ליזיס אולטרסוני של E. Coli

חיידקי E. coli הם החיידקים הנפוצים ביותר בשימוש במיקרוביולוגיה ובביוטכנולוגיה.
מכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים מספקים תוצאות אמינות וניתנות לשחזור בליזיס של E. coli.
קוויטציה וכוחות גזירה עזים, הניתנים עם זאת לשליטה מדויקת, מביאים לפירוק מלא ולתפוקות מיצוי גבוהות (למשל חלבונים, DNA).

מדוע פירוק תאים אולטרסוני של E. coli הוא השיטה המועדפת?

הומוגנייזרים אולטרסוניים או מכשירי סוניקציה עם גשושית מציעים כמה יתרונות לליזיס של E. coli, שכן אולטרסאונד בעוצמה גבוהה מפרק ביעילות את דופנות התאים ואת קרומיהם. מכשירי סוניקציה עם גשושית נמצאים בשימוש נרחב לליזיס של E. coli מהסיבות הבאות:

פירוק יעיל של דופנות התאים: לחיידק E. coli יש דופן תא קשיחה למחצה המורכבת מפפטידוגליקן, שעלולה להיות קשה לפירוק בשיטות ליזיס מסורתיות. מכשיר סוניקציה עם גשושית מפיק גלים אולטרסוניים בעוצמה גבוהה, היוצרים בועות קוויטציה בנוזל המקיף את התאים. כאשר בועות אלה קורסות, הן יוצרות סילוני נוזל במהירות גבוהה וגלי הלם הגורמים לפירוק מכני של דופנות התאים, וכך משחררים ביעילות תכולה תאית כגון ביומולקולות.

חדירה משופרת: הגלים האולטרסוניים שמפיקה הגשושית / הסונוטרודה יכולים לחדור לעומק הדגימה, להגיע למספר גדול יותר של תאי E. coli ולטפל בהם באופן אחיד. הדבר מסייע להבטיח ליזיס אחיד יותר בכל הדגימה, וכך משפר את יעילות פירוק התאים.

זמן עיבוד מקוצר: האנרגיה שמספק מכשיר הסוניקציה עם הגשושית מרוכזת וממוקדת מאוד, ומובילה לליזיס מהיר ויעיל של התאים. בהשוואה לשיטות אחרות, כגון ריסוק באמצעות חרוזים או ליזיס אנזימטי, סוניקציה יכולה להביא לליזיס של E. coli בתוך דקות ואף שניות. בעוד שטכניקות חלופיות רבות, כגון הקפאה והפשרה, דורשות כמה סבבי טיפול, ליזיס אולטרסוני פותח את התאים בשלב תהליך יחיד.

בקרת טמפרטורה: מכשירי סוניקציה מתקדמים מצוידים בחיישני טמפרטורה ובתוכנה חכמה, המאפשרת להגדיר טמפרטורה מרבית לתהליך. מכשיר הסוניקציה מפסיק לפעול אוטומטית כאשר הטמפרטורה מגיעה לערך הגבול, ומתחיל את תהליך הסוניקציה כאשר הטמפרטורה מגיעה לערך שהוגדר. קירור הדגימות באמבט קרח הוא שיטה פשוטה לשמירה על טמפרטורה נמוכה של הדגימות ולמניעת התפרקותן עקב חום.

יכולת הגדלת קנה המידה: מכשירי סוניקציה עם גשושית זמינים בגדלים שונים, ממכשירים ידניים ועד דגמים תעשייתיים בקנה מידה גדול. לכן הם מתאימים לעיבוד נפחים קטנים במעבדה או להגדלת קנה המידה ליישומי עיבוד ביולוגי גדולים יותר, כגון ייצור חיסונים או ביוסינתזה של מולקולות.

רב־שימושיות: מכשירי סוניקציה יכולים לשמש ליישומים שונים מעבר לליזיס של תאים, כגון גזירת DNA, מיצוי חלבונים, הומוגניזציה של רקמות, פיזור ננו־חלקיקים ותחלוב. לכן השקעה במכשיר סוניקציה עם גשושית מאפשרת שימושים מגוונים בסביבות מחקר או תעשייה.

