ליזיס של תאי BL21 באמצעות אולטרסאונד

תאי BL21 הם זן של E. coli הנמצא בשימוש נרחב במעבדות מחקר, בביוטכנולוגיה ובייצור תעשייתי בזכות יכולתם לבטא חלבונים ביעילות גבוהה מאוד. פירוק תאים, ליזיס ומיצוי חלבונים באמצעות אולטרסאונד הם השיטה המקובלת לבידוד ולאיסוף חלבוני המטרה מתוך תאי BL21. אולטרסאונד מפרק את התא לחלוטין ומשחרר את כל החלבונים הכלואים בו, כך ש־100% מהחלבון נעשה זמין.

תאי BL21 לביטוי חלבונים

תא BL21 הוא זן חיידקי E. coli בעל כשירות כימית לקליטת DNA, המתאים לטרנספורמציה ולביטוי חלבונים ברמה גבוהה באמצעות מערכת השראה המבוססת על T7 RNA polymerase-IPTG. תאי BL21 מאפשרים ביטוי חלבונים ביעילות גבוהה מכל גן הנמצא תחת בקרה של פרומוטר T7. זן ה־E. coli הקרוי BL21(DE3) הוא זן לייצור חלבונים המבוסס על RNA פולימראז של T7, המשולב עם וקטורי ביטוי המבוססים על פרומוטר T7, ונמצא בשימוש נרחב במעבדות ובתעשייה לייצור חלבונים רקומביננטיים. ב־BL21(DE3), הביטוי של הגן המקודד לחלבון הרקומביננטי משועתק על ידי RNA פולימראז של T7 המקודד בכרומוזום (T7 RNAP), המשעתק במהירות גבוהה פי שמונה מזו של RNAP רגיל של E. coli. תכונה זו הופכת את הזן BL21(DE3) ליעיל ביותר ולאחת ממערכות התאים המועדפות ביותר לביטוי חלבונים.

פרוטוקול לליזיס ולמיצוי חלבונים מתאי BL21 באמצעות אולטרסאונד

ליזיס של תאי BL21 מתבצע לרוב באמצעות אולטרסאונד בשילוב עם נתרן לאורויל סרקוזינט (המוכר גם בשם סרקוזיל) כבופר ליזיס. היתרונות של פירוק תאים ומיצוי חלבונים באמצעות אולטרסאונד טמונים באמינות, בהדירות וכן בהפעלה הפשוטה, הבטוחה והמהירה של מכשירי הסוניקציה. הפרוטוקול שלהלן מספק הנחיות שלב אחר שלב לליזיס של תאי BL21 באמצעות אולטרסאונד:

• כדי להסיר את חלבוני השפרון, משקעי חיידקי BL21 הורחפו מחדש ב־50 ml של בופר Sodium Tris-EDTA (STE) קר כקרח (המכיל 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl בתוספת 100 mM PMSF).
• לאחר מכן מוסיפים 500 ul של ליזוזים (10 mg/ ml) ומדגירים את התאים על קרח למשך 15 min.
• לאחר מכן מוסיפים 500 ul של DTT ו־7 ml של סרקוזיל (10% (w/v) שהוכן בבופר STE).
• חיוני לשמור את כל בופרי הטיהור קרים כקרח ולהחזיק את הדגימות על קרח כל הזמן. יש לבצע את כל שלבי הטיהור בחדר קירור, אם אפשר.



• לצורך ליזיס ומיצוי חלבונים באמצעות אולטרסאונד, הדגימות עוברות סוניקציה במכשיר VialTweeter MultiSample Ultrasonicator במשך 4 x 30 sec באמפליטודה של 100%, עם מרווח של 2 min בין סוניקציה לסוניקציה. לחלופין, ניתן להשתמש בהומוגנייזר אולטרסוני מסוג גשושית עם קצה זעיר, למשל UP200Ht עם S26d2 (3 x 30 sec, הפסקה של 2 min. בין מחזורי האולטרסאונד, אמפליטודה של 80%).
• לקראת שלבי טיהור נוספים, חובה להחזיק את הדגימות על קרח או לחלופין לאחסן אותן ב־-80°C עד להמשך העיבוד.

ליזיס באמצעות אולטרסאונד בבקרת טמפרטורה מדויקת

בקרת טמפרטורה מדויקת ואמינה היא חיונית בעת טיפול בדגימות ביולוגיות. טמפרטורות גבוהות גורמות לתחילת פירוק חלבונים בדגימות עקב חום.
כמו כל טכניקות הכנת הדגימות המכניות, סוניקציה מייצרת חום. עם זאת, ניתן לשלוט היטב בטמפרטורת הדגימות בעת השימוש ב־VialTweeter. אנו מציגים בפניכם אפשרויות שונות לניטור ולבקרה של טמפרטורת הדגימות שלכם בזמן הכנתן לאנליזה באמצעות VialTweeter ו־VialPress.

1. ניטור טמפרטורת הדגימה: המעבד האולטרסוני UP200St, המפעיל את ה-VialTweeter, מצויד בתוכנה חכמה ובחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. חברו את חיישן הטמפרטורה ל-UP200St והכניסו את קצה חיישן הטמפרטורה לאחת ממבחנות הדגימה. באמצעות מסך המגע הדיגיטלי הצבעוני, תוכלו להגדיר בתפריט של UP200St טווח טמפרטורות מסוים לסוניקציה של הדגימה שלכם. המכשיר האולטרסוני יעצור אוטומטית כאשר תושג הטמפרטורה המרבית, וישהה את פעולתו עד שטמפרטורת הדגימה תרד לערך התחתון של הטמפרטורה המוגדרת ∆. לאחר מכן הסוניקציה תתחיל שוב באופן אוטומטי. תכונה חכמה זו מונעת פירוק הנגרם מחום.
2. ניתן לקרר מראש את בלוק ה-VialTweeter. הכניסו את בלוק ה-VialTweeter (רק את הסונוטרודה, ללא המתמר!) למקרר או למקפיא כדי לקרר מראש את בלוק הטיטניום ולסייע בהשהיית עליית הטמפרטורה בדגימה. במידת האפשר, ניתן לקרר מראש גם את הדגימה עצמה.
3. השתמשו בקרח יבש לקירור במהלך הסוניקציה. השתמשו במגש רדוד מלא בקרח יבש והניחו את ה-VialTweeter על הקרח כדי לאפשר פיזור מהיר של החום.

לקוחות ברחבי העולם משתמשים ב-VialTweeter וב-VialPress לעבודתם היומיומית בהכנת דגימות במעבדות ביולוגיות, ביוכימיות, רפואיות וקליניות. באמצעות התוכנה החכמה ובקרת הטמפרטורה של מעבד UP200St, הטמפרטורה מבוקרת באופן אמין ונמנע פירוק הדגימות הנגרם מחום. הכנת דגימות אולטרסונית באמצעות VialTweeter ו-VialPress מספקת תוצאות אמינות ביותר וניתנות לשחזור!
 

מצאו את המכשיר האולטרסוני האופטימלי לפירוק תאים עבור יישום הליזיס שלכם

Hielscher Ultrasonics היא יצרנית בעלת ניסיון רב שנים של מכשירים אולטרסוניים לפירוק תאים והומוגנייזרים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים למעבדות, למערכות שולחניות ולמערכות בקנה מידה תעשייתי. גודל תרבית תאי החיידקים שלכם, מטרת המחקר או הייצור שלכם ונפח התאים לעיבוד בשעה או ביום הם גורמים חיוניים למציאת המכשיר האולטרסוני המתאים לפירוק תאים עבור היישום שלכם.
Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים לסוניקציה בו-זמנית של דגימות מרובות (עד 10 בקבוקונים באמצעות VialTweeter) ושל מספר רב של דגימות (כלומר, פלטות מיקרוטיטר / פלטות ELISA באמצעות UIP400MTP), וכן מכשיר אולטרסוני מעבדתי קלאסי מסוג גשושית ברמות הספק שונות מ-50 עד 400 ואט, ועד מעבדים אולטרסוניים תעשייתיים מלאים בהספק של עד 16,000 ואט ליחידה, לפירוק תאים ולהפקת חלבונים באופן מסחרי בייצור בהיקף גדול. כל המכשירים האולטרסוניים של Hielscher בנויים לפעולה 24/7/365 בעומס מלא. עמידות ואמינות הן תכונות מרכזיות של המכשירים האולטרסוניים שלנו.
כל ההומוגנייזרים האולטרסוניים הדיגיטליים מצוידים בתוכנה חכמה, במסך מגע צבעוני ובתיעוד נתונים אוטומטי, ההופכים את המכשיר האולטרסוני לכלי עבודה נוח במעבדות ובמתקני ייצור.
ספרו לנו אילו סוגי תאים, באיזה נפח, באיזו תדירות ולאיזו מטרה עליכם לעבד את הדגימות הביולוגיות שלכם. נמליץ לכם על המכשיר האולטרסוני לפירוק תאים המתאים ביותר לדרישות התהליך שלכם.

הטבלה שלהלן נותנת לכם מושג על קיבולת העיבוד המשוערת של המערכות האולטרסוניות שלנו, מהומוגנייזרים קומפקטיים המוחזקים ביד ומכשירים אולטרסוניים מסוג MultiSample ועד מעבדים אולטרסוניים תעשייתיים ליישומים מסחריים:

ספרות / מקורות

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.