ליזה קולית של תאים מהונדסים ביולוגית בייצור תעשייתי

מיני חיידקים מהונדסים ביולוגית כגון E. coli, כמו גם יונקים מהונדסים גנטית וסוגי תאים צמחיים, נמצאים בשימוש נרחב בביוטכנולוגיה כדי לבטא מולקולות. על מנת לשחרר ביו-מולקולות מסונתזות אלה, נדרשת טכניקת שיבוש תאים אמינה. אולטרסוניקציה בעלת ביצועים גבוהים היא שיטה מוכחת לליזה תאית יעילה ואמינה – ניתן להרחבה בקלות לתפוקות גדולות. Hielscher Ultrasonics מציעה לך ציוד קולי ביצועים גבוהים עבור ליזה התא יעיל על מנת לייצר כמויות גדולות של ביו-מולקולות באיכות גבוהה.

מיצוי מולקולות ממפעלי תאים

לייצור מגוון רחב של ביומולקולות, מיקרובים ותאי צמח מהונדסים שונים יכולים לשמש כמפעלי תאים מיקרוביאליים, כולל Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, לקטוקוקוס לקטי, ציאנובקטריה, שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), פיקיה פסטוריס (Pichia pastoris), יארויה ליפוליטיקה (Yarrowia lipolitica), ניקוטיאנה בנטמיאנה (Nicotiana benthamiana ) ואצות, בין רבים אחרים. מפעלי תאים אלה יכולים לייצר חלבונים, שומנים, ביוכימיקלים, פולימרים, דלקים ביולוגיים ואולאוכימיקלים, המשמשים כמזון או חומר גלם ליישומים תעשייתיים. תאים המשמשים כמפעלי תאים מתורבתים בביוריאקטורים סגורים, שם הם יכולים להשיג יעילות גבוהה, ספציפיות ודרישות אנרגיה נמוכות.
כדי לבודד את מולקולות המטרה מתרביות התאים המהונדסות ביולוגית, יש לשבש את התאים כך שהחומר התוך-תאי ישתחרר. משבשי תאים על-קוליים מבוססים היטב כטכניקה אמינה ויעילה ביותר לפירוק תאים ושחרור תרכובות.

מפעלי תאים מיקרוביאליים הם תאים מהונדסים מטבולית המשמשים לסינתזה של תרכובות יקרות ערך שונות. הפרעה בתאים על-קוליים היא שיטה יעילה ואמינה לשחרור התרכובות יקרות הערך מפנים התא.
מחקר וגרפיקה: ©Villaverde, 2010.

היתרונות של משבשי תאים קוליים

כטכנולוגיה לא תרמית, קלה אך יעילה ביותר, משבשים על-קוליים משמשים במעבדה ובתעשייה לליזה של תאים ולייצור תמציות באיכות גבוהה, למשל לבידוד מולקולות ממפעלי תאים.

אולטרסאונד כוח לשיבוש יעיל של מפעלי תאים מיקרוביאליים

מנגנון והשפעות של משבשי תאים אולטראסוניים:
שיבוש תאים קוליים השתמש בכוחם של גלי אולטרסאונד. ההומוגנייזר הקולי / משבש התא מצויד בבדיקה (aka sonotrode) העשויה מסגסוגת טיטניום המתנדנדת בתדר גבוה של כ. 20 קילוהרץ. משמעות הדבר היא שהגשושית העל-קולית משלבת 20,000 תנודות בשנייה לתוך הנוזל הסוניקטיבי. גלי האולטרסאונד המצומדים לנוזל מאופיינים במחזורי לחץ גבוה / לחץ נמוך לסירוגין. במהלך מחזור לחץ נמוך, הנוזל מתרחב ובועות ואקום זעירות עולות. בועות קטנות מאוד אלה גדלות על פני מספר מחזורי לחץ לסירוגין עד שאינן יכולות לספוג אנרגיה נוספת. בשלב זה, בועות הקוויטציה מתפוצצות באלימות ויוצרות באופן מקומי סביבה עתירת אנרגיה יוצאת דופן. תופעה זו ידועה בשם קוויטציה אקוסטית ומאופיינת בטמפרטורות מקומיות גבוהות מאוד, לחצים גבוהים מאוד וכוחות גזירה. לחצים אלה שוברים ביעילות את דפנות התא ומגבירים את העברת המסה בין פנים התא לבין הממס שמסביב. כטכניקה מכנית גרידא, כוחות גזירה שנוצרו אולטרה-סאונד נמצאים בשימוש נרחב ואת ההליך המומלץ עבור שיבוש תאים חיידקיים, כמו גם עבור בידוד חלבון. כשיטה פשוטה ומהירה לשיבוש תאים, סוניקציה אידיאלית לבידוד נפחים קטנים, בינוניים וגדולים. האולטרה-סוניקטורים הדיגיטליים של Hielscher מצוידים בתפריט ברור של הגדרות לבקרת סוניקציה מדויקת. כל נתוני הסוניק מאוחסנים אוטומטית בכרטיס SD מובנה והם פשוט נגישים. אפשרויות מתוחכמות של פיזור חום כגון קירור חיצוני, סוניקציה במצב פולס וכו 'במהלך תהליך ההתפוררות העל-קולי מבטיחות שמירה על טמפרטורת התהליך האידיאלית ובכך את שלמותן של תרכובות רגישות לחום שחולצו.

מחקרים מדגישים את נקודות החוזק של שיבוש וחילוץ תאים על-קוליים

פרופ' Chemat et al. (2017) מחדשים במחקרם כי "מיצוי בעזרת אולטרסאונד הוא חלופה ירוקה וכדאית כלכלית לטכניקות קונבנציונליות למזון ומוצרים טבעיים. היתרונות העיקריים הם ירידה בזמן המיצוי והעיבוד, כמות האנרגיה והממסים המשמשים, פעולות יחידה ו- CO₂ פליטות".
Gabig-Ciminska et al. (2014) השתמשו הומוגנייזר בלחץ גבוה ו dsintegrator תאים קולי במחקר שלהם עבור lysis של נבגים על מנת לשחרר DNA. בהשוואה בין שתי שיטות שיבוש התא, צוות המחקר מגיע למסקנה כי לגבי ליזה התא עבור DNA נבג, "הניתוח נעשה על ידי שימוש בליזטים של התא מההומוגניזציה בלחץ גבוה. לאחר מכן, הבנו כי שיבוש תאים קולי יש יתרונות בולטים למטרה זו. זה די מהיר וניתן לעבד אותו לכמויות מדגם קטנות". (Gabig-Ciminska et al., 2014)

ביומולקולות ממפעלי תאים לייצור מזון

מפעלי תאים מיקרוביאליים הם מתודולוגיית ייצור בת קיימא ויעילה המשתמשת באורגניזמים מיקרוביאליים כדי לייצר יבולים גבוהים של מטבוליטים מקומיים ולא מקומיים על ידי הנדסה ביולוגית מטבולית של מיקרואורגניזמים מיקרוביאליים כגון חיידקים, שמרים, פטריות וכו '. אנזימים בתפזורת, למשל, מיוצרים באמצעות מיקרואורגניזמים כמו Aspergillus oryzae, פטריות וחיידקים. אנזימים בתפזורת אלה משמשים לייצור מזון ומשקאות, כמו גם בחקלאות, ביו-אנרגיה וטיפול ביתי.
חיידקים מסוימים כגון Acetobacter xylinum ו- Gluconacetobacter xylinus מייצרים תאית בתהליך התסיסה, שבו ננו-סיבים מסונתזים בתהליך מלמטה למעלה. תאית חיידקית (הידועה גם בשם תאית מיקרוביאלית) מקבילה מבחינה כימית לתאית צמחית, אך יש לה רמה גבוהה של גבישיות וטוהר גבוה (ללא ליגנין, המיצלולוז, פקטין ורכיבים ביוגניים אחרים), כמו גם מבנה ייחודי של רשת מרושתת תלת-ממדית (תלת-ממדית) ארוגה בננו-סיבים. (ראה: Zhong, 2020) בהשוואה לתאית ממקור צמחי, תאית חיידקית היא בת קיימא יותר והתאית המיוצרת טהורה ואינה דורשת שלבי טיהור מורכבים. אולטרה-סוניקציה ומיצוי ממסים באמצעות NaOH או SDS (נתרן דודציל סולפט) יעילים מאוד לבידוד תאית חיידקית מתאי החיידקים.

ביומולקולות ממפעלי תאים לייצור תרופות וחיסונים

אחד המוצרים הפרמצבטיים הבולטים שמקורם במפעלי תאים הוא אינסולין אנושי. לייצור אינסולין מהונדס ביולוגית, בעיקר E. coli ו Saccharomyces cerevisiae משמשים. מאחר שמולקולות ננומטריות מסונתזות ביולוגית מציעות תאימות ביולוגית גבוהה, ננו-חלקיקים ביולוגיים כגון פריטין הם יתרון עבור יישומי ייצור ביולוגי רבים. בנוסף, הייצור במיקרובים מהונדסים מטבולית הוא לעתים קרובות יעיל יותר באופן משמעותי בתפוקות המתקבלות. לדוגמה, הייצור של חומצה ארטמיסינית, רסברטרול וליקופן גדל פי עשרה עד כמה מאות, והוא כבר מבוסס או נמצא בפיתוח לייצור בקנה מידה תעשייתי. (ראה: ליו ואח'; מיקרוב. עובדה סלולרית. 2017)
לדוגמה, ביומולקולות ננומטריות מבוססות חלבון עם תכונות הרכבה עצמית כגון פריטין וחלקיקים דמויי וירוסים מעניינות במיוחד לפיתוח חיסונים מכיוון שהן מחקות הן את הגודל והן את המבנה של פתוגנים, וניתן להשתמש בצמידות פני השטח של אנטיגנים כדי לקדם את האינטראקציה עם תאי מערכת החיסון. מולקולות כאלה מתבטאות במה שמכונה מפעלי תאים (למשל, זני E. coli מהונדסים), המייצרים מולקולת מטרה מסוימת.

פרוטוקול עבור ליזה קולית ושל E. coli BL21 לשחרור פריטין

פריטין הוא חלבון, שתפקידו העיקרי הוא אחסון ברזל. פריטין מראה יכולות מבטיחות כננו-חלקיקים בהרכבה עצמית בחיסונים, שם הוא משמש כרכב משלוח חיסונים (למשל חלבוני ספייק SARS-Cov-2). המחקר המדעי של Sun et. al. (2016) מראה כי פריטין רקומביננטי יכול להשתחרר כצורה מסיסה מ Escherichia coli בריכוזי NaCl נמוכים (≤50 mmol / L). על מנת לבטא פריטין ב- E. coli BL21 ולשחרר את הפרטין, הפרוטוקול הבא יושם בהצלחה. פלסמיד pET-28a/פריטין רקומביננטי הפך לזן E coli BL21 (DE3). תאי פריטין E coli BL21 (DE3) גודלו בתרבית במצע גידול LB עם 0.5% קנמיצין ב-37°C והושרו ב-OD600 של 0.6 עם 0.4% איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside למשך 3 שעות ב-37°C. התרבית הסופית נקטפה אז בצנטריפוגה במשקל 8000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והגלולה נאספה. לאחר מכן, הגלולה הושעתה מחדש במדיום LB (1% NaCl, 1% טיפון, 0.5% תמצית שמרים) / חיץ ליזיס (20 mmol / L Tris, 50 mmol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA, pH 7.6) ובריכוזים שונים של תמיסת NaCl (0, 50, 100, 170 ו- 300 mmol / L), בהתאמה. עבור ליזה של תאים חיידקיים, סוניקציה יושמה במצב דופק: למשל, באמצעות אולטרסוניקטור UP400St באמפליטודה של 100% עם מחזור עבודה של 5 שניות מופעל, 10 שניות כבוי, למשך 40 מחזורים) ולאחר מכן צנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך 15 דקות ב-4°C. supernatant ו precipitate נותחו על ידי נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE). כל הג'לים המוכתמים בנתרן דודציל סולפט נסרקו באמצעות סורק ברזולוציה גבוהה. תמונות ג'ל נותחו באמצעות תוכנת Magic Chemi 1D. לקבלת בהירות אופטימלית, זוהו רצועות חלבון על ידי התאמת פרמטרים. הנתונים עבור הלהקות נוצרו מטריפליקטים טכניים. (ראה: Sun et al., 2016)

משבשי תאים אולטראסוניים לליזה תעשייתית של מפעלי תאים

ליזה קולית ומיצוי היא שיטה אמינה ונוחה לשחרור מטבוליטים ממפעלי תאים ובכך מסייעת לייצור יעיל של מולקולות מטרה. משבשי תאים על-קוליים זמינים מגודל מעבדה לגודל תעשייתי וניתן לשנות את קנה המידה של תהליכים ליניאריים לחלוטין.
Hielscher Ultrasonics הוא השותף המוסמך שלך עבור משבשים קוליים בעלי ביצועים גבוהים ויש לו ניסיון רב שנים בתחום השתלת מערכות קוליות בהגדרות ספסל עליון ותעשייתי.
כשמדובר חומרה ותוכנה מתוחכמות, מערכות שיבוש תאים Hielscher Ultrasonics ממלא את כל הדרישות לבקרת תהליכים אופטימלית, הפעלה קלה וידידותיות למשתמש. לקוחות ומשתמשים של Hielscher ultrasonicators מעריכים את היתרון כי משבשי תאים קוליים Hielscher ומחלצים מאפשרים ניטור תהליך מדויק ובקרה – באמצעות תצוגת מגע דיגיטלית ושלט רחוק לדפדפן. כל נתוני הסוניקציה החשובים (למשל אנרגיה נטו, אנרגיה כוללת, משרעת, משך, טמפרטורה, לחץ) מאוחסנים אוטומטית כקובץ CSV בכרטיס SD משולב. זה עוזר להשיג תוצאות הניתנות לשחזור וחוזרות ומקל על סטנדרטיזציה של תהליכים, כמו גם על מימוש תנאי ייצור נאותים (cGMP).
כמובן, מעבדים קוליים Hielscher בנויים עבור פעולה 24/7 תחת עומס מלא ולכן ניתן להפעיל באופן אמין בהגדרות הייצור התעשייתי. בשל חוסן גבוה ותחזוקה נמוכה, זמן ההשבתה של ציוד קולי הוא נמוך מאוד. תכונות CIP (clean-in-place) ו-SIP (סטריליזציה במקום) ממזערות את הניקוי המייגע, במיוחד מכיוון שכל החלקים הרטובים הם משטחי מתכת חלקים (ללא פתחים או חרירים נסתרים).

הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה ליכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד שלנו: