פיצול DNA אולטרה סאונד עבור רצף הדור הבא
רצף הדור הבא (NGS) דורש גיסת אמינה ופיצול של DNA גנומי על מנת לרצף גדילי DNA גנומיים וליצור ספריות גנום. הפיצול המבוקר של דנ"א לרסיסי דנ"א הוא שלב הכנה חיוני לדגימה הנדרש לפני ריצוי הדנ"א. Ultrasonication הוכח כמו טכניקה יעילה ואמינה עבור פיצול DNA באורך מסוים. פרוטוקולי פיצול DNA אולטרה סאונד להשיג תוצאות פיצול לשחזור. Hielscher ultrasonicators מסוגלים לייצר מגוון רחב של הפצות גודל שבר DNA גנומי, ניתן לשליטה בדיוק באמצעות הפרמטרים ההפעלה. מאז Hielscher מערכות גיזום DNA קולי זמינים עבור בקבוקונים יחידים ומספרים, כמו גם עבור microplates, הכנת מדגם הופך להיות יעיל מאוד.
Electrophoretic מנתח של הדנ"א הגנומי של E. coli EDL933 נתון 0 - 15 דק 'ultrasonication. L מציין את סולם DNA. (ואח Basselet. 2008)
- תוצאות חוזרות / ניתנות לשחזור
- מתכוונן במדויק כדי להשיג אורך קטע מסוים
- עיבוד מהיר
- תוצאות פיצול DNA עקביות
- התקנים עבור כל אמצעי אחסון לדוגמה (לדוגמה, בקבוקונים מרובים או מיקרו-לוחות)
- תפוקה גבוהה
- בקרת טמפרטורה מדויקת
- פעולה פשוטה וידידותית למשתמש
רצף הדור הבא: פיצול DNA אולטרה סאונד להכנת הספרייה
כדי לבצע רצף של הדור הבא, יש לבצע את שלושת השלבים הבסיסיים של (1) הכנת ספריה, (2) רצף וניתוח נתונים (3). במהלך הכנת הספרייה, ה- DNA מקוטע, ואז קצות השבר מתוקנים (מלוטשים) על ידי הוספת בסיס אדנין יחיד ורסיסי היעד מומרים ל- DNA כפול גדילים. לבסוף, מתאמים כביכול מחוברים על-ידי קשירה, PCR או תגים, כך שניתן יהיה בכמות של מוצר ה- DNA הסופי של הספריה לצורך רצף.
פיצול DNA באמצעות Sonication: במיוחד כאשר טכנולוגיות רצף קצרות כגון Illumina, אשר לא יכול לקרוא שברי DNA ארוכים יותר בקלות, עומד ה- DNA חייב להיות מקוטע לגודל מסוים אשר ניתן להשיג באופן אמין על ידי ultrasonication.
Ultrasonication יכול לשמש באופן אמין עבור DNA, RNA ושבר כרומטין.
כיצד פועל פיצול DNA אולטרה סאונד?
Sonication, הידוע גם בשם עיבוד מדגם אקוסטי, היא שיטה נפוצה לפיצול DNA. עבור גיסת DNA קולי, הדגימות חשופות גלים קוליים במצב מבוקר. עקרון העבודה של פיצול DNA קולי מבוסס על תנודות cavitation ליצור על ידי גלי אולטרסאונד. כוחות הגיסה הנובעים cavitation קולי (אקוסטי) לשבור מולקולות DNA במשקל מולקולרי גבוה. ההגדרה של sonication כגון עוצמה (משרעת, משך), מצב פעימה וטמפרטורה לאפשר פיצול DNA מדויק לאורך הרצוי של שברי DNA. בעוד DNA לעתים קרובות מופחת ל 100 עד 600 bp באמצעות ultrasonication, שברי DNA ארוכים יותר של עד 1300 bp ניתן להשיג כאשר תנאים קוליים מתונים מוחלים.
גיזת DNA אולטרה סאונד במהלך ChIP – immunoprecipitation הכרומטין
עיבוד מ Jkwchui תחת CC-BY-SA.03
בקרת טמפרטורה למניעת ירידה ב-DNA
הצורה המולקולרית הכפולה של ה- DNA רגישה מאוד לטמפרטורות גבוהות, כך ששליטה מדויקת בטמפרטורה במהלך שלבי הכנת המדגם היא גורם מכריע לתוצאות ניתוח אמינות.
בין אם אתם משתמשים באולטרסאונד הגשושית של Hielscher, הוויאלטווטר או UIP400MTP