סוניקטורים מסוג גשוש, כגון UP200St, הם מכשירים אמינים להומוגניזציה של רקמות ולפירוק תאים, ולכן הם נמצאים בשימוש נרחב להכנת דגימות בגנטיקה, למשל לליזיס של E.coli

מיצוי חלבונים מתאי E.coli מתבצע ביעילות באמצעות הגשושית האולטרסונית UP200St

מכשיר סוניקציה עם גשושית מציע יתרונות רבים לליזיס של E. coli. השליטה האמינה והמדויקת בפרמטרים של התהליך האולטרסוני מאפשרת למטב את פרמטרי ההפעלה, כגון הספק, משך הטיפול ואופן הטיפול בדגימה, כדי להשיג את התוצאות הרצויות.

מדריך זה מסביר איזה סוג של מכשיר על־קולי מתאים ביותר למשימות הכנת הדגימות שלכם, כגון המסה ופירוק של תאים, בידוד חלבונים וקיטוע DNA ו־RNA במעבדות, באנליזה ובמחקר. בחרו את סוג המכשיר העל־קולי המיטבי ליישום, לנפח הדגימה, למספר הדגימות ולתפוקה שלכם. ל־Hielscher Ultrasonics יש הומוגנייזר על־קולי אידיאלי עבורכם!

קיטוע DNA באמצעות אולטרסאונד משמש לעיתים קרובות כשלב בהכנת דגימות לריצוף מהדור הבא (NGS)

אנליזות אלקטרופורטיות של DNA גנומי של E. coli EDL933 שנחשף לסוניקציה במשך 0 – 15 min. האות L מציינת את סולם ה-DNA.
(מחקר ותמונה: ©Basselet et al. 2008)

פירוק תאים באמצעות קוויטציה אולטרסונית

הומוגנייזרים אולטרסוניים מסוג גשוש פועלים בכ-20,000 מחזורים בשנייה (בתדר של 20kHz) ויוצרים קוויטציה בנוזלים או בתרחיפים. קוויטציה אקוסטית יוצרת אזורים מיקרוסקופיים שבהם שוררים לחצים דמויי ריק וטמפרטורות גבוהות הקורעים תאים לגזרים. אף שהטמפרטורות עשויות להגיע לכמה אלפי מעלות צלזיוס, נפחי הקוויטציה קטנים כל כך שאינם מחממים את התהליך במידה משמעותית. קוויטציה אקוסטית וכוחות גזירה הנוצרים באמצעות אולטרסאונד מנקבים או שוברים את קרום התא של תאי חיידקים כגון E.coli. מכשירי האולטרסאונד של Hielscher מאפשרים שליטה מדויקת בפרמטרים של התהליך, כגון עוצמת האולטרסאונד, אמפליטודה, האנרגיה המושקעת וטמפרטורה. כך ניתן להתאים באופן מיטבי את תהליך הליזיס האולטרסוני לסוג התא, לתרבית התאים ולמטרת התהליך.

יתרונות הליזיס האולטרסוני

שליטה מדויקת בליזיס (עוצמה, אמפליטודה, טמפרטורה)
תוצאות אמינות וניתנות לשחזור
התאמה מיטבית לדגימות ספציפיות
בקרת טמפרטורה
לדגימות קטנות מאוד ועד גדולות מאוד (מ-µL ועד ליטרים)
טיפול מכני בלבד
הפעלה ידידותית למשתמש ובטוחה
הגדלת קנה מידה ליניארית מהמעבדה לייצור

המכשיר האולטרסוני VialTweeter מאפשר הכנה בו־זמנית של דגימות בעד 10 בקבוקונים באותם תנאי תהליך. (לחצו להגדלה!)

VialTweeter לליזיס אולטרסוני

הומוגנייזר אולטרסוני לעומת טכניקות ליזיס אחרות

בעוד שליזיס כימי ואנזימטי עלולים להיות בעייתיים – שכן ליזיס כימי עלול לשנות מבני חלבונים וליצור בעיות בטיהור, וליזיס אנזימטי דורש זמני הדגרה ארוכים ואינו ניתן לשחזור – פירוק אולטרסוני הוא שיטה מתקדמת ומהירה לפירוק תאים.
ליזיס אולטרסוני מבוסס על כוחות מכניים בלבד. לא מוסיפים חומרים כימיים; הסוניקציה שוברת את דופן התא באמצעות כוחות גזירה. ליזיס כימי עלול לשנות את מבנה החלבון וליצור בעיות בטיהור. פירוק אנזימטי דורש זמני הדגרה ארוכים ואינו ניתן לשחזור. פירוק אולטרסוני של תאי חיידקי E.coli הוא מהיר, פשוט, אמין וניתן לשחזור. לכן מכשירי האולטרסאונד של Hielscher משמשים במעבדות ביולוגיות וביוכימיות ברחבי העולם להכנת דגימות, לעבודה קדם-אנליטית, לאבחון במבחנה ולמגוון תבחינים.

המלצות כלליות לליזיס אולטרסוני

סוניקציה היא הטכניקה הפופולרית ביותר לליזיס של כמויות קטנות מאוד, בינוניות וגדולות של תרחיפי תאים – מפיקוליטרים ועד 100L/hr (באמצעות תא זרימה אולטרסוני). התאים עוברים ליזיס באמצעות גזירה בנוזל וקוויטציה. גם DNA עובר גזירה במהלך הסוניקציה, ולכן אין צורך להוסיף DNase לתרחיף התאים.

בקרת טמפרטורה במהלך ליזיס אולטרסוני של E.coli
באמצעות קירור מוקדם של הדגימה ושמירתה על קרח במהלך הסוניקציה, ניתן למנוע בקלות פירוק תרמי של הדגימה.
באופן אידיאלי, יש לשמור את הדגימות קרות כקרח במהלך הליזיס, אך עבור רוב הדגימות די בכך שהטמפרטורה לא תעלה מעל לטמפרטורת התרבית או רקמת המקור. לכן מומלץ לשמור את התרחיף על קרח ולבצע סוניקציה בכמה פולסים אולטרסוניים קצרים של 5–10 sec, עם הפסקות של 10–30 sec. במהלך ההפסקות החום יכול להתפזר, וכך ניתן לשוב לטמפרטורה נמוכה. עבור דגימות תאים גדולות יותר, זמינים כורים שונים בעלי תא זרימה עם מעטפות קירור.
קראו כאן טיפים והמלצות מפורטים לליזיס אולטרסוני מוצלח!

פרוטוקולים להכנה אולטרסונית של ליזטים של E. Coli

חוקרים משתמשים בהומוגנייזרים אולטרסוניים של Hielscher לפירוק תאי E.coli. להלן תוכלו למצוא פרוטוקולים שונים שנבדקו והוכחו לליזיס של E.coli באמצעות הומוגנייזרים אולטרסוניים של Hielscher, עבור מגוון יישומים הקשורים ל-E. coli.

גידול תאים, צילוב והכנת תמציות תאי E. coli באמצעות אולטרסאונד

לצורך ChIP-Chip של SeqA ושל RNA פולימראז, גודלו חיידקי E. coli MG1655 או MG1655 ΔseqA ב-37°C עד ל-OD₆₀₀ של כ־0.15 ב־50 ml של LB (+ 0.2% גלוקוז), לפני הוספת 27 μl פורמלדהיד (37%) לכל ml מצע (ריכוז סופי 1%). הצילוב בוצע בניעור אטי (100 rpm) בטמפרטורת החדר במשך 20 min, ולאחר מכן התגובה נעצרה באמצעות 10 ml גליצין בריכוז 2.5 M (ריכוז סופי 0.5 M). בניסויי הלם חום, חיידקי E. coli MG1655 גודלו ב־65 ml מצע LB בטמפרטורה של 30°C עד ל־OD₆₀₀ של כ־0.3. לאחר מכן הועברו 30 ml מהתרבית לבקבוק שחומם מראש ל־43°C, והיתרה נשמרה ב־30°C. הצילוב ועצירת התגובה בוצעו כמתואר לעיל, למעט העובדה שהתאים הוחזקו ב־30 או ב־43°C במשך 5 min לפני המשך הניעור האטי בטמפרטורת החדר. התאים נאספו בצנטריפוגה ונשטפו פעמיים ב־TBS קר (pH7.5). לאחר הרחפה מחדש ב־1 ml בופר ליזיס (10 mM Tris (pH 8.0), 20% סוכרוז, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml ליזוזים) והדגרה ב־37°C במשך 30 min, ולאחר הוספת 4 ml בופר IP, התאים עברו סוניקציה על קרח ב־12 מחזורים של 30 sec עם הפסקות של 30 sec, באמצעות המעבד האולטרסוני UP400St של Hielscher בהגדרת הספק של 100%. לאחר צנטריפוגה במשך 10 min ב־9000 g, מנות של 800 μl מהנוזל העליון אוחסנו ב־-20°C. (Waldminghaus 2010)

ייצור מוגבר וטיהור של אנזימים באמצעות גשוש אולטרסוני

לייצור מוגבר של חלבונים המתויגים בדקה־היסטידין (His10), בוצעה טרנספורמציה של חיידקי E. coli BL21(DE3) באמצעות קונסטרוקטים של pET19b. תרבית מקדימה שגודלה במשך הלילה נאספה בצנטריפוגה, ו־1% שימש לזריעת תרבית ביטוי. תאים הנושאים pET19mgtB גודלו ב־22°C עד לצפיפות אופטית באורך גל של 600 nm (OD600) של 0.7. התרבית הועברה ל־17°C והושרתה באמצעות 100 μM IPTG. לאחר 16 h, התרבית נאספה בצנטריפוגה ב־7,500 × g ב־4°C. התאים הורחפו מחדש בתמיסת מלח מבופרת בפוספט (PBS) בריכוז 50 mM עם 0.3 M NaCl ב־pH 7.4, ופורקו בסוניקציה באמצעות סונוטרודה S2 בעלת קצה זעיר במכשיר האולטרסוני UP200St של Hielscher, בהגדרת מחזור של 0.5 ובאמפליטודה של 75%.
הייצור המוגבר של GtfC המתויג בדקה־היסטידין הושרה ב־37°C ב־OD₆₀₀ של 0.6 באמצעות 100 μM IPTG. לאחר מכן התאים הודגרו במשך 4 h, נאספו ועברו ליזיס כמתואר לעיל עבור MgtB.
תמציות התאים הגולמיות עברו צנטריפוגה ב־15,000 × g וב־4°C לשיקוע שברי התאים. התמציות הצלולות הועמסו על עמודות HisTrap FF Crude בנפח 1-ml באמצעות מערכת ÄKTAprime Plus. האנזימים טוהרו בהתאם לפרוטוקול היצרן לאלוציה בגרדיאנט של חלבונים המתויגים ב־His. תמיסות החלבון שהתקבלו באלוציה עברו דיאליזה פעמיים כנגד 1,000 נפחים של 50 mM PBS, ב־pH 7.4, עם 0.3 M NaCl ב־4°C. הטיהור נבדק באמצעות 12% SDS-PAGE. ריכוז החלבון נקבע בשיטת ברדפורד באמצעות Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

מיצוי אולטרסוני של חלבון מחיידקי E. coli
חלבון פיתיון מבוקש (במקרה זה, MTV1 של Arabidopsis thaliana) מאוחה לתג GST ומבוטא בתאי BL21 של Escherichia coli (E. coli).

קחו משקע אחד של GST-MTV1 ומשקע אחד של GST (המקבילים ל־50 ml תרבית חיידקים), והרחיפו כל אחד מחדש ב־2.5 mL בופר מיצוי קר כקרח.
השתמשו במכשיר אולטרסוני UP100H (המצויד בסונוטרודה MS3 בעלת קצה זעיר לנפחים קטנים של כ־2–5mL) לפירוק תאי החיידקים עד להשלמת הליזיס, המתבטאת בירידה בעכירות ובעלייה בצמיגות. יש לבצע זאת על קרח, ומומלץ לבצע סוניקציה במקטעים (למשל, סוניקציה במשך 10 sec ולאחריה הפסקה של 10 sec על קרח, וכן הלאה). יש להקפיד שלא לבצע סוניקציה בעוצמה גבוהה מדי. אם נצפים הקצפה או היווצרות משקע לבן, יש להפחית את העוצמה.
העבירו את תמיסת החיידקים שעברו ליזיס למבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL ובצעו צנטריפוגה ב־4°C, ב־16,000 x g, במשך 20 min.

גשושים אולטרסוניים משתמשים בכוחות של קוויטציה אקוסטית לפירוק תאים ולמיצוי מולקולות ו־DNA מ־E.coli.

מכשירים אולטרסוניים בעלי גשוש, כגון UP400St, משתמשים בעיקרון הפעולה של קוויטציה אקוסטית לליזיס יעיל של E.coli.

ניתוח ביטוי וטיהור של חלבון רקומביננטי באמצעות סוניקציה

משקע תאי E. coli עבר סוניקציה באמצעות המכשיר האולטרסוני UP100H של Hielscher. לשם כך, משקע התאים הורחף מחדש בבופר ליזיס מצונן (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) וקורר על קרח במשך 10 min. לאחר מכן, תרחיף התאים עבר סוניקציה ב-10 פולסים קצרים של 10 s, עם הפסקה של 30 s לקירור לאחר כל פולס. לבסוף, שברי התאים הוסרו באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה ב-4°C במשך 15 min במהירות של 14,000 rpm. לאישור ביטוי rPR, הנוזל העליון הורץ בג'ל פוליאקרילאמיד בריכוז 12% ונבדק באמצעות SDS-PAGE ותספיג Western. טיהור rPR בוצע באמצעות שרף Ni2+-NTA (Invitrogen, ארה״ב) בהתאם להנחיות היצרן. בשלב זה נעשה שימוש בשיטת טיהור בתנאים טבעיים. ניקיון החלבון המטוהר הוערך באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד בריכוז 12% וצביעה בכחול קומאסי לאחר מכן. ריכוז החלבון המטוהר נמדד באמצעות ערכת Micro BCA לכימות חלבון (PIERCE, ארה״ב). (Azarnezhad et al. 2016)

סרטון זה מציג סונוטרודה על־קולית בצורת כוס בהספק של 200 ואט לפיזור, להומוגניזציה, למיצוי או לסילוק גזים מדגימות מעבדה.

הומוגנייזרים אולטרסוניים לליזיס של E. coli

Hielscher Ultrasonics מתכננת, מייצרת ומספקת הומוגנייזרים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים לליזיס אמין ויעיל של חיידקי E. coli ושל סוגי תאים אחרים, רקמות ותרביות תאים.
המבחר הרחב של גששים אולטרסוניים ושל מערכות לסוניקציה עקיפה מאפשר לנו להציע לכם את ההומוגנייזר האולטרסוני לרקמות האידיאלי ליישום פירוק התאים והמיצוי שלכם.

תכנון, ייצור וייעוץ – איכות תוצרת גרמניה

המכשירים האולטרסוניים של Hielscher ידועים בסטנדרטים הגבוהים ביותר של איכות ותכנון. תוכנה חכמה, תפריט אינטואיטיבי, הגדרות ניתנות לתכנות ותיעוד נתונים אוטומטי הם רק כמה מהמאפיינים של המכשירים האולטרסוניים של Hielscher. עמידות ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של המכשירים האולטרסוניים שלנו במתקני מחקר וביוטכנולוגיה. המכשירים האולטרסוניים של Hielscher מתמודדים בקלות גם עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.

Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO, והיא שמה דגש מיוחד על מכשירים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים, המשלבים טכנולוגיה מתקדמת ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, המכשירים האולטרסוניים של Hielscher תואמים לדרישות CE ועומדים בדרישות UL, CSA ו-RoHs.

הטבלה שלהלן מספקת אומדן של כושר העיבוד המשוער של המכשירים האולטרסוניים שלנו:

נפח אצווה	ספיקת זרימה	מכשירים מומלצים
פלטות מרובות באריות / פלטות מיקרוטיטר	n.a.	UIP400MTP
CupHorn לבקבוקונים או לכוס מעבדה	n.a.	CupHorn אולטרסוני
מיקרו-ריאקטור אולטרסוני בזרימה	n.a.	GDmini2
עד 10 בקבוקונים בנפח 0.5 עד 1.5mL	n.a.	VialTweeter
0.5 עד 1.5mL	n.a.	VialTweeter
1 עד 500mL	10 עד 200mL/min	UP100H
10 עד 2000mL	20 עד 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0.1 עד 20L	0.2 עד 4L/min	UIP2000hdT
10 עד 100L	2 עד 10L/min	UIP4000
n.a.	10 עד 100L/min	UIP16000
n.a.	גבוהה יותר	מערך של UIP16000

צרו איתנו קשר! / שאלו אותנו!

הסרטון מציג את מערכת הכנת הדגימות העל־קולית UIP400MTP, המאפשרת הכנה אמינה של דגימות בכל צלחת תקנית מרובת באריות באמצעות אולטרסאונד בעוצמה גבוהה. יישומים אופייניים של UIP400MTP כוללים פירוק תאים, גזירת DNA, RNA וכרומטין וכן מיצוי חלבונים.

פרוטוקולים נוספים לליזיס אולטרסוני של E. coli

חלבונים שעברו מודיפיקציה באמצעות אליצין ב-E. coli בעזרת VialTweeter אולטרסוני

קביעת תכולת קבוצות סולפהידריל באמצעות מבחן 5,5′-דיתיוביס(חומצה 2-ניטרובנזואית) (DTNB)
תרבית לילה של E. coli MG1655 שימשה לזריעת מצע מינימלי MOPS ביחס 1:100. התרבית גודלה בתנאים אירוביים עד שהושג A600 של 0.4. התרבית פוצלה לשלוש תרביות בנפח 15-ml לצורך טיפול עקה. תרבית שלא טופלה שימשה כביקורת שלילית. לאחת משתי התרביות הנותרות נוסף אליצין בריכוז 0.79 mM ‏(128 μg ml-1), ולאחרת נוסף דיאמיד בריכוז 1 mM. התרביות הודגרו במשך 15 min. מכל תרבית נאספו 5 ml באמצעות צנטריפוגציה (8,525 × g, 4°C, 10 min). התאים נשטפו פעמיים ב-1 ml של PBS ‏(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, שאוחסן בתנאים אנאירוביים לפני השימוש) ועברו צנטריפוגציה (13,000 × g, 4°C, 10 min). התאים הורחפו מחדש בבופר ליזיס (PBS עם 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) לפני פירוק ב-4°C באמצעות סוניקציה (VialTweeter – מכשיר סוניקציה, Hielscher GmbH, גרמניה) (3 × 1 min). שברי התאים שוקעו באמצעות צנטריפוגה (13,000 × g, 4 °C, 15 min). הנוזל העליון הועבר לקיווטת QS-macro בנפח 3.5-ml (10 mm) עם מוט ערבול מגנטי ועורבב עם 1 ml של בופר ליזיס. בליעת האור של הדגימות נוטרה באורך גל של 412 nm באמצעות ספקטרופוטומטר Jasco V-650 המצויד במחזיק תאים מבוקר טמפרטורה PSC-718, בטמפרטורת החדר. נוספו 100μl של תמיסת דיתיוביס(חומצה 2-ניטרובנזואית) בריכוז 3 mM. בליעת האור נוטרה עד שהגיעה לרוויה. ריכוז התיול חושב באמצעות מקדם הבליעה ϵ₄₁₂ = 13,700 M^-1 cm^-1 עבור חומצה תיו-2-ניטרובנזואית (TNB). ריכוזי התיול בתאים חושבו על בסיס נפח של 6.7 × 10^-15 ליטר לתא E. coli וצפיפות תאים של A600 = 0.5 (שוות ערך ל-1 × 10⁸ תאים ל-ml^-1 תרבית). (Müller et al. 2016)

קביעת גלוטתיון בתוך התאים באמצעות מכשיר אולטרסוני לפירוק תאים

E.coli MG1655 גודל במצע מינימלי MOPS בנפח כולל של 200ml עד שהושג A600 של 0.5. התרבית חולקה לתרביות בנפח 50-ml לצורך טיפול בעקה. לאחר הדגרה במשך 15 min עם אליצין בריכוז 0.79 mM, דיאמיד בריכוז 1 mM או דימתיל סולפוקסיד (ביקורת), התאים נאספו בצנטריפוגה ב-4,000g וב-4°C במשך 10 min. התאים נשטפו פעמיים בבופר KPE לפני הרחפה מחדש של המשקעים ב-700µl של בופר KPE. לסילוק חלבונים נוספו 300l של חומצה סולפוסליצילית בריכוז 10% (w/v) לפני פירוק התאים באמצעות סוניקציה (3 x 1 min; VialTweeter – מכשיר סוניקציה). הנוזלים העליונים נאספו לאחר צנטריפוגה (30 min, 13,000g, 4°C). ריכוזי החומצה הסולפוסליצילית הופחתו ל-1% באמצעות הוספת 3 נפחים של בופר KPE. מדידות של גלוטתיון כולל ושל GSSG בוצעו כמתואר לעיל. ריכוזי הגלוטתיון בתאים חושבו על בסיס נפח של 6.7×10^-15 ליטר לתא E. coli וצפיפות תאים של A600 0.5 (שוות ערך ל-1×10⁸ תאים ל-ml^-1 תרבית). ריכוזי GSH חושבו באמצעות חיסור של 2[GSSG] מהגלוטתיון הכולל. (Müller et al. 2016)

ביטוי של mAspAT אנושי ב-E. coli באמצעות הומוגנייזר אולטרסוני

מושבה יחידה של E. coli BL21 (DE3) הנושא את וקטור הביטוי הוכנסה ל-30 mL של מצע Luria-Bertani (LB) המכיל 100μg/mL אמפיצילין, ולאחר מכן גודלה ב-37ºC עד שהצפיפות האופטית (OD₆₀₀) הגיעה ל-0.6. התאים נאספו באמצעות צנטריפוגה ב-4,000 × g במשך 10 min, והורחפו מחדש ב-3L של מצע LB טרי המכיל 100μg/mL אמפיצילין.
לאחר מכן הושרה ביטוי החלבון באמצעות איזופרופיל β-ᴅ-1-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG) בריכוז 1 mM במשך 20 h ב-16ºC. התאים נאספו באמצעות צנטריפוגה ב-8,000 × g במשך 15 min ונשטפו בבופר A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4). מתרבית בנפח 3 L התקבלו כ-45g תאים (משקל רטוב). לאחר הצנטריפוגה, משקעי התאים הורחפו מחדש ב-40 mL (עבור תרבית בנפח 1 L) של בופר מיצוי A קר כקרח, ועברו ליזיס באמצעות סוניקציה בטמפרטורה קרה כקרח באמצעות המכשיר האולטרסוני לפירוק תאים UP400St של Hielscher. תוצר ליזיס התאים עבר צנטריפוגה ב-12,000 rpm במשך 15 min כדי להפריד בין המקטע המסיס (הנוזל העליון) למקטע ששקע (המשקע). (Jiang et al. 2015)

נושאים קשורים

עובדות שכדאי לדעת

E.coli

Escherichia coli (E. coli) הוא חיידק קוליפורמי גראם שלילי, אל־אווירני פקולטטיבי ובעל צורת מתג, המשתייך לסוג Escherichia ונמצא בדרך כלל בחלק התחתון של המעי של אורגניזמים בעלי דם חם (אנדותרמיים). קיימים זנים רבים (או תתי־סוגים) של E. coli בעלי מאפיינים מגוונים. רוב זני E. coli אינם מזיקים לבני אדם, למשל הזנים B ו־K-12, הנפוצים ביישומי מחקר במעבדות. עם זאת, חלק מהזנים מזיקים ועלולים לגרום למחלה קשה.
E. coli ממלא תפקיד חשוב בהנדסה ביולוגית מודרנית ובמיקרוביולוגיה תעשייתית, משום שקל לבצע מניפולציות בחיידק זה. יישומי מעבדה נפוצים שבהם משתמשים לעיתים קרובות ב־E. coli כוללים, למשל, יצירת חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) רקומביננטית או שימוש בו כאורגניזם מודל.
E. coli הוא פונדקאי רב־תכליתי מאוד לייצור חלבונים הטרולוגיים, וקיים מגוון רחב של מערכות לביטוי חלבונים המאפשרות לייצר חלבונים רקומביננטיים ב־E. coli. באמצעות פלסמידים המאפשרים ביטוי חלבונים ברמה גבוהה, ניתן להחדיר גנים לחיידקים וכך לייצר חלבונים אלה בכמויות גדולות בתהליכי תסיסה תעשייתיים.
חיידקי E.coli משמשים כמפעלי תאים לייצור אינסולין. יישומים נוספים כוללים שימוש בתאי E. coli שעברו שינוי לפיתוח ולייצור חיסונים ואנזימים מקובעים, לייצור דלקים ביולוגיים וכן לשיקום ביולוגי.
הזן K-12 הוא צורה מוטנטית של E. coli המבטאת ביתר את האנזים פוספטאז בסיסי (ALP). מוטציה זו מתרחשת עקב פגם בגן המקודד באופן מתמיד לאנזים. כאשר גן מייצר תוצר ללא כל עיכוב, הדבר מכונה פעילות קונסטיטוטיבית. צורה מוטנטית מסוימת זו משמשת לבידוד ולטיהור של האנזים ALP.
חיידקי E. coli משמשים גם באופן נרחב כמפעלי תאים. מיקרואורגניזמים מהונדסים (למשל חיידקים) ותאי צמח יכולים לשמש כמפעלי תאים, כפי שהם מכונים. תאים מהונדסים גנטית אלה מייצרים מולקולות, כימיקלים, פולימרים, חלבונים וחומרים אחרים, המשמשים למשל בתעשיות התרופות, המזון והכימיקלים. כדי לשחרר את המולקולות המיוצרות בתוך תאים מהונדסים ביולוגית אלה, ליזיס אולטרסוני הוא שיטה נפוצה לפירוק דופנות התאים ולהעברת חומרי המטרה לנוזל שסביבם. קראו עוד על ליזיס של תאים מהונדסים ביולוגית!

גזירת DNA באמצעות אולטרסאונד

כוחות גזירה אולטרסוניים משמשים בשיטה נפוצה לשחרור מולקולות, אברונים וחלבונים מתוך התא, וכן לשבירת גדילי DNA למקטעים. קוויטציה אקוסטית מפרקת את דופנות התאים ואת הקרומים כדי למצות DNA מהתאים וליצור מקטעים באורך של כ־600 – 800 bp, שהוא אידיאלי לאנליזה.
לחצו כאן כדי ללמוד עוד על הומוגנייזרים אולטרסוניים לקיטוע DNA!

ספרות / מקורות

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

אולטרסוניקה בביצועים גבוהים! מגוון המוצרים של Hielscher מכסה את מלוא הטווח, ממכשיר האולטרסוניקה המעבדתי הקומפקטי, דרך יחידות שולחניות ועד למערכות אולטרסוניות תעשייתיות מלאות.

Hielscher Ultrasonics מייצרת הומוגנייזרים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים בגדלים החל מגודל מעבדתי ועד לגודל תעשייתי.