פרוטוקול לאינאקטיבציה של נגיף הקורונה SARS-CoV-2 באמצעות סוניקציה

Hielscher VialTweeter הוא מכשיר אולטרסוני ייחודי להכנת דגימות מרובות, המשמש לאינאקטיבציה של נגיף הקורונה SARS-COV-2. ה-VialTweeter מאפשר להכין עד 10 בקבוקוני דגימה בו-זמנית, ולכן הוא המכשיר האידיאלי לעיבוד דגימות בכמויות גדולות.

אינאקטיבציה של נגיף הקורונה SARS-CoV-2 באמצעות VialTweeter

לאחר הסרת חומר הקיבוע, השכבות החד-תאיות נשטפו שלוש פעמים בתמיסת מלח מבופרת בפוספט (PBS), לפני שהתאים גורדו לתוך 1mL MEM/5% FBS ועברו סוניקציה (3 × 10 שניות הפעלה, 10 שניות הפסקה, בהספק ובמשרעת של 100%) באמצעות המעבד האולטרסוני של Hielscher UP200St עם VialTweeter כאביזר נלווה. הנוזלים העליונים הוצללו באמצעות צנטריפוגה ב-3000 × g למשך 10 דקות. קראו להלן את הפרוטוקול המלא לאינאקטיבציה של נגיף הקורונה SARS-CoV-2 מאת Welch ואחרים (2020):

תאים ונגיף

תאי Vero E6 ‏(Vero C1008; ATCC CRL-1586) גודלו במצע מינימלי חיוני מותאם של Eagle ‏(MEM), שהוסף לו 10% (v/v) סרום עגל עוברי (FCS). הנגיף ששימש היה SARS-CoV-2 מזן hCOV-19/England/2/2020, שבודד על ידי PHE מאשכול החולים הראשון בבריטניה ב-29/01/2020. נגיף זה התקבל במעבר 1 ושימש למחקרי אינאקטיבציה במעבר 2 או 3.
למידע על הריאגנטים והכימיקלים ששימשו לאינאקטיבציה של SARS-CoV-2, וכן על הסרת הציטוטוקסיות של הריאגנטים, ראו את הדוח המדעי של Welch ואחרים (2020).

אינאקטיבציה של נגיפים באמצעות דטרגנטים – פרוטוקול לאינאקטיבציה של נגיף הקורונה SARS-CoV-2 מאת Welch ואחרים 2020

אינאקטיבציה של SARS-CoV-2


עבור מוצרים מסחריים, תכשירי נגיף (נוזל תרבית רקמה, בטיטרים בטווח שבין 1 × 10⁶ ל-1 × 10⁸ PFU/ml) טופלו בשלוש חזרות בריאגנטים בריכוזים ולמשכי המגע שהומלצו בהוראות השימוש של היצרן, כאשר היו זמינות, או בריכוזים ולמשכים שהתבקשו במפורש על ידי מעבדות הבדיקה. כאשר היצרן ציין טווח ריכוזים, נבדק היחס הנמוך ביותר בין המוצר לדגימה (כלומר, הריכוז המומלץ הנמוך ביותר של המוצר הנבדק). ריאגנטים למבחנות להובלת דגימות נבדקו ביחס של נפח אחד של נוזל תרבית רקמה לעשרה נפחים של ריאגנט, אלא אם היצרן ציין יחס נפחים בין נוזל הדגימה לריאגנט. דטרגנטים, חומרי קיבוע וממסים נבדקו בריכוזים המצוינים ולמשכים המצוינים. כל שלבי האינאקטיבציה בוצעו בטמפרטורת החדר הסביבתית (18 – 25°C). לבדיקת סוגי דגימות חלופיים, הוסף נגיף למטריצת הדגימה המצוינת ביחס של 1:9, ולאחר מכן היא טופלה בריאגנטים הנבדקים כמתואר לעיל. כל הניסויים כללו דגימות ביקורת בשלוש חזרות שעברו טיפול דמה בנפח מקביל של PBS במקום הריאגנט הנבדק. מיד לאחר זמן המגע הנדרש, 1mL של דגימה מטופלת עובד באמצעות מטריצת הסינון שנבחרה בהתאם. הסרת הריאגנטים לצורך בדיקת אינאקטיבציה בוצעה במתכונת של עמודת צנטריפוגה גדולה יותר באמצעות Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns ‏(Thermo Fisher), או באמצעות מילוי עמודות צנטריפוגה ריקות של Pierce בנפח 10mL ‏(Thermo Fisher) ב-SM2 Bio-Beads, ב-Sephacryl S-400HR או ב-Sephadex LH-20, לקבלת 4mL של חרוזים/שרף ארוזים. לצורך טיהור באמצעות מסנני Amicon, דגימות בנפח 2 × 500μl טוהרו באמצעות שני מסננים צנטריפוגליים בשיטה שתוארה קודם לכן, ולאחר מכן אוחדו. להסרת פורמלדהיד ופורמלדהיד עם גלוטראלדהיד, נעשה שימוש במסנן אחד עם נפח דגימה של 1× 500μl; לאחר העיבוד הדגימה הורחפה מחדש ב-500μl PBS ונוספה ל-400ul MEM/5% FBS. לצורך אינאקטיבציה של שכבות חד-תאיות נגועות, בבקבוקי תרבית בשטח 12.5 cm² של תאי Vero E6 ‏(2.5 × 10⁶ תאים/בקבוק ב-2.5mL MEM/5% FBS), התאים הודבקו ב-MOI של 0.001 והודגרו ב-37°C/5% CO₂ למשך 24 שעות. הנוזל העליון הוסר, והתאים קובעו באמצעות 5mL של פורמלדהיד, או פורמלדהיד וגלוטראלדהיד, בטמפרטורת החדר למשך 15 או 60 דקות. חומר הקיבוע הוסר, והשכבות החד-תאיות נשטפו שלוש פעמים ב-PBS לפני שהתאים גורדו לתוך 1mL MEM/5% FBS ועברו סוניקציה (3 × 10 שניות הפעלה, 10 שניות הפסקה, בהספק ובמשרעת של 100%) באמצעות UP200St עם אביזר VialTweeter ‏(Hielscher Ultrasound Technology). הנוזלים העליונים הוצללו באמצעות צנטריפוגה ב-3000 × g למשך 10 דקות.


פרטי הריאגנט ששימש לאינאקטיבציה של נגיף הקורונה SARS-CoV-2 באמצעות VialTweeter האולטרסוני, לפי הפרוטוקול של Welch ואחרים 2020

את הפרוטוקול המלא, הכולל את השימוש ב-Hielscher VialTweeter, ניתן למצוא כאן:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

מכשירים אולטרסוניים מתקדמים לפירוק רקמות ותאים

המכשיר האולטרסוני לדגימות מרובות VialTweeter הוא רק אחד מפתרונות אולטרסוניים רבים להכנת דגימות במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות וקליניות. Hielscher Ultrasonics מציעה את המכשיר האולטרסוני האידיאלי לפירוק עבור היישום שלכם, כגון ליזיס של תאים, מיצוי תאים, הומוגניזציה של רקמות, המסה של ליזט, המסה, סילוק גזים מדגימות ועוד.
ספרו לנו כמה דגימות עליכם לעבד בשעה וביום, אם אתם מעדיפים סוניקציה ישירה או עקיפה ומהי מטרת הטיפול האולטרסוני בדגימות. נמליץ לכם על המכשיר האולטרסוני המתאים ביותר לשגרת העבודה היומית שלכם!
המעבדים האולטרסוניים הדיגיטליים של Hielscher Ultrasonics מצוידים בתוכנה חכמה, בתיעוד נתונים אוטומטי, באפשרויות נוחות להגדרה מראש של בקרת הטמפרטורה, משך הסוניקציה ומצב המחזורים/הפעימות, וכן בתאורת דגימה ובשליטה מרחוק באמצעות דפדפן. אנו שואפים להפוך את המכשירים האולטרסוניים שלנו לחכמים ככל האפשר, כדי שהמחקר ושגרת העבודה שלכם יהיו נוחים ומוצלחים ככל האפשר.
לחצו כאן למציאת יישומים נוספים, כולל פרוטוקולים להכנת דגימות אולטרסונית באמצעות VialTweeter!