ליזה קולית של תאים מהונדסים ביולוגית בייצור תעשייתי

מיני חיידקים מהונדסים ביולוגית כגון E. coli, כמו גם יונקים מהונדסים גנטית וסוגי תאים צמחיים, נמצאים בשימוש נרחב בביוטכנולוגיה כדי לבטא מולקולות. על מנת לשחרר ביו-מולקולות מסונתזות אלה, נדרשת טכניקת שיבוש תאים אמינה. אולטרסוניקציה בעלת ביצועים גבוהים היא שיטה מוכחת לליזה תאית יעילה ואמינה – ניתן להרחבה בקלות לתפוקות גדולות. Hielscher Ultrasonics מציעה לך ציוד קולי ביצועים גבוהים עבור ליזה התא יעיל על מנת לייצר כמויות גדולות של ביו-מולקולות באיכות גבוהה.

מיצוי מולקולות ממפעלי תאים

לייצור מגוון רחב של ביומולקולות, מיקרובים ותאי צמח מהונדסים שונים יכולים לשמש כמפעלי תאים מיקרוביאליים, כולל Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, לקטוקוקוס לקטי, ציאנובקטריה, שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), פיקיה פסטוריס (Pichia pastoris), יארויה ליפוליטיקה (Yarrowia lipolitica), ניקוטיאנה בנטמיאנה (Nicotiana benthamiana ) ואצות, בין רבים אחרים. מפעלי תאים אלה יכולים לייצר חלבונים, שומנים, ביוכימיקלים, פולימרים, דלקים ביולוגיים ואולאוכימיקלים, המשמשים כמזון או חומר גלם ליישומים תעשייתיים. תאים המשמשים כמפעלי תאים מתורבתים בביוריאקטורים סגורים, שם הם יכולים להשיג יעילות גבוהה, ספציפיות ודרישות אנרגיה נמוכות.
כדי לבודד את מולקולות המטרה מתרביות התאים המהונדסות ביולוגית, יש לשבש את התאים כך שהחומר התוך-תאי ישתחרר. משבשי תאים על-קוליים מבוססים היטב כטכניקה אמינה ויעילה ביותר לפירוק תאים ושחרור תרכובות.

מפעלי תאים מיקרוביאליים הם תאים מהונדסים מטבולית המשמשים לסינתזה של תרכובות יקרות ערך שונות. הפרעה בתאים על-קוליים היא שיטה יעילה ואמינה לשחרור התרכובות יקרות הערך מפנים התא.מחקר וגרפיקה: ©Villaverde, 2010.

היתרונות של משבשי תאים קוליים

כטכנולוגיה לא תרמית, קלה אך יעילה ביותר, משבשים על-קוליים משמשים במעבדה ובתעשייה לליזה של תאים ולייצור תמציות באיכות גבוהה, למשל לבידוד מולקולות ממפעלי תאים.

אולטרסאונד כוח לשיבוש יעיל של מפעלי תאים מיקרוביאליים

מנגנון והשפעות של משבשי תאים אולטראסוניים:
Ultrasonic cell disruption used the power of ultrasound waves. The ultrasonic homogenizer? cell disruptor is equipped with a probe (aka sonotrode) made from titanium alloy that oscillates at a high frequency of approx. 20 kHz. This means the ultrasonic probe couples 20,000 vibrations per second into the sonicated liquid. The ultrasound waves coupled into the liquid are characterized by alternating high-pressure? low-pressure cycles. During a low pressure cycle, the liquid expands and minute vacuum bubbles arise. These very small bubbles grow over several alternating pressure cycles until they cannot absorb any further energy. At this point, the cavitation bubbles implode violently and create locally an extraordinary energy-dense environment. This phenomenon is known as acoustic cavitation and is characterized by locally very high temperatures, very high pressures and shear forces. These shear stresses break efficiently cell walls and increase mass transfer between the cell interior and the surrounding solvent. As a purely mechanical technique, ultrasonically generated shear forces are widely used and the recommended procedure for bacterial cell disruption, as well as for protein isolation. As a simple and rapid cell disruption method, sonication is ideal for the isolation of small, medium and large sized volumes. Hielscher’s digital ultrasonicators are equipped with a clear menu of settings for precise sonication control. All sonication data are automatically stored on a built-in SD-card and are simply accessible. Sophisticated options of heat dissipation such as external cooling, sonication in puls mode etc. during the ultrasonic disintegration process ensure the maintenance of the ideal process temperature and thereby the intactness of extracted heat-sensitive compounds.

מחקרים מדגישים את נקודות החוזק של שיבוש וחילוץ תאים על-קוליים

Prof. Chemat et al. (2017) resumes in their study that “ultrasound-assisted extraction is a green and economically viable alternative to conventional techniques for food and natural products. The main benefits are decrease of extraction and processing time, the amount of energy and solvents used, unit operations, and CO₂ emissions.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) used a high-pressure homogenizer and an ultrasonic cell dsintegrator in their study for the lysis of spores in order to release DNA. Comparing both cell disruption methods, the research team concludes that regarding the cell lysis for spore DNA, “analysis has been done by employing cell lysates from the high pressure homogenization. Afterwards, we realized that an ultrasonic cell disruption has outstanding advantages for this purpose. It is rather fast and can be processed for small sample volumes.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

ביומולקולות ממפעלי תאים לייצור מזון

מפעלי תאים מיקרוביאליים הם מתודולוגיית ייצור בת קיימא ויעילה המשתמשת באורגניזמים מיקרוביאליים כדי לייצר יבולים גבוהים של מטבוליטים מקומיים ולא מקומיים על ידי הנדסה ביולוגית מטבולית של מיקרואורגניזמים מיקרוביאליים כגון חיידקים, שמרים, פטריות וכו '. אנזימים בתפזורת, למשל, מיוצרים באמצעות מיקרואורגניזמים כמו Aspergillus oryzae, פטריות וחיידקים. אנזימים בתפזורת אלה משמשים לייצור מזון ומשקאות, כמו גם בחקלאות, ביו-אנרגיה וטיפול ביתי.
חיידקים מסוימים כגון Acetobacter xylinum ו- Gluconacetobacter xylinus מייצרים תאית בתהליך התסיסה, שבו ננו-סיבים מסונתזים בתהליך מלמטה למעלה. תאית חיידקית (הידועה גם בשם תאית מיקרוביאלית) מקבילה מבחינה כימית לתאית צמחית, אך יש לה רמה גבוהה של גבישיות וטוהר גבוה (ללא ליגנין, המיצלולוז, פקטין ורכיבים ביוגניים אחרים), כמו גם מבנה ייחודי של רשת מרושתת תלת-ממדית (תלת-ממדית) ארוגה בננו-סיבים. (ראה: Zhong, 2020) בהשוואה לתאית ממקור צמחי, תאית חיידקית היא בת קיימא יותר והתאית המיוצרת טהורה ואינה דורשת שלבי טיהור מורכבים. אולטרה-סוניקציה ומיצוי ממסים באמצעות NaOH או SDS (נתרן דודציל סולפט) יעילים מאוד לבידוד תאית חיידקית מתאי החיידקים.

ביומולקולות ממפעלי תאים לייצור תרופות וחיסונים

אחד המוצרים הפרמצבטיים הבולטים שמקורם במפעלי תאים הוא אינסולין אנושי. לייצור אינסולין מהונדס ביולוגית, בעיקר E. coli ו Saccharomyces cerevisiae משמשים. מאחר שמולקולות ננומטריות מסונתזות ביולוגית מציעות תאימות ביולוגית גבוהה, ננו-חלקיקים ביולוגיים כגון פריטין הם יתרון עבור יישומי ייצור ביולוגי רבים. בנוסף, הייצור במיקרובים מהונדסים מטבולית הוא לעתים קרובות יעיל יותר באופן משמעותי בתפוקות המתקבלות. לדוגמה, הייצור של חומצה ארטמיסינית, רסברטרול וליקופן גדל פי עשרה עד כמה מאות, והוא כבר מבוסס או נמצא בפיתוח לייצור בקנה מידה תעשייתי. (ראה: ליו ואח'; מיקרוב. עובדה סלולרית. 2017)
לדוגמה, ביומולקולות ננומטריות מבוססות חלבון עם תכונות הרכבה עצמית כגון פריטין וחלקיקים דמויי וירוסים מעניינות במיוחד לפיתוח חיסונים מכיוון שהן מחקות הן את הגודל והן את המבנה של פתוגנים, וניתן להשתמש בצמידות פני השטח של אנטיגנים כדי לקדם את האינטראקציה עם תאי מערכת החיסון. מולקולות כאלה מתבטאות במה שמכונה מפעלי תאים (למשל, זני E. coli מהונדסים), המייצרים מולקולת מטרה מסוימת.

פרוטוקול עבור ליזה קולית ושל E. coli BL21 לשחרור פריטין

פריטין הוא חלבון, שתפקידו העיקרי הוא אחסון ברזל. פריטין מראה יכולות מבטיחות כננו-חלקיקים בהרכבה עצמית בחיסונים, שם הוא משמש כרכב משלוח חיסונים (למשל חלבוני ספייק SARS-Cov-2). המחקר המדעי של Sun et. al. (2016) מראה כי פריטין רקומביננטי יכול להשתחרר כצורה מסיסה מ Escherichia coli בריכוזי NaCl נמוכים (≤50 mmol? L). על מנת לבטא פריטין ב- E. coli BL21 ולשחרר את הפרטין, הפרוטוקול הבא יושם בהצלחה. פלסמיד pET-28a/פריטין רקומביננטי הפך לזן E coli BL21 (DE3). תאי פריטין E coli BL21 (DE3) גודלו בתרבית במצע גידול LB עם 0.5% קנמיצין ב-37°C והושרו ב-OD600 של 0.6 עם 0.4% איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside למשך 3 שעות ב-37°C. התרבית הסופית נקטפה אז בצנטריפוגה במשקל 8000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והגלולה נאספה. לאחר מכן, הגלולה הושעתה מחדש במדיום LB (1% NaCl, 1% טיפון, 0.5% תמצית שמרים)? חיץ ליזיס (20 mmol? L Tris, 50 mmol? L NaCl, 1 mmol? L EDTA, pH 7.6) ובריכוזים שונים של תמיסת NaCl (0, 50, 100, 170 ו- 300 mmol? L), בהתאמה. עבור ליזה של תאים חיידקיים, סוניקציה יושמה במצב דופק: למשל, באמצעות אולטרסוניקטור UP400St באמפליטודה של 100% עם מחזור עבודה של 5 שניות מופעל, 10 שניות כבוי, למשך 40 מחזורים) ולאחר מכן צנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך 15 דקות ב-4°C. supernatant ו precipitate נותחו על ידי נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE). כל הג'לים המוכתמים בנתרן דודציל סולפט נסרקו באמצעות סורק ברזולוציה גבוהה. תמונות ג'ל נותחו באמצעות תוכנת Magic Chemi 1D. לקבלת בהירות אופטימלית, זוהו רצועות חלבון על ידי התאמת פרמטרים. הנתונים עבור הלהקות נוצרו מטריפליקטים טכניים. (ראה: Sun et al., 2016)

משבשי תאים אולטראסוניים לליזה תעשייתית של מפעלי תאים

ליזה קולית ומיצוי היא שיטה אמינה ונוחה לשחרור מטבוליטים ממפעלי תאים ובכך מסייעת לייצור יעיל של מולקולות מטרה. משבשי תאים על-קוליים זמינים מגודל מעבדה לגודל תעשייתי וניתן לשנות את קנה המידה של תהליכים ליניאריים לחלוטין.
Hielscher Ultrasonics הוא השותף המוסמך שלך עבור משבשים קוליים בעלי ביצועים גבוהים ויש לו ניסיון רב שנים בתחום השתלת מערכות קוליות בהגדרות ספסל עליון ותעשייתי.
כשמדובר חומרה ותוכנה מתוחכמות, מערכות שיבוש תאים Hielscher Ultrasonics ממלא את כל הדרישות לבקרת תהליכים אופטימלית, הפעלה קלה וידידותיות למשתמש. לקוחות ומשתמשים של Hielscher ultrasonicators מעריכים את היתרון כי משבשי תאים קוליים Hielscher ומחלצים מאפשרים ניטור תהליך מדויק ובקרה – באמצעות תצוגת מגע דיגיטלית ושלט רחוק לדפדפן. כל נתוני הסוניקציה החשובים (למשל אנרגיה נטו, אנרגיה כוללת, משרעת, משך, טמפרטורה, לחץ) מאוחסנים אוטומטית כקובץ CSV בכרטיס SD משולב. זה עוזר להשיג תוצאות הניתנות לשחזור וחוזרות ומקל על סטנדרטיזציה של תהליכים, כמו גם על מימוש תנאי ייצור נאותים (cGMP).
כמובן, מעבדים קוליים Hielscher בנויים עבור פעולה 24/7 תחת עומס מלא ולכן ניתן להפעיל באופן אמין בהגדרות הייצור התעשייתי. בשל חוסן גבוה ותחזוקה נמוכה, זמן ההשבתה של ציוד קולי הוא נמוך מאוד. תכונות CIP (clean-in-place) ו-SIP (סטריליזציה במקום) ממזערות את הניקוי המייגע, במיוחד מכיוון שכל החלקים הרטובים הם משטחי מתכת חלקים (ללא פתחים או חרירים נסתרים).

הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה ליכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד שלנו: