פרוטוקול להשבתת נגיף הקורונה SARS-CoV-2 עם סוניקציה

Hielscher VialTweeter הוא יחידת הכנה קולית ייחודית מרובת דגימות, המשמשת להשבתת נגיף הקורונה SARS-COV-2. ה- VialTweeter מאפשר להכין עד 10 בקבוקוני דגימה בו זמנית ובכך הוא היחידה האידיאלית לעיבוד דגימה המונית.

השבתה של נגיף הקורונה SARS-CoV-2 עם ה- VialTweeter

לאחר הסרת הקיבוע, חד-שכבות נשטפו שלוש פעמים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) לפני גירוד תאים ל-1mL MEM / 5% FBS וסוניקו (3 × 10 שניות על, 10 שניות כבוי ב-100% עוצמה ומשרעת) באמצעות המעבד האולטרסוני Hielscher UP200St עם VialTweeter קובץ מצורף. Supernatants הובהרו על ידי צנטריפוגה ב 3000 × גרם במשך 10 דקות. 

קרא את הפרוטוקול המלא כאן עבור השבתת נגיף הקורונה SARS-CoV-2 על ידי Welch et al. (2020) להלן:

תאים ווירוסים

תאי Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) תורבתו בתווך חיוני מינימלי של נשר (MEM) בתוספת 10% (v/v) נסיוב עגל עובר (FCS). הנגיף בו נעשה שימוש היה זן SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, שבודד על ידי PHE מאשכול החולים הראשון בבריטניה ב-29/01/2020. וירוס זה התקבל במעבר 1 ושימש למחקרי אינאקטיבציה במעבר 2 או 3.
עבור ריאגנטים וכימיקלים המשמשים לנטרול SARS-CoV-2, כמו גם הסרת ציטוטוקסיות מגיב, אנא עיין בדו"ח המדעי של Welch et al. (2020).

השבתת וירוסים על ידי חומרי ניקוי – פרוטוקול השבתת נגיף הקורונה SARS-CoV-2 על ידי Welch et al. 2020

השבתת SARS-CoV-2

עבור מוצרים מסחריים, הכנות וירוס (נוזל תרבית רקמות, titers החל מ 1 × 10⁶ עד 1 × 10⁸ PFU/ml) טופלו בשילוש עם ריאגנטים בריכוזים ובזמני מגע המומלצים בהוראות השימוש של היצרנים, היכן שיש, או לריכוזים וזמנים שהתבקשו במפורש על ידי מעבדות הבדיקה. כאשר ניתן טווח ריכוזים על ידי היצרן, נבדק היחס הנמוך ביותר בין מוצר לדגימה (כלומר הריכוז הנמוך ביותר המומלץ של מוצר הבדיקה). ריאגנטים של צינור הובלת דגימות נבדקו באמצעות יחס של נפח אחד של נוזל תרבית רקמה לעשרה נפחים של מגיב, אלא אם כן צוין יחס נפח של נוזל דגימה למגיב על ידי היצרן. דטרגנטים, מקבעים וממסים נבדקו בריכוזים שצוינו לזמנים שצוינו. כל שלבי ההשבתה בוצעו בטמפרטורת החדר (18 – 25 מעלות צלזיוס). לצורך בדיקה של סוגי דגימות חלופיים, הנגיף הוזנק לתוך מטריצת הדגימה שצוינה ביחס של 1:9, ולאחר מכן טופל באמצעות ריאגנטים לבדיקה כאמור לעיל. כל הניסויים כללו דגימות מדומות של בקרה משולשת עם נפח שווה ערך של PBS במקום מגיב בדיקה. מיד לאחר זמן המגע הנדרש, 1 מ"ל של דגימה מטופלת עובדה באמצעות מטריצת סינון שנבחרה כראוי. הסרת מגיבים לבדיקת אינאקטיבציה בוצעה בפורמט עמוד ספין גדול יותר באמצעות עמודי ספין להסרת חומרי ניקוי פירס 4 מ"ל (Thermo Fisher), או על ידי מילוי עמודי צנטריפוגות ריקים בקיבולת פירס 10 מ"ל (Thermo Fisher) בחרוזי SM2, Sephacryl S-400HR או Sephadex LH-20 כדי לתת 4mL חרוזים/שרף ארוזים. לצורך טיהור באמצעות מסנני Amicon, 2 × 500μl דגימות טוהרו באמצעות שני מסננים צנטריפוגליים בשיטה שתוארה קודם לכן, ולאחר מכן אוגדו יחד. עבור פורמלדהיד ופורמלדהיד עם הסרת גלוטראלדהיד, נעשה שימוש במסנן אחד עם נפח דגימה של 1× 500μl, הושעה מחדש לאחר עיבוד ב- PBS של 500μl, ונוסף ל- 400ul MEM/5% FBS. עבור inactivation של נגוע חד-שכבתיות, 12.5 ס"מ² צלוחיות של תאי Vero E6 (2.5 × 10⁶ תאים/בקבוקים ב-2.5 מ"ל MEM / 5% FBS) נדבקו ב-MOI 0.001 והודגרו ב-37°C/5% CO₂ למשך 24 שעות. סופרנאטנט הוסר, והתאים תוקנו באמצעות 5 מ"ל פורמלדהיד, או פורמלדהיד וגלוטראלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 או 60 דקות. הקיבוע הוסר, וחד-שכבות נשטפו שלוש פעמים עם PBS לפני גירוד התאים ל-1mL MEM/5% FBS וסוניזציה (3 × 10 שניות על, 10 שניות כיבוי ב-100% עוצמה ומשרעת) באמצעות UP200St עם חיבור VialTweeter (טכנולוגיית אולטרסאונד Hielscher). Supernatants הובהרו על ידי צנטריפוגה ב 3000 × גרם במשך 10 דקות.

פרטים על המגיב המשמש להשבתת נגיף הקורונה SARS-CoV-2 עם ה- VialTweeter העל-קולי על פי הפרוטוקול של Welch et al. 2020

את הפרוטוקול המלא כולל השימוש ב- Hielscher VialTweeter ניתן למצוא כאן:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

ממברטורים על-קוליים מתוחכמים ומשבשי תאים

האולטרסוניקטור הרב-מדגמי VialTweeter הוא רק אחד מהפתרונות האולטרסוניים הרבים להכנת דגימות במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות וקליניות. Hielscher Ultrasonics מציעה את dismembrator קולי אידיאלי עבור היישום שלך, למשל ליזה התא, מיצוי תאים, הומוגניזציה רקמות, מסיסות lysate, המסה, דגימה degassing וכו '.
ספר לנו כמה דגימות עליך לעבד בשעה וביום, אם אתה מעדיף סוניקציה ישירה או עקיפה ומה המטרה של הטיפול בדגימה האולטרסונית. אנו נמליץ לכם על היחידה האולטרסונית המתאימה ביותר לשגרת העבודה היומית שלכם!
המעבדים האולטרסוניים הדיגיטליים של Hielscher Ultrasonics מצוידים בתוכנה חכמה, הקלטת נתונים אוטומטית, אפשרויות הגדרה מראש קלות לבקרת טמפרטורה, משך סוניקציה, מצב מחזור / דופק, כמו גם תאורת דגימה ושלט רחוק של הדפדפן. אנו שואפים להפוך את המכשירים העל-קוליים שלנו לחכמים ככל האפשר, כך ששגרת המחקר והעבודה שלך תהיה נוחה ומוצלחת ככל האפשר.
לחץ כאן, כדי למצוא יישומים נוספים כולל פרוטוקולים של הכנת דגימה קולית עם VialTweeter!