ליזיס אולטרסוני של תאים מהונדסים ביולוגית בייצור תעשייתי

מיני חיידקים מהונדסים ביולוגית כגון E. coli, וכן סוגי תאים של יונקים וצמחים שעברו שינוי גנטי, נמצאים בשימוש נרחב בביוטכנולוגיה לביטוי מולקולות. כדי לשחרר את הביומולקולות המסונתזות הללו, נדרשת טכניקה אמינה לפירוק תאים. טיפול אולטרסוני בעל ביצועים גבוהים הוא שיטה מוכחת לליזיס יעיל ואמין של תאים – וניתן להתאימו בקלות להיקפי עיבוד גדולים. Hielscher Ultrasonics מציעה לכם ציוד אולטרסוני בעל ביצועים גבוהים לליזיס יעיל של תאים, לצורך ייצור כמויות גדולות של ביומולקולות באיכות גבוהה.

מיצוי מולקולות ממפעלים תאיים

לייצור מגוון רחב של ביומולקולות, ניתן להשתמש במיקרואורגניזמים מהונדסים ובתאי צמחים שונים כמפעלים תאיים מיקרוביאליים, ובהם Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ואצות, לצד רבים אחרים. מפעלים תאיים אלה יכולים לייצר חלבונים, ליפידים, חומרים ביוכימיים, פולימרים, דלקים ביולוגיים ואולאוכימיקלים, המשמשים כמזון או כחומר גלם ליישומים תעשייתיים. תאים המשמשים כמפעלים תאיים מגודלים בביוריאקטורים סגורים, שבהם הם יכולים להשיג יעילות גבוהה, סגוליות ודרישות אנרגיה נמוכות.
כדי לבודד את מולקולות המטרה מתרביות התאים המהונדסים ביולוגית, יש לפרק את התאים כך שהחומר התוך־תאי ישתחרר. השימוש במפרקי תאים אולטרסוניים מבוסס היטב כטכניקה אמינה ויעילה ביותר לפירוק תאים ולשחרור תרכובות.

מפעלים תאיים מיקרוביאליים הם תאים שעברו הנדסה מטבולית ומשמשים לסינתזה של תרכובות שונות בעלות ערך. פירוק תאים אולטרסוני הוא שיטה יעילה ואמינה לשחרור התרכובות בעלות הערך מתוך התא.
מחקר ותרשים: ©Villaverde, 2010.

יתרונותיהם של מפרקי תאים אולטרסוניים

כטכנולוגיה לא תרמית, עדינה ועם זאת יעילה ביותר, מפרקי תאים אולטרסוניים משמשים במעבדה ובתעשייה לליזיס של תאים ולהפקת מיצויים באיכות גבוהה, המשמשים למשל לבידוד מולקולות ממפעלים תאיים.

אולטרסאונד בעוצמה גבוהה לפירוק יעיל של מפעלים תאיים מיקרוביאליים

המנגנון וההשפעות של מפרקי תאים אולטרסוניים:
פירוק תאים אולטרסוני מנצל את עוצמתם של גלי אולטרסאונד. ההומוגנייזר האולטרסוני / מפרק התאים מצויד בגשוש (המכונה גם סונוטרודה) העשוי מסגסוגת טיטניום ורוטט בתדירות גבוהה של כ־20 kHz. משמעות הדבר היא שהגשוש האולטרסוני מעביר 20,000 תנודות בשנייה אל הנוזל העובר סוניקציה. גלי האולטרסאונד המועברים אל הנוזל מאופיינים במחזורים מתחלפים של לחץ גבוה / לחץ נמוך. במהלך מחזור של לחץ נמוך, הנוזל מתפשט ונוצרות בועות ריק זעירות. בועות קטנות מאוד אלה גדלות לאורך כמה מחזורי לחץ מתחלפים עד שאינן יכולות לספוג עוד אנרגיה. בשלב זה, בועות הקוויטציה קורסות פנימה בעוצמה ויוצרות באופן מקומי סביבה בעלת צפיפות אנרגיה יוצאת דופן. תופעה זו מכונה קוויטציה אקוסטית ומאופיינת באופן מקומי בטמפרטורות גבוהות מאוד, בלחצים גבוהים מאוד ובכוחות גזירה. מאמצי גזירה אלה שוברים ביעילות את דופנות התאים ומגבירים את מעבר המסה בין פנים התא לממס שסביבו. כוחות גזירה הנוצרים באמצעות אולטרסאונד הם טכניקה מכנית לחלוטין, הנמצאת בשימוש נרחב ומהווה את ההליך המומלץ לפירוק תאי חיידקים וכן לבידוד חלבונים. כשיטה פשוטה ומהירה לפירוק תאים, סוניקציה אידאלית לבידוד בנפחים קטנים, בינוניים וגדולים. מכשירי האולטרסאונד הדיגיטליים של Hielscher מצוידים בתפריט הגדרות ברור לבקרה מדויקת על הסוניקציה. כל נתוני הסוניקציה נשמרים אוטומטית בכרטיס SD מובנה ונגישים בקלות. אפשרויות מתקדמות לפיזור חום, כגון קירור חיצוני, סוניקציה במצב פעימות וכדומה במהלך תהליך הפירוק האולטרסוני, מבטיחות שמירה על טמפרטורת התהליך האידאלית, ובכך על שלמותן של התרכובות הרגישות לחום שמוצו.

מחקרים מדגישים את יתרונות הפירוק והמיצוי האולטרסוניים של תאים

פרופ' Chemat ועמיתיו (2017) מסכמים במחקרם כי ”מיצוי בסיוע אולטרסאונד הוא חלופה ירוקה ובת־קיימא מבחינה כלכלית לטכניקות קונבנציונליות למזון ולמוצרים טבעיים. היתרונות העיקריים הם הפחתת זמני המיצוי והעיבוד, כמות האנרגיה והממסים שבהם נעשה שימוש, מספר פעולות היחידה ופליטות CO₂ .”
Gabig-Ciminska ועמיתיו (2014) השתמשו במחקרם בהומוגנייזר בלחץ גבוה ובמפרק תאים אולטרסוני לליזיס של נבגים כדי לשחרר DNA. בהשוואה בין שתי השיטות לפירוק תאים, צוות המחקר מסיק כי בכל הנוגע לליזיס תאים לצורך הפקת DNA מנבגים, ”האנליזה בוצעה באמצעות תוצרי ליזיס של תאים שהתקבלו מהומוגניזציה בלחץ גבוה. לאחר מכן הבנו שלפירוק תאים אולטרסוני יש יתרונות יוצאי דופן למטרה זו. הוא מהיר למדי וניתן לבצעו בנפחי דגימה קטנים.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

ביומולקולות ממפעלי תאים לייצור מזון

מפעלי תאים מיקרוביאליים הם שיטת ייצור ישימה ויעילה המשתמשת באורגניזמים מיקרוביאליים להפקת תפוקות גבוהות של מטבוליטים שמקורם באורגניזם עצמו ושל מטבוליטים זרים לו, באמצעות הנדסה ביולוגית מטבולית של מיקרואורגניזמים כגון חיידקים, שמרים, פטריות וכו'. אנזימים בכמויות גדולות מיוצרים, למשל, באמצעות מיקרואורגניזמים כגון Aspergillus oryzae, פטריות וחיידקים. אנזימים אלה משמשים לייצור מזון ומשקאות, וכן בחקלאות, בביו־אנרגיה ובמוצרי תחזוקה לבית.
חיידקים מסוימים, כגון Acetobacter xylinum ו־Gluconacetobacter xylinus, מייצרים תאית בתהליך התסיסה, שבו ננו־סיבים מסונתזים בתהליך של בנייה מלמטה למעלה. תאית חיידקית (המכונה גם תאית מיקרוביאלית) שקולה מבחינה כימית לתאית צמחית, אך יש לה דרגת גבישיות גבוהה וטוהר גבוה (ללא ליגנין, המיצלולוז, פקטין ורכיבים ביוגניים אחרים), וכן מבנה ייחודי של רשת תלת־ממדית (3D) הארוגה מננו־סיבי תאית. (cf. Zhong, 2020) בהשוואה לתאית ממקור צמחי, תאית חיידקית היא בת־קיימא יותר, והתאית המיוצרת טהורה ואינה דורשת שלבי טיהור מורכבים. טיפול אולטרסוני ומיצוי בממס באמצעות NaOH או SDS (נתרן דודציל סולפט) יעילים מאוד לבידוד תאית חיידקית מתאי החיידקים.

ביומולקולות ממפעלי תאים לייצור תרופות וחיסונים

אחד המוצרים הפרמצבטיים הבולטים ביותר המופקים ממפעלי תאים הוא אינסולין אנושי. לייצור אינסולין בהנדסה ביולוגית משתמשים בעיקר ב־E. coli וב־Saccharomyces cerevisiae. מכיוון שמולקולות בגודל ננומטרי המסונתזות באופן ביולוגי מציעות תאימות ביולוגית גבוהה, לננו־חלקיקים ביולוגיים כגון פריטין יש יתרונות ביישומים רבים של ייצור ביולוגי. נוסף על כך, ייצור במיקרואורגניזמים שעברו הנדסה מטבולית יעיל לעיתים קרובות במידה ניכרת יותר מבחינת התפוקות המתקבלות. לדוגמה, ייצור חומצה ארטמיסינית, רסברטרול וליקופן גדל פי עשרה עד פי כמה מאות, וכבר מבוסס בקנה מידה תעשייתי או נמצא בתהליך פיתוח לקראת ייצור בקנה מידה זה. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
למשל, ביומולקולות מבוססות חלבון בגודל ננומטרי בעלות תכונות של הרכבה עצמית, כגון פריטין וחלקיקים דמויי נגיף, מעניינות במיוחד לפיתוח חיסונים, מכיוון שהן מחקות הן את גודלם והן את מבנם של פתוגנים ומאפשרות צימוד אנטיגנים לפני השטח שלהן כדי לקדם אינטראקציה עם תאי מערכת החיסון. מולקולות כאלה מבוטאות במה שמכונה מפעלי תאים (למשל, זני E. coli מהונדסים), המייצרים מולקולת מטרה מסוימת.

פרוטוקול לליזיס אולטרסוני של E. coli BL21 לשחרור פריטין

פריטין הוא חלבון שתפקידו העיקרי הוא אגירת ברזל. פריטין מציג יכולות מבטיחות כננו־חלקיקים המתארגנים בהרכבה עצמית בחיסונים, שבהם הוא משמש כנשא להובלת רכיבי חיסון (למשל חלבוני הספייק של SARS-Cov-2). המחקר המדעי של Sun ועמיתיו (2016) מראה שניתן לשחרר פריטין רקומביננטי בצורה מסיסה מתוך Escherichia coli בריכוזי NaCl נמוכים (≤50 mmol/L). כדי לבטא פריטין ב־E. coli BL21 ולשחרר את הפריטין, יושם בהצלחה הפרוטוקול הבא. הפלסמיד הרקומביננטי pET-28a/ferritin הוחדר באמצעות טרנספורמציה לזן E coli BL21 (DE3). תאי E coli BL21 (DE3) המבטאים פריטין גודלו במצע גידול LB עם 0.5% קנמיצין בטמפרטורה של 37°C, והביטוי הושרה כאשר OD600 הגיע ל־0.6, באמצעות 0.4% איזופרופיל-β-D-תיוגלקטופירנוזיד למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C. לאחר מכן נאספה התרבית הסופית באמצעות צנטריפוגה ב־8000g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C, והמשקע נאסף. לאחר מכן הורחף המשקע מחדש במצע LB (1% NaCl, 1% Typone, 0.5% תמצית שמרים)/בופר ליזיס (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) ובתמיסת NaCl בריכוזים שונים (0, 50, 100, 170 ו־300 mmol/L), בהתאמה. לליזיס של תאי החיידקים בוצעה סוניקציה במצב פולסים: למשל, באמצעות מכשיר האולטרסאונד UP400St במשרעת של 100% עם מחזור פעולה של 5 שניות הפעלה, 10 שניות השבתה, למשך 40 מחזורים) ולאחר מכן בוצעה צנטריפוגה ב־10 000g למשך 15 דקות ב־4°C. הנוזל העליון והמשקע נותחו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד בנוכחות נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE). כל הג'לים שנצבעו בנתרן דודציל סולפט נסרקו בסורק ברזולוציה גבוהה. תמונות הג'לים נותחו באמצעות תוכנת Magic Chemi 1D. להשגת בהירות מיטבית, פסי החלבון זוהו באמצעות התאמת פרמטרים. הנתונים עבור הפסים הופקו משלוש חזרות טכניות. (cf. Sun et al., 2016)

מכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים לצורך ליזיס תעשייתי של מפעלי תאים

ליזיס ומיצוי אולטרסוניים הם שיטה אמינה ונוחה לשחרור מטבוליטים ממפעלי תאים, ובכך מסייעים לייצור יעיל של מולקולות מטרה. מכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים זמינים בגדלים המתאימים למעבדה ועד לתעשייה, וניתן להגדיל את קנה המידה של התהליכים באופן ליניארי לחלוטין.
Hielscher Ultrasonics היא השותפה המקצועית שלכם למכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים בעלי ביצועים גבוהים, ולה ניסיון רב שנים בהתקנת מערכות אולטרסוניות במתקנים שולחניים ותעשייתיים.
בכל הנוגע לחומרה ולתוכנה מתקדמות, מערכות פירוק התאים של Hielscher Ultrasonics עומדות בכל הדרישות לבקרת תהליך מיטבית, לתפעול קל ולידידותיות למשתמש. לקוחות ומשתמשים במכשירים האולטרסוניים של Hielscher מעריכים את היתרון שמציעים מכשירי פירוק התאים והמיצוי האולטרסוניים של Hielscher: אפשרות לניטור ולבקרה מדויקים של התהליך – באמצעות צג מגע דיגיטלי ושליטה מרחוק דרך דפדפן. כל נתוני הסוניקציה החשובים (למשל אנרגיה נטו, אנרגיה כוללת, משרעת, משך, טמפרטורה ולחץ) נשמרים אוטומטית כקובץ CSV בכרטיס SD משולב. הדבר מסייע להשגת תוצאות הניתנות לשחזור ולחזרה, ומקל על תקנון התהליך וכן על עמידה בתנאי ייצור נאותים (cGMP).
כמובן, המעבדים האולטרסוניים של Hielscher בנויים לפעולה 24/7 בעומס מלא, ולכן ניתן להפעילם באמינות במתקני ייצור תעשייתיים. בזכות עמידות גבוהה ודרישות תחזוקה נמוכות, זמן ההשבתה של הציוד האולטרסוני נמוך מאוד. תכונות CIP (ניקוי במקום) ו־SIP (עיקור במקום) ממזערות את עבודת הניקוי המאומצת, במיוחד מכיוון שכל החלקים הבאים במגע עם הנוזל הם משטחי מתכת חלקים (ללא פתחים או פיות נסתרים).

הטבלה שלהלן נותנת אינדיקציה לקיבולת העיבוד המשוערת של המכשירים האולטרסוניים שלנו: