Ultrasonic תמוגה של E. קולי

  • חיידקי E. coli הם החיידקים הנפוצים ביותר במיקרוביולוגיה הביוטכנולוגיה.
  • משבשים תא קולי לספק תוצאות אמינות לשחזור עבור תמס של החיידק.
  • כוחות cavitation ו גזירת Intense עדיין לשליטה לגרום דווקא שיבוש מוחלט תשואות מיצוי גבוהות (חלבונים למשל: DNA).

מדוע הפרעה בתאים אולטראסוניים של E. coli היא השיטה המועדפת?

הומוגנייזרים קוליים או אולטרסאונד מסוג בדיקה מציעים מספר יתרונות עבור E. coli lysis כמו אולטרסאונד אינטנסיבי ביעילות משבש את קירות התא ואת הממברנות. אולטרסאונד מסוג בדיקה נמצא בשימוש נרחב עבור E. coli lysis בשל הסיבות הבאות:

  • שיבוש יעיל של דפנות התא: E. coli יש דופן תא קשיח למחצה המורכב peptidoglycan, אשר יכול להיות קשה לשבור באמצעות שיטות ליזה מסורתיות. אולטרסאונד מסוג בדיקה מייצר גלים על-קוליים עזים היוצרים בועות קוויטציה בנוזל המקיף את התאים. כאשר בועות אלה קורסות, הן מייצרות סילוני נוזל במהירות גבוהה וגלי הלם הגורמים לשיבוש מכני של דפנות התא, ומשחררות ביעילות תוכן תאי כגון ביומולקולות.
  • חדירה משופרת: הגלים העל-קוליים הנוצרים על ידי הגשושית / סונוטרודה יכולים לחדור עמוק לתוך הדגימה, להגיע למספר גדול יותר של תאי E. coli ולטפל בהם באופן שווה. זה עוזר להבטיח שליזה תהיה אחידה יותר בכל הדגימה, וכתוצאה מכך יעילות שיבוש תאים גבוהה יותר.
  • קיצור זמן העיבוד: האנרגיה המועברת על ידי אולטרה-סאונד מסוג בדיקה היא מרוכזת מאוד ומקומית, מה שמוביל לליזה מהירה ויעילה של התא. בהשוואה לשיטות אחרות כמו הכאת חרוזים או ליזה אנזימטית, סוניקציה יכולה להשיג E. coli lysis בתוך דקות או אפילו שניות. בעוד טכניקות אלטרנטיביות רבות כגון הפשרה בהקפאה דורשות מספר סבבי טיפול, ליזה קולית פותחת תאים בשלב תהליך אחד.
  • בקרת טמפרטורת הגוף: אולטרסאונד חדיש מצויד חיישני טמפרטורה ותוכנה חכמה, המאפשרת להגדיר טמפרטורת תהליך מקסימלית. האולטרה-סאונד משתהה אוטומטית כאשר מגיעים למגבלת הטמפרטורה ומתחיל את תהליך הסוניקציה כאשר מגיעים לנקודת טמפרטורה מוגדרת. קירור הדגימות באמבט קרח הוא שיטה פשוטה לשמירה על טמפרטורת דגימה נמוכה ולמניעת התפרקות דגימה כתוצאה מחום.
  • מדרגיות: אולטרסאונד מסוג בדיקה זמינים בגדלים שונים, החל ממכשירי כף יד ועד מודלים תעשייתיים בקנה מידה גדול. זה הופך אותם למתאימים לעיבוד נפחים קטנים במעבדה או להתרחבות ליישומי עיבוד ביולוגי גדולים יותר, למשל ייצור חיסונים או ביו-סינתזה של מולקולות.
  • צדדיות: ניתן להשתמש באולטרסאונד ליישומים שונים מעבר לליזה של תאים, כגון גזירת DNA, מיצוי חלבונים, הומוגניזציה של רקמות, פיזור ננו-חלקיקים ותחלוב. לכן, השקעה באולטרה-סאונד מסוג בדיקה מספקת צדדיות במחקר או בהגדרות תעשייתיות.
  • אולטרסאונד מסוג בדיקה כגון UP200St הם הומוגנייזרים אמינים לרקמות ומרססי תאים, ולכן נמצאים בשימוש נרחב להכנת דגימות בגנטיקה, למשל, עבור E.coli lysis

    מיצוי חלבון מתאי E.coli מתבצע ביעילות עם בדיקה קולית UP200St

    אולטרסאונד מסוג בדיקה מציע יתרונות רבים עבור E. coli lysis. הבקרה האמינה והמדויקת על פרמטרים של תהליך קולי מאפשרת לייעל את פרמטרי ההפעלה כגון כוח, משך זמן וטיפול בדגימה כדי להשיג את התוצאות הרצויות.
     

    בקשת מידע





     

    מדריך זה מסביר איזה סוג של סוניקטור הוא הטוב ביותר עבור משימות הכנת הדגימה שלך כגון ליזה, שיבוש תאים, בידוד חלבונים, פיצול DNA ו- RNA במעבדות, ניתוח ומחקר. בחר את סוג הסוניקטור האידיאלי עבור היישום שלך, נפח הדגימה, מספר הדגימה והתפוקה. Hielscher Ultrasonics יש הומוגנייזר קולי אידיאלי בשבילך!

    כיצד למצוא את הסוניקטור המושלם לשיבוש תאים ומיצוי חלבונים במדע וניתוח

    תמונה ממוזערת של וידאו

    פיצול DNA אולטרה סאונד משמש לעתים קרובות כשלב הכנה מדגם ברצף הדור הבא (NGS)

    ניתוחים אלקטרופורטיים של DNA גנומי של E. coli EDL933 נתון 0 – 15 דקות ultrasonication. L מציין את סולם הדנ"א.
    (מחקר ותמונה: ©Basselet et al. 2008)

    הפרעה בתאים באמצעות קביטציה קולית

    הומוגנייזרים מסוג בדיקה על-קולית פועלים עם כ-20,000 מחזורים בשנייה (ב-20kHz) וגורמים לקוויטציה בנוזלים או תרחיפים. קוויטציה אקוסטית אזורים מיקרוסקופיים של לחצים דמויי ואקום וטמפרטורות גבוהות שקורעות תאים לגזרים. למרות שהטמפרטורות עשויות להגיע לכמה אלפי מעלות צלזיוס, נפחי הקוויטציה קטנים כל כך שהם אינם מחממים את התהליך באופן משמעותי. אולטרסאונד שנוצר קוויטציה אקוסטית וכוחות גזירה מנקבים או שוברים את קרום התא של תאי חיידקים כגון E.coli. Hielscher ultrasonicators מאפשרים שליטה מדויקת על פרמטרים תהליך כגון עוצמה קולית, משרעת, קלט אנרגיה, וטמפרטורה. בכך, ניתן להתאים את תהליך הליזה העל-קולית באופן אופטימלי לסוג התא, תרבית התאים ומטרת התהליך.
     

    יתרונות לתמס אולטרסאונד

    • שליטה מדויקת של תמס (עוצמת, משרעת, טמפרטורה)
    • תוצאות אמינות וניתנות לשחזור
    • התאמה אופטימלית דגימות ספציפיות
    • בקרת טמפרטורה
    • עבור קטנות מאוד כדי דגימות גדולות מאוד (μL כדי ליטרים)
    • טיפול מכני טהור
    • תפעול ידידותי למשתמש ובטוח
    • סולם למעלה ליניארי ממעבדת הייצור
    המכשיר הקולי VialTweeter מאפשר הכנת מדגם בו זמני של עד 10 בקבוקונים באותם תנאי תהליך. (לחץ להגדלה!)

    VialTweeter עבור תמס קולים

    בקשת מידע





    הומוגנייזר קולי לעומת טכניקות ליזה אחרות

    בעוד ליזה כימית ואנזימטית יכולה להיות בעייתית – מאז ימס כימי יכול לשנות מבנים חלבוניים ולהציג בעיות הטיהור תמס אנזימטי דורש פעמי דגירה ארוכה אינו לשחזור – שיבוש קולי הוא שיטת שיבוש מתוחכמת, מהיר תא.
    ליזה קולית מבוססת על כוחות מכניים בלבד. לא מוסיפים כימיקלים, סוניקציה שוברת את דופן התא על ידי כוחות גזירה. ליזה כימית יכולה לשנות את מבנה החלבון ולהציג בעיות טיהור. הפרעה אנזימטית דורשת זמני דגירה ארוכים ואינה ניתנת לשחזור. שיבוש תאים אולטראסוניים של תאי חיידקי E.coli הוא מהיר, פשוט, אמין וניתן לשחזור. לכן אולטרסאונד Hielscher משמשים במעבדות ביולוגיות וביוכימיות ברחבי העולם להכנת דגימה, pre-ananlytics, diagonstics במבחנה ובדיקות סעפת.

    המלצות כלליות לליזה קולית

    Sonication היא השיטה הפופולרית ביותר עבור lysing בכמויות קטנות מאוד, בינוניות וגדולות של השעיות תא – מ-ליטר פיקו עד 100L / hr (באמצעות תא זרימה קולי). התאים lysed ידי גזירה ומעט מאוד קריסת נוזלי. DNA הוא טעון גם במהלך sonication, ולכן אין צורך להוסיף DNase השעית התא.
     

    בקרת טמפרטורה במהלך קולי קולי ליזיס קולי
    משבש תאים על-קולי UP100H (100W) לשיבוש תאים ומיצוי תרכובות צמחיות.By טרום קירור המדגם ושמירה המדגם במהלך sonication על הקרח, לטעום השפלה תרמית של המדגם ניתן למנוע בקלות.
    באופן אידיאלי, דגימות צריך להישמר קר כקרח במהלך ליזיס, אבל עבור רוב הדגימות זה מספיק אם הטמפרטורה אינה עולה מעל הטמפרטורה של תרבית או מקור רקמות. לכן מומלץ, לשמור את המתלה על קרח ולבצע סוניקציה עם מספר פולסים אולטרה-סוניים קצרים של 5-10 שניות והפסקות של 10-30 שניות. במהלך ההפסקות, החום יכול להתפזר על מנת לבסס מחדש טמפרטורה נמוכה. עבור דגימות תאים גדולות יותר, כורי תאי זרימה שונים עם מעילי קירור זמינים.
    קראו כאן טיפים מפורטים והמלצות לליזה אולטראסונית מוצלחת!

    פרוטוקולים להכנת קולי של E. coli lysates

    חוקרים משתמשים הומוגנייזרים קוליים Hielscher עבור הפרעה בתאי E.coli. להלן תוכל למצוא פרוטוקולים שונים שנבדקו והוכחו עבור E.coli lysis באמצעות Hielscher קולי homogenizers עבור יישומים שונים הקשורים E. coli.
     

    סרטון וידאו זה מראה את הומוגנייזר האולטרה-סוני Hielscher UP100H, אולטרה-סוניקטור הנמצא בשימוש נרחב להכנת דגימות במעבדות.

    הומוגנייזר אולטראסוני UP100H

    תמונה ממוזערת של וידאו

    גדילת תאים, הצלבה והכנה של תמציות תאי E. coli באמצעות אולטרסאונד

    עבור SeqA וה- RNA פולימראז באסימונים E. coli MG1655 או MG1655 ΔseqA היה גדל ב 37 ° C ל OD600 של כ 0.15 ב 50 מ"ל LB (+ 0.2% גלוקוז) לפני 27 μl של פורמלדהיד (37%) לכל בינוני מ"ל נוספו (ריכוז סופי 1%). Crosslinking בוצעה בטלטול אטי (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ואחריו מרווה עם 10 מ"ל של 2.5 M גליצין (ריכוז סופי 0.5 M). עבור ניסויים בהלם חום, E. coli MG1655 גדל בינוני 65 מ"ל LB ב 30 מעלות צלזיוס ל OD600 של כ-0.3. לאחר מכן 30 מ"ל תרבית הועברו לבקבוק שחומם מראש ב-43 מעלות צלזיוס והשאר נשמר ב-30 מעלות צלזיוס. הצלבה ומרווה היו כמתואר לעיל, פרט לכך שהתאים נשמרו בטמפרטורה של 30 או 43 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני רעידות איטיות נוספות בטמפרטורת החדר. התאים נאספו בצנטריפוגה ונשטפו פעמיים ב-TBS קר (pH7.5). לאחר השעיה במאגר ליזיס של 1 מ"ל (10 mM Tris (pH 8.0), 20% סוכרוז, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 מ"ג/מ"ל ליזואנזים) ודגירה ב-37°C למשך 30 דקות ולאחר מכן תוספת של 4 מ"ל חיץ IP, התאים הושרו על קרח עם הפסקות של 12 פעמים 30 שניות ו-30 שניות באמצעות המעבד האולטרסוני UP400St של Hielscher בהגדרת הספק של 100%. לאחר צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 9000 גרם, 800 μl aliquotes של supernatant אוחסנו ב -20 מעלות צלזיוס. (Waldminghaus 2010)
     

    ייצור יתר וטיהור אנזימים עם בדיקה קולית

    Ultrasonicator UP100H הוא הומוגנייזר מעבדה המשמש לעתים קרובות להכנת דגימה של לוחות תרבית תאים.עבור ייצור יתר של חלבונים מתויגים דקהיסטידין (His10), E. coli BL21(DE3) השתנה עם מבני pET19b. קדם-תרבות לילה נקטפה על ידי צנטריפוגה, ו-1% שימשו לחיסון תרבות ביטוי. תאים שנשאו pET19mgtB גודלו ב-22°C עד לצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600) של 0.7. התרבית הועברה לטמפרטורה של 17°C והושרה על ידי IPTG של 100 מיקרומטר. לאחר 16 שעות, התרבית נקטפה באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 7,500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. התאים הושעו מחדש במי מלח חוצצי פוספט של 50 מילימטר (PBS) עם 0.3 M NaCl ב-pH 7.4 והופרעו על ידי אולטרה-סוניקציה עם סונוטרודה S2 micro-tip באולטראסוניק Hielscher UP200St במחזור של 0.5 ומשרעת של 75%.
    ייצור היתר של decahistidine-tagged GtfC הושר על 37 מעלות צלזיוס ב OD של600 של 0.6 עם 100 מיקרומטר IPTG. התאים הודגרו אז עבור 4 h, שנקטפו, ו lysed כאמור לעיל MgtB.
    תמציות תאים גולמיים עברו צנטריפוגות בטמפרטורה של 15,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס כדי לשקוע בפסולת התא. התמציות המזוקקות הועמסו על עמודי HisTrap FF Crude בנפח 1 מ"ל באמצעות מערכת ÄKTAprime Plus. האנזימים טוהרו על פי פרוטוקול היצרן לפליטה הדרגתית של חלבונים מתויגים His. תמיסות חלבון אלוטות חווינו פעמיים כנגד 1,000 נפחים של 50 מילימטר PBS, pH 7.4, עם 0.3 M NaCl ב-4 מעלות צלזיוס. הטיהור נותח על ידי 12% SDS-PAGE. ריכוז החלבון נקבע בשיטת ברדפורד באמצעות רוטי-קוונט. (Rabausch et al. 2013)
     

    מיצוי אולטראסוני של חלבון מחיידקי E. coli
    חלבון פיתיון של עניין (במקרה זה, MTV1 של thaliana ארבידופסיס) התמזג תג GST ומתבטא coli Escherichia BL21 (E. coli) תאים.

    1. קח גלולה אחת של GST-MTV1 ו- GST (המקביל לתרבית חיידקים של 50 מ"ל) והשהה מחדש כל אחד במאגר מיצוי קר כקרח של 2.5 מ"ל.
    2. השתמש ב- Ultrasonicator UP100H (מצויד במיקרוטיפ-סונוטרודה MS3 עבור נפחים קטנים של כ- 2-5 מ"ל) כדי לשבש את תאי החיידק עד שהם עוברים ליזה, דבר המסומן על ידי אטימות מופחתת וצמיגות מוגברת. זה צריך להתבצע על קרח, ומומלץ לבצע סוניקציה במרווחים (למשל 10 שניות סוניקציה ואחריה הפסקה של 10 שניות על קרח וכן הלאה). יש להקפיד לא להסוניק בעוצמה גבוהה מדי. אם מזוהה קצף או היווצרות של משקע לבן, יש להוריד את העוצמה.
    3. העבר את תמיסת חיידקי הליזה לצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל וצנטריפוגות בטמפרטורה של 4°C, 16,000 x g למשך 20 דקות.

     

    גשושיות על-קוליות משתמשות בכוחות של קוויטציה אקוסטית כדי לשבש את התא ולחלץ מולקולות ודנ"א מ-E.coli.

    אולטרסאונד מסוג בדיקה כגון UP400St השתמש בעקרון העבודה של קוויטציה אקוסטית עבור ליזה יעילה של E.coli.

    ניתוח ביטוי וטיהור חלבון רקומביננטי באמצעות סוניקציה

    גלולת E. coli סוניקה עם Ultrasonicator Hielscher UP100H. למטרה זו, גלולת התא הושעתה מחדש בחיץ ליזה צונן (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) והתקררה על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, מתלה התא הושמע עם 10 התפרצויות קצרות של 10 שניות ואחריו מרווח של 30 שניות לקירור. לבסוף, פסולת התאים הוסרה על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב-4°C למשך 15 דקות ב-14,000 סל"ד. לאישור ביטוי rPR, הסופרנאטנט הופעל על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% ונותח על ידי SDS-PAGE ו-Western blotting. טיהור rPR נעשה באמצעות שרף Ni2+-NTA (Invitrogen, ארה"ב) על פי מדריך היצרן. בשלב זה נעשה שימוש בשיטת טיהור טבעית. טוהר החלבון המטוהר הוערך באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% ולאחר מכן כתמים כחולים קומאסי. ריכוז החלבון המטוהר נמדד על ידי ערכת בדיקת חלבון Micro BCA (PIERCE, ארה"ב). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    סרטון זה מציג את הקרן האולטרה-סאונד של 200 וואט לפיזור, הומוגניזציה, חילוץ או דגירה של דגימות מעבדה.

    קופהורן אולטראסוני (200 וואט)

    תמונה ממוזערת של וידאו

    הומוגנייזרים קוליים עבור E. coli Lysis

    Hielscher Ultrasonics מתכננת, מייצרת ומספקת הומוגנייזרים קוליים בעלי ביצועים גבוהים עבור ליזה אמינה ויעילה של חיידקי E. coli וסוגי תאים אחרים, רקמות ותרביות תאים.
    הפורטפוליו הרחב של בדיקות קוליות, כמו גם מערכות סוניקציה עקיפה, מאפשר לנו להציע לך את ההומוגנייזר האידיאלי לרקמות על-קוליות עבור יישום שיבוש וחילוץ התאים שלך.

    תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

    Hielscher ultrasonicators ניתן לשלוט מרחוק באמצעות בקרת דפדפן. ניתן לעקוב אחר פרמטרי Sonication ולהתאים בדיוק לדרישות התהליך.Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. תוכנה חכמה, תפריט אינטואיטיבי, הגדרות לתכנות ופרוטוקול נתונים אוטומטי הם רק כמה תכונות של Hielscher ultrasonicators. החוסן והתפעול הקל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקני מחקר וביוטכנולוגיה. אפילו תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי אולטרסאונד Hielscher.

    Hielscher אולטרסוניקה היא חברה מוסמכת ISO ולשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים הכוללים טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher אולטרסוניקאטורים הם תואמי CE ועומדים בדרישות של UL, CSA ו- RoHs.

    הטבלה להלן נותן לך אינדיקציה של יכולת עיבוד משוער של ultrasonicators שלנו:

    נפח תצווה קצב זרימה התקנים מומלצים
    צלחות מולטי-באר / מיקרוטיטר N.A. UIP400MTP
    CupHorn עבור בקבוקונים או N.A. cuphorn אולטרסאונד
    כור מיקרו-זרימה על-קולי N.A. GDmini2
    עד 10 בקבוקונים עם 0.5 עד 1.5 מ"ל N.A. VialTweeter
    00.5 ל 1.5mL N.A. VialTweeter
    1 עד 500mL 10 עד 200mL / min מעלהay
    10 עד 2000mL 20 עד 400mL / min Uf200 ः t, UP400St
    0.1 ל 20L 0.2 ל 4 ליטר / דקה UIP2000hdT
    10 עד 100 ליטר 2 עד 10L / min UIP4000
    N.A. 10 עד 100L / min UIP16000
    N.A. יותר גדול אשכול UIP16000

    תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!

    בקש מידע נוסף

    אנא השתמש בטופס שלהלן כדי לבקש מידע נוסף על הומוגנייזרים לרקמות אולטראסוניות ומגרסות תאים, יישומי ליזיס ומחירים. נשמח לדון איתך בתהליך שלך ולהציע לך הומוגנייזר קולי הממלא את הדרישות שלך!









    הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.


    הווידאו מראה את מערכת הכנת מדגם קולי UIP400MTP, המאפשר הכנת מדגם אמין של כל צלחות מרובות טוב סטנדרטי באמצעות אולטרסאונד בעוצמה גבוהה. יישומים אופייניים של UIP400MTP כוללים תמוגה בתא, DNA, RNA, גיזת כרומטין, כמו גם מיצוי חלבון.

    אולטרה סאונד UIP400MTP עבור sonication צלחת רב-באר

    תמונה ממוזערת של וידאו

    פרוטוקולים נוספים עבור קולי ליזיס

    חלבונים מהונדסים אליצין ב- E. coli באמצעות VialTweeter על-קולי

    VialTweeter במעבד קולי UP200STקביעת תוכן Sulfhydryl ידי 5,5'-Dithiobis (חומצה 2-nitrobenzoic) (DTNB) Assay
    תרבית לילה E. coli MG1655 שימשה לחיסון MOPS בינוני מינימלי (1:100). התרבית גודלה באופן אירובי עד שהגיע ל-A600 של 0.4. התרבית פוצלה לשלוש תרביות של 15 מ"ל לטיפול בסטרס. תרבות לא מטופלת שימשה כשליטה שלילית. אליצין 0.79 מילימטר (128 מיקרוגרם מ"ל-1) או קוטר 1 מילימטר נוסף לאחת משתי התרביות הנותרות כל אחת. התרביות הודגרו במשך 15 דקות. 5 מ"ל מכל תרבית נקטפו באמצעות צנטריפוגה (8,525 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 10 דקות). התאים נשטפו פעמיים עם 1 מ"ל של PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, מאוחסן אנאירובית לפני השימוש) וצנטריפוגות (13,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 10 דקות). התאים הושעו מחדש בחיץ ליזה (PBS עם 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) לפני הפרעה ב 4 מעלות צלזיוס על ידי ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, גרמניה) (3 × 1 דקות). פסולת התא הוטלה על ידי צנטריפוגה (13,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, 15 דקות). הסופרנאטנט הועבר לקובט QS-מאקרו בנפח 3.5 מ"ל (10 מ"מ) עם מוט ערבוב מגנטי ועורבב עם 1 מ"ל של חיץ ליזיס. הכחדת הדגימות נוטרה במהירות של 412 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר Jasco V-650 המצויד במחזיק התא מבוקר הטמפרטורה PSC-718 בטמפרטורת החדר. 100μl של 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoic חומצה) פתרון נוספו. ההכחדה נוטרה עד שהגיעה לרוויה. חישוב ריכוז התיול בוצע באמצעות מקדם ההכחדה ε412 = 13,700 M. אני לא מבין ס"מ. אני לא מבין עבור thio-2-nitrobenzoic חומצה (TNB). ריכוזי תיאול סלולר חושבו על בסיס נפח תאי חיידק של 6.7 × 10? בן כמה אתה. חמש עשרה ליטר וצפיפות תאים של A600 = 0.5 (שווה ערך ל- 1 × 108 ml תאים. אני לא מבין תרבות). (מולר et al. 2016)
     

    ב-Vivo קביעת גלוטתיון באמצעות מרסק תאים על-קולי

    E.coli MG1655 גודל ב-MOPS בנפח כולל של 200 מ"ל עד שהגיע ל-A600 של 0.5. התרבית חולקה לתרביות של 50 מ"ל לטיפול במתח. לאחר 15 דקות של דגירה עם אליצין 0.79 mM, קוטר 1 mM או dimethyl sulfoxide (ביקורת), התאים נקצרו ב-4,000 גרם ב-4°C למשך 10 דקות. התאים נשטפו פעמיים עם חיץ KPE לפני השעיית הכדוריות ב-700μl של חיץ KPE. עבור deproteination, 300l של 10% (w/v) חומצה sulfosalicylic נוספו לפני הפרעה של תאים על ידי ultrasonication (3 x 1 דקות; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants נאספו לאחר צנטריפוגה (30 דקות, 13,000g, 4 ° C). ריכוזי חומצת Sulfosalicylic הופחתו ל 1% על ידי תוספת של 3 כרכים של חיץ KPE. מדידות של גלוטתיון סך GSSG בוצעו כמתואר לעיל. ריכוזי גלוטתיון סלולר חושבו על בסיס נפח של E. coli תאים של 6.7×10? בן כמה אתה. חמש עשרה ליטר וצפיפות תאים של A600 0.5 (שווה ערך ל-1×108 ml תאים. אני לא מבין תַרְבּוּת). ריכוזי GSH חושבו על ידי חיסור של 2 [GSSG] מן גלוטתיון הכולל. (מולר et al. 2016)

    ביטוי של mAspAT אנושי ב- E. coli באמצעות הומוגנייזר קולי

    משבש תא הקולי UP400St (400W) עבור חילוץ של חומר תאי (חלבוני למשל: אברונים, DNA, RNA וכו ')המושבה יחיד של BL21 coli (DE3) מחסה וקטור ביטוי 30 מ"ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני המכיל 100μg / אמפיצילין מ"ל, ואז מעובדות ב- 37oC עד צפיפות אופטית (OD600) הגיע 0.6. התאים נקצרו על ידי צנטריפוגה ב g 4000 × עבור 10 דקות, והשעיה במדיום 3L טריים LB המכיל 100μg / אמפיצילין מ"ל.
    לאחר מכן, ביטוי חלבון הושרה עם 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במשך 20 שעות ב 16ºC. התאים נקצרו באמצעות צנטריפוגה במהירות של 8,000 × גרם למשך 15 דקות ונשטפו בחיץ A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4). תאים משוערים של 45 גרם (משקל רטוב) התקבלו מתרבית 3 ליטר. לאחר הצנטריפוגה, כדורי התא הושעו מחדש ב 40 מ"ל (עבור תרבית 1 L) חיץ מיצוי קר כקרח A, ו lysed על ידי ultrasonication בטמפרטורה קרה כקרח באמצעות מגרסה תא קולי Hielscher UP400St. הליזה התאית עברה צנטריפוגה במהירות של 12,000 סל"ד למשך 15 דקות כדי להפריד בין שברים מסיסים (סופר-נטנטים) ומשקעים (כדוריים). (ג'יאנג ואחרים 2015)
     



    עובדות שראוי לדעת

    אי - קולי

    Escherichia coli (E. coli) הוא חיידק שלילי, בעל צורה אנאירובית, דמוית מוט קוליפורם של הסוג "אשריצ'יה", הנמצא בדרך כלל במעי התחתון של אורגניזמים חמי דם (אנדות'רמות). ישנם מספר רב של זנים E. coli (או subtypes) עם מאפיינים מגוונים. רוב זני E. coli אינם מזיקים לבני אדם, כגון B ו- K-12 זנים המשמשים נפוץ עבור יישומי מחקר במעבדות. עם זאת, כמה זנים הם מזיקים ויכולים לגרום מחלה קשה.
    E. coli ממלא תפקיד חשוב בהנדסה ביולוגית מודרנית מיקרוביולוגיה תעשייתי מאז החיידקים קלים לתפעל. יישומי מעבדת Common אשר כרוך לעתים קרובות את השימוש של E. coli, למשל: כדי ליצור חומצה דאוקסיריבונוקלאית רקומביננטי (DNA) או לפעול כאורגניזם מודל.
    אי קולי הוא מארח מאוד תכליתי לייצור חלבוני Heterologous, ומערכות ביטוי חלבון סעפת זמינות לייצר חלבונים רקומביננטיים חיידק. באמצעות פלסמידים המאפשרים ביטוי ברמה גבוה של חלבון, גנים יכולים להיות מוחדרים החיידקים, אשר מאפשר לייצר חלבונים כאלה בכמויות גבוהות בתהליכי תסיסה תעשייתיים.
    E.coli משמשים כמפעלי תאים לייצור אינסולין. יישומים נוספים כוללים שימוש בתאי E. coli מהונדסים לפיתוח וייצור חיסונים ואנזימים משותקים, לייצור דלקים ביולוגיים, כמו גם לטיפול ביולוגי.
    זן K-12 הוא צורה מוטציה של E. coli כי יתר מבטא את האנזים אלקליין פוספטאז (ALP). מוטציה זו מתרחשת עקב פגם גן מקודד זמן עבור האנזים. אם גן מייצר מוצר ללא כל עיכוב זה נקרא פעילות מכוננת. טופס מוטציה ספציפית זו משמשת לבידוד וטיהור האנזים ALP.
    חיידקי E. coli נמצאים גם בשימוש נרחב כמפעלי תאים. חיידקים מהונדסים (למשל, חיידקים) ותאי צמחים יכולים לשמש כמפעלי תאים כביכול. תאים מהונדסים גנטית אלה מייצרים מולקולות, כימיקלים, פולימרים, חלבונים וחומרים אחרים, המשמשים למשל בתעשיית התרופות, המזון והכימיקלים. על מנת לשחרר את המולקולות המיוצרות בפנים של תאים מהונדסים ביולוגית כאלה, תמוגה קולית היא שיטה נפוצה לשבש את קירות התא ולהעביר את חומרי היעד לנוזל שמסביב. קרא עוד על תמוגה של תאים מהונדסים ביולוגית!

    Ultrasonic DNA גזיזה

    כוחות גזירה על-קוליים הם שיטה נפוצה לשחרור מולקולות, אברונים וחלבונים מפנים התא, כמו גם לפירוק גדילי DNA לחתיכות. קוויטציה אקוסטית שוברת את דפנות התא ואת קרומי התא כדי לחלץ DNA מתאים וליצור מקטעים של כ -600 – 800 נ"ב אורך, שהינה אידיאלית לניתוח.
    לחץ כאן כדי ללמוד עוד על homogenizers קולי עבור פיצול ה- DNA!

    ספרות/הפניות


    אולטרסוניקה ביצועים גבוהים! מגוון המוצרים Hielscher מכסה את הספקטרום המלא מן ultrasonicator המעבדה הקומפקטית מעל יחידות ספסל העליון למערכות אולטראסאונד תעשייתיות מלאות.

    Hielscher אולטרסוניקה מייצרת homogenizers קולי ביצועים גבוהים מ מַעבָּדָה ל גודל תעשייתי.


    נשמח לדון בתהליך שלך.

    בואו ניצור קשר.