ליזה של תאי BL21 על ידי אולטרסוניקציה
תאי BL21 הם זן של E. coli הנמצא בשימוש נרחב במעבדות מחקר, ביוטכנולוגיה וייצור תעשייתי בשל יכולתם לבטא חלבונים יעילים ביותר. שיבוש תאים על-קוליים, ליזה ומיצוי חלבונים היא השיטה הנפוצה לבודד ולאסוף את חלבוני המטרה מפנים התא של תאי BL21. אולטרה-סוניקציה משבשת את התא לחלוטין ומשחררת את כל החלבונים הכלואים, מה שהופך 100% מהחלבון לזמין.
תאי BL21 לביטוי חלבונים
תא BL21 הוא זן חיידקי E. coli בעל יכולת כימית המתאים לטרנספורמציה וביטוי חלבון ברמה גבוהה באמצעות מערכת השראת T7 RNA פולימראז-IPTG. תאי BL21 מאפשרים ביטוי חלבוני ביעילות גבוהה של כל גן שנמצא תחת שליטה של מקדם T7. זן E. coli BL21(DE3) הוא זן ייצור חלבונים מבוסס T7 RNA פולימראז בשילוב עם וקטורי ביטוי מבוססי מקדם T7 והוא מיושם באופן נרחב במעבדות ובתעשייה לייצור חלבונים רקומביננטיים. ב- BL21(DE3), ביטוי הגן המקודד את החלבון הרקומביננטי משועתק על ידי T7 RNA פולימראז המקודד כרומוזומלית (T7 RNAP), אשר מתעתק פי שמונה מהר יותר מאשר E. coli RNAP קונבנציונלי. זה הופך את הזן BL21(DE3) ליעיל ביותר והופך אותו לאחת ממערכות תאי ביטוי החלבונים המועדפות ביותר.
פרוטוקול ליזה קולית ומיצוי חלבונים מתאי BL21
ליזה של תאי BL21 מבוצעת בעיקר באמצעות אולטרסוניקציה בשילוב עם נתרן lauroyl sarcosinate (הידוע גם בשם sarkosyl) כמו חיץ ליזיס. היתרונות של שיבוש תאים קוליים ומיצוי חלבון טמונים באמינות, שחזור, כמו גם פעולה פשוטה, בטוחה ומהירה של ultrasonicators. הפרוטוקול שלהלן נותן כיוון שלב אחר שלב עבור ליזה קולית של תאי BL21:
- על מנת להסיר את חלבוני המלווה, כדורי חיידקי BL21 הושעו מחדש ב -50 מ"ל של חיץ נתרן Tris-EDTA (STE) קר כקרח (המורכב מ 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl בתוספת 100 mM PMSF).
- 500 ul של lysozyme (10 מ"ג / מ"ל) מתווספים והתאים מודגרים על קרח במשך 15 דקות.
- לאחר מכן, 500 ul של DTT ו 7 מ"ל של sarkosyl (10% (w / v) מורכב חיץ STE) מתווספים.
- חיוני לשמור על כל מאגרי הטיהור קרים כקרח ולשמור את הדגימות על קרח כל הזמן. כל שלבי הטיהור צריכים להתבצע בחדר הקר במידת האפשר.
- עבור ליזה קולית ומיצוי חלבונים, הדגימות הן sonicated ב VialTweeter MultiSample Ultrasonicator למשך 4 x 30 שניות באמפליטודה של 100% עם מרווח של 2 דקות בין כל סוניקציה. לחלופין, הומוגנייזר קולי מסוג בדיקה עם micro-tip למשל, UP200Ht עם S26d2 (3 x 30 שניות, הפסקה של 2 דקות בין מחזורים קוליים, 80% משרעת) ניתן להשתמש.
- לשלבי טיהור נוספים, הדגימות חייבות להישמר על קרח או לחילופין לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לעיבוד נוסף.
משבש תאים אולטראסוני UP200St עם micro-tip S26d2 לליזה ומיצוי חלבונים
ליזה קולית תחת בקרת טמפרטורה Prescise
בקרת הטמפרטורה המדויקת והאמינה חיונית בעת טיפול בדגימות ביולוגיות. טמפרטורות גבוהות גורמות לפירוק חלבונים המושרה תרמית בדגימות.
כמו כל טכניקות הכנת הדגימות המכניות, סוניקציה יוצרת חום. עם זאת, הטמפרטורה של הדגימות יכולה להיות נשלטת היטב בעת שימוש VialTweeter. אנו מציגים בפניכם אפשרויות שונות לניטור ובקרה על טמפרטורת הדגימות שלכם תוך הכנתם עם VialTweeter ו- VialPress לניתוח.
- ניטור טמפרטורת הדגימה: המעבד העל-קולי UP200St, המניע את ה- VialTweeter, מצויד בתוכנה חכמה ובחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. חבר את חיישן הטמפרטורה ל- UP200St והכנס את קצה חיישן הטמפרטורה לאחד מצינורות הדגימה. באמצעות צג מגע צבעוני דיגיטלי, תוכל להגדיר בתפריט של UP200St טווח טמפרטורות ספציפי עבור הסוניקציה לדוגמה שלך. האולטרסאונד יעצור אוטומטית כאשר תגיע לטמפרטורה המקסימלית וישהה עד שטמפרטורת הדגימה תרד לערך הנמוך יותר של הטמפרטורה שנקבעה ∆. ואז הסוניקציה מתחילה שוב באופן אוטומטי. תכונה חכמה זו מונעת התפרקות הנגרמת על ידי חום.
- ניתן לקרר מראש את בלוק VialTweeter. הכניסו את בלוק VialTweeter (רק הסונוטרוד ללא מתמר!) למקרר או למקפיא כדי לקרר מראש את בלוק הטיטניום עוזר לדחות את עליית הטמפרטורה בדגימה. במידת האפשר, ניתן גם לקרר מראש את הדגימה עצמה.
- השתמשו בקרח יבש כדי להתקרר במהלך סוניקציה. השתמש במגש רדוד מלא בקרח יבש והנח את ה- VialTweeter על הקרח כך שהחום יוכל להתפזר במהירות.
לקוחות ברחבי העולם משתמשים ב- VialTweeter וב- VialPress לעבודת הכנת הדגימות היומית שלהם במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות, רפואיות וקליניות. התוכנה החכמה ובקרת הטמפרטורה של מעבד UP200St, הטמפרטורה מבוקרת באופן אמין ונמנעת פגיעה בדגימה כתוצאה מחום. הכנת דגימה קולית עם VialTweeter ו- VialPress מספקת תוצאות אמינות ביותר וניתנות לשחזור!
מצא את המשבש העל-קולי האופטימלי עבור יישום הליזיס שלך
Hielscher Ultrasonics היא יצרנית מנוסה מזה זמן רב של משבשי תאים קוליים בעלי ביצועים גבוהים והומוגנייזרים למעבדות, מערכות בקנה מידה עליון ותעשייתי. גודל תרבית תאי החיידק שלך, מטרת המחקר או הייצור שלך ונפח התא לעיבוד בשעה או ביום הם גורמים חיוניים כדי למצוא את משבש התאים העל-קולי הנכון עבור היישום שלך.
Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים עבור סוניקציה בו זמנית של דגימות מרובות (עד 10 בקבוקונים עם VialTweeter) ודגימות המוני (כלומר, לוחות microtiter / לוחות ELISA עם UIP400MTP), כמו גם אולטרסוניקטור מעבדה קלאסי מסוג בדיקה עם רמות כוח שונות מ 50 עד 400 וואט למעבדים קוליים תעשייתיים לחלוטין עם עד 16,000 וואט ליחידה עבור שיבוש תאים מסחריים מיצוי חלבון בייצור גדול. כל Hielscher ultrasonicators בנויים עבור המבצע 24/7/365 תחת עומס מלא. חוסן ואמינות הם תכונות הליבה של המכשירים האולטרסוניים שלנו.
כל ההומוגנייזרים האולטרה-סוניים הדיגיטליים מצוידים בתוכנה חכמה, תצוגת מגע צבעונית ופרוטוקול נתונים אוטומטי, שהופכים את המכשיר העל-קולי לכלי עבודה נוח במעבדות ובמתקני ייצור.
ספר לנו, איזה סוג של תאים, איזה נפח, באיזו תדירות ועם איזו מטרה יש לך לעבד את הדגימות הביולוגיות שלך. אנו נמליץ לך על משבש התאים העל-קולי המתאים ביותר לדרישות התהליך שלך.
הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה לגבי יכולת העיבוד המשוערת של המערכות העל-קוליות שלנו, החל מהומוגנייזרים ידניים קומפקטיים ואולטרסוניקטורים MultiSample ועד מעבדים על-קוליים תעשייתיים ליישומים מסחריים:
| נפח אצווה | קצב זרימה | מכשירים מומלצים |
|---|---|---|
| 96-באר / microtiter צלחות | נ.א. | UIP400MTP |
| 10 בקבוקונים à 0.5 עד 1.5mL | נ.א. | VialTweeter ב- UP200St |
| 00.01 עד 250 מ"ל | 5 עד 100 מ"ל/דקה | UP50H |
| 00.01 עד 500 מ"ל | 10 עד 200 מ"ל/דקה | UP100H |
| 10 עד 2000 מ"ל | 20 עד 400 מ"ל/דקה | UP200Ht, UP400ST |
| 00.1 עד 20 ליטר | 00.2 עד 4L/דקה | UIP2000hdT |
| 10 עד 100 ליטר | 2 עד 10 ליטר/דקה | UIP4000hdT |
| נ.א. | 10 עד 100 ליטר/דקה | UIP16000 |
| נ.א. | גדול | אשכול של UIP16000 |
צרו קשר! / שאל אותנו!
UIP400MTP סוניק צלחת לשיבוש תאים בתפוקה גבוהה בלוחות בעלי 96 בארות
אולטרסוניקטור UP200Ht עם microtip S26d2 בקוטר 2 מ"מ לסוניקציה של דגימות קטנות
קרא עוד על איך אתה יכול להשתמש הומוגנייזר רקמות קולי שלך להכנת יעיל ואמין של פתרונות חיץ!
עובדות שכדאי לדעת
חיידקי Escherichia coli
Escherichia coli הוא סוג חיידק, שאינו יוצר נבגים, גראם-שלילי ומאופיין בצורת מוט ישר. חיידקי E.coli נמצאים בסביבה, במזונות ובמעיים של בני אדם ובעלי חיים. E. coli הוא בדרך כלל תנועתי באמצעות שוטונים peritrichous, אבל יש גם סוגים שאינם תנועתיים. E.coli הם מה שנקרא אורגניזמים chemoorganotroph אנאירובית faculative, כלומר הם מסוגלים הן מטבוליזם נשימתי ותסיסה. רוב סוגי E.coli הם שפירים וממלאים תפקידים שימושיים בגוף, למשל דיכוי הצמיחה של מיני חיידקים מזיקים, סינתזה של ויטמינים וכו '.
תאי חיידקי Escherichia coli של מה שמכונה סוג B הם קטגוריה מיוחדת של זני E.coli, אשר נמצאים בשימוש נרחב במחקר כדי לחקור מנגנונים כגון רגישות bacteriophage או מערכות שינוי הגבלה. יתר על כן, חיידקי E.coli מוערכים כסוס עבודה אמין לביטוי חלבונים במעבדות ביוטכנולוגיה ומדעי החיים. לדוגמה, E.coli משמשים לסנתז תרכובות כגון חלבונים ואוליגוסכרידים בקנה מידה תעשייתי. בשל תכונות ספציפיות כגון מחסור בפרוטאז, ייצור אצטט נמוך ברמה גבוהה של גלוקוז, וחדירות משופרת, תאי E. coli B הם תאי המאכסן הנפוצים ביותר לייצור חלבונים מהונדסים גנטית.
חלבון רקומביננטי
חלבונים רקומביננטיים (rProt) צוברים חשיבות משמעותית בענפי תעשייה רבים, כולל בתעשיות הייצור הכימי, תרופות, קוסמטיקה, רפואת אדם ובעלי חיים, חקלאות, מזון וכן טיפול בפסולת.
ייצור חלבון רקומביננטי דורש שימוש במערכת ביטוי. כביטוי מערכות תאים לייצור DNA רקומביננטי, ניתן להשתמש הן בתאים פרוקריוטים והן בתאים אאוקריוטים. בעוד תאי חיידק נמצאים בשימוש נרחב ביותר לביטוי חלבונים בשל גורמים כגון עלות נמוכה, מדרגיות קלה ותנאי מדיה פשוטים, יונקים, שמרים, אצות, חרקים ומערכות נטולות תאים הן חלופות מבוססות. סוג החלבון, הפעילות התפקודית, כמו גם התפוקה הנדרשת של חלבון מבוטא משפיעים על בחירת מערכת התאים המשמשת לביטוי חלבון.
על מנת לבטא חלבון רקומביננטי, תא מסוים חייב להיות נגוע בווקטור DNA המכיל את תבנית ה- DNA הרקומביננטי. התאים הנגועים בתבנית עוברים תרבית. כתוצאה מהמנגנון התאי, התאים מתעתקים ומתרגמים את החלבון המעניין, ובכך מייצרים את חלבון היעד.
כאשר החלבונים המבוטאים כלואים במטריצה התאית, התא חייב לעבור ליזה (שיבוש ושבירה) כדי לשחרר את החלבונים. בשלב הטיהור הבא, החלבון מופרד ומטוהר.
החלבון הרקומביננטי הראשון ששימש לטיפול היה אינסולין אנושי רקומביננטי בשנת 1982. כיום, יותר מ -170 סוגים של חלבון רקומביננטי מיוצרים ברחבי העולם עבור טיפולים רפואיים. חלבונים רקומביננטיים נפוצים המשמשים ברפואה הם למשל הורמונים רקומביננטיים, אינטרפרונים, אינטרלוקינים, גורמי גדילה, גורמי נמק גידול, גורמי קרישת דם, תרופות טרומבוליטיות ואנזימים לטיפול במחלות עיקריות כגון סוכרת, גמדות, אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב, אפופלקסיה מוחית, טרשת נפוצה, נויטרופניה, טרומבוציטופניה, אנמיה, צהבת, דלקת מפרקים שגרונית, אסטמה, מחלת קרוהן וטיפולים בסרטן. (ראה: Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
ספרות / מקורות
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator עבור סוניקציה בו זמנית של 10 דגימות, למשל כדי לשבש תאי BL21
אולטרסאונד בעל ביצועים גבוהים! מגוון המוצרים של Hielscher מכסה את כל הספקטרום החל מאולטרסוניקטור מעבדה קומפקטי מעל יחידות ספסל ועד מערכות אולטראסוניות תעשייתיות מלאות.