליליטר עמודות HisTrap FF גולמיים באמצעות מערכת פלוס ÄKTAprime (GE Healthcare). האנזימים היו מטוהרים לפי הפרוטוקול של היצרן עבור elution שיפוע של חלבונים שלו מתויג. פתרונות חלבון eluted היו dialyzed פעמיים נגד 1000 כרכים של 50 מ"מ PBS, pH 7.4, עם 0.3 M NaCl ב 4 מעלות צלזיוס. הטיהור נותחה על ידי 12% SDS-PAGE. הריכוז של חלבון נקבע על פי שיטת ברדפורד באמצעות רוטי-קוואנט (קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה). (Rabausch et al. 2013)

הפקת חלבון מן החיידק E. coli
חלבון פיתיון של עניין (במקרה זה, MTV1 של thaliana ארבידופסיס) התמזג תג GST ומתבטא coli Escherichia BL21 (E. coli) תאים.
1. קח גלולה אחת GST-MTV1 ו GST (המקביל ל 50 מ"ל תרבית החיידקים) מחדש להשעות כל חיץ מיצוי קר 2.5 מ"ל קרח.
2. השתמש ultrasonicator מעלהay (מצויד MS3 microtip-sonotrode עבור בנפחים קטנים (2-5mL)) לשבש תאים חיידקיים עד שהם lysed, אשר מסומן על ידי אטימות מופחת צמיגות מוגברת. כך זה צריך להתבצע על הקרח, והוא מומלץ sonicate במרווחים (לדוגמה 10 שניות sonicating ואחריו 10 שניות על הקרח וכן הלאה). יש טיפול להילקח שלא sonicate בעוצמה גבוהה מדי. אם הקצפה או היווצרות משקע לבן מזוהית, העוצמת צריכה להיות וריד.
3. מעבירים את הפתרון חיידקים lysed כדי 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס, 16,000 X גרם במשך 20 דקות.

חלבונים-modified אליצין החיידק

VialTweeter הוא ultrasonicator נוח הומוגניזציה מדגם קטןקביעת תוכן Sulfhydryl ידי 5,5'-Dithiobis (חומצה 2-nitrobenzoic) (DTNB) Assay
תרבות לילה MG1655 E. coli שימש לחסן מגבים בינוני מינימלי (1: 100). התרבות היתה גדלה אירובית עד להשגת A600 של 0.4 הושג. התרבות פוצלה לשלוש תרבויות 15 מיליליטר לטיפול מתח. תרבות מטופל שימש כביקורת שלילית. 0.79 אליצין מ"מ (128 מיקרוגרם מ"ל. אני לא מבין) או 1 מ"מ diamide נוספה אחת כל שתי תרבויות הנותרים. תרבויות הודגרו במשך 15 דקות. 5 מ"ל של כל תרבות נבצרו ידי צנטריפוגה (8525 g ×, 4 ° C, 10 דקות). תאים נשטפו פעמיים עם 1 מ"ל של PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2מיכל שוובי4, 2 מ"מ KH2פו4, pH 7.4, מאוחסנים אנאירובית לפני השימוש) ו centrifuged (13,000 × גרם, 4 ° C, 10 דקות). תאים היו resuspended במאגר תמוגה (PBS עם 6 מ"ל guanidinium HCl, pH 7.4) לפני הפרעה ב 4 מעלות צלזיוס על ידי ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, גרמניה) (3 × 1 דק '). פסולת התא היה pelleted ידי צנטריפוגה (13,000 g ×, 4 ° C, 15 דקות). את supernatant הועבר קובט 3.5 מ"ל QS-מאקרו (10 מ"מ) עם בר ומערבבים מגנטי ו מעורבב עם 1 מ"ל של חיץ תמס. הכחדה של דגימות היה פיקוח על 412 ננומטר עם ספקטרופוטומטר V-650 Jasco מצויד בעל תא PSC-718-בקרת טמפרטורה (Jasco) בטמפרטורת החדר. 100μl של dithiobis מ"מ 3 פתרון (2-nitrobenzoic חומצה) נוסף. Extinction נוטר עד שהיא הגיעה לרוויה. חישוב ריכוז תיאול בוצע באמצעות ε מקדם הכחדה412 = 13,700 M. אני לא מבין ס"מ. אני לא מבין עבור thio-2-nitrobenzoic חומצה (TNB). ריכוזי תיאול סלולר חושבו על בסיס נפח תאי חיידק של 6.7 × 10? בן כמה אתה. חמש עשרה ליטר ו צפיפות תאים של A600 = 0.5 (שווה ערך ל 1 × 108 ml תאים. אני לא מבין תרבות). (מולר et al. 2016)

In vivo הגלוטתיון קביעת

E.coli MG1655 היה גדל במדיום מינימלי מגבים בנפח כולל של 200 מ"ל עד האות A600 של 0.5 הגיע. התרבות היה מחולק 50 מ"ל תרבויות לטיפול בלחץ. לאחר 15 דקות של דגירה עם 0.79 מ"מ אליצין, 1 diamide מ"מ, או דימתיל sulfoxide (שליטה), תאים נקצרו ב 4,000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. תאים נשטפו פעמיים עם חיץ KPE לפני resuspension של כדורי 700μl של חיץ KPE. עבור deproteination, 300l של 10% (w / v) חומצה sulfosalicylic נוספו לפני הפרעה של תאים על ידי ultrasonication (3 x 1 דקות; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants נאספו לאחר צנטריפוגה (30 דקות, 13,000g, 4 ° C). ריכוזי חומצת Sulfosalicylic הופחתו ל 1% על ידי תוספת של 3 כרכים של חיץ KPE. מדידות של גלוטתיון סך GSSG בוצעו כמתואר לעיל. ריכוזי גלוטתיון סלולר חושבו על בסיס נפח של E. coli תאים של 6.7×10? בן כמה אתה. חמש עשרה ליטר ו צפיפות תאים של A600 00.5 (שווה ערך ל 1×108 ml תאים. אני לא מבין תַרְבּוּת). ריכוזי GSH חושבו על ידי חיסור של 2 [GSSG] מן גלוטתיון הכולל. (מולר et al. 2016)

משבש אולטרסאונד תמוגה תא הוצאת חומר ביולוגי (לחץ להגדלה!)

Probe-סוג ultrasonicator UP400St

הביטוי של האדם mAspAT ב E. coli

משבש תא הקולי UP400St (400W) עבור חילוץ של חומר תאי (חלבוני למשל: אברונים, DNA, RNA וכו ')המושבה יחיד של BL21 coli (DE3) מחסה וקטור ביטוי 30 מ"ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני המכיל 100μg / אמפיצילין מ"ל, ואז מעובדות ב- 37oC עד צפיפות אופטית (OD600) הגיע 0.6. התאים נקצרו על ידי צנטריפוגה ב g 4000 × עבור 10 דקות, והשעיה במדיום 3L טריים LB המכיל 100μg / אמפיצילין מ"ל.
לאחר מכן, ביטוי חלבון הושרה עם 1 מ"מ איזופרופיל β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) עבור 20 שעות ב 16ºC. התאים נקצרו על ידי צנטריפוגה ב g 8000 × עבור 15 דקות ושטפו עם חיץ (20 מ"מ NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4). 45g המקורב (משקל רטוב) תאים התקבלו 3 תרבות L. לאחר צנטריפוגה, את כדורי תא היה resuspended ב 40 מ"ל (עבור 1 L תרבות) חוצץ מיצוי קר כקרח, ו lysed ידי ultrasonication בטמפרטורת קר כקרח באמצעות UP400St מכשיר (ד"ר Hielscher GmbH, גרמניה). תמוגה התא היה centrifuged ב 12,000 סל"ד עבור 15 דקות להפריד מסיסים (supernatant) ו זירז שברים (גלולה). (ג'יאנג et al. 2015)

הטבלה להלן נותן לך אינדיקציה של יכולת עיבוד משוער של ultrasonicators שלנו:

נפח תצווה קצב זרימה התקנים מומלצים
00.5 ל 1.5mL N.A. VialTweeter
1 עד 500mL 10 עד 200mL / min מעלהay
10 עד 2000mL 20 עד 400mL / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 ל 20L 0.2 ל 4 ליטר / דקה UIP2000hdT
10 עד 100 ליטר 2 עד 10L / min UIP4000
N.A. 10 עד 100L / min UIP16000
N.A. יותר גדול אשכול UIP16000

תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!

אנא השתמש בטופס להלן, אם אתה רוצה לבקש מידע נוסף על homogenization קולי. נשמח להציע לך מערכת קולי הפגישה הדרישות שלך.









הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.


ספרות / הפניות



עובדות שראוי לדעת

אי - קולי

Escherichia coli (E. coli) הוא חיידק שלילי, בעל צורה אנאירובית, דמוית מוט קוליפורם של הסוג "אשריצ'יה", הנמצא בדרך כלל במעי התחתון של אורגניזמים חמי דם (אנדות'רמות). ישנם מספר רב של זנים E. coli (או subtypes) עם מאפיינים מגוונים. רוב זני E. coli אינם מזיקים לבני אדם, כגון B ו- K-12 זנים המשמשים נפוץ עבור יישומי מחקר במעבדות. עם זאת, כמה זנים הם מזיקים ויכולים לגרום מחלה קשה.
E. coli ממלא תפקיד חשוב בהנדסה ביולוגית מודרנית מיקרוביולוגיה תעשייתי מאז החיידקים קלים לתפעל. יישומי מעבדת Common אשר כרוך לעתים קרובות את השימוש של E. coli, למשל: כדי ליצור חומצה דאוקסיריבונוקלאית רקומביננטי (DNA) או לפעול כאורגניזם מודל.
אי קולי הוא מארח מאוד תכליתי לייצור חלבוני Heterologous, ומערכות ביטוי חלבון סעפת זמינות לייצר חלבונים רקומביננטיים חיידק. באמצעות פלסמידים המאפשרים ביטוי ברמה גבוה של חלבון, גנים יכולים להיות מוחדרים החיידקים, אשר מאפשר לייצר חלבונים כאלה בכמויות גבוהות בתהליכי תסיסה תעשייתיים.
E.coli משמש מפעלי תא לייצר אינסולין. יישומים נוספים כוללים את השימוש בתאי חיידק שונה לפתח ולייצר חיסוני קיבוע אנזימים, כדי לייצר דלק ביולוגי, כמו גם עבור bioremediation.
זן K-12 הוא צורה מוטציה של E. coli כי יתר מבטא את האנזים אלקליין פוספטאז (ALP). מוטציה זו מתרחשת עקב פגם גן מקודד זמן עבור האנזים. אם גן מייצר מוצר ללא כל עיכוב זה נקרא פעילות מכוננת. טופס מוטציה ספציפית זו משמשת לבידוד וטיהור האנזים ALP.

Ultrasonic DNA גזיזה

כוחות גזירת אולטרסאונד הוא שיטה נפוצה להפריד מהתא ולשבור גדילי דנ"א לחתיכות. cavitation אקוסטי שובר את קירות התא ממברנות לחלץ דנ"א מתאי וליצור שברים כ 600 – 800 נ"ב אורך, שהינה אידיאלית לניתוח.
לחץ כאן כדי ללמוד עוד על homogenizers קולי עבור פיצול ה- DNA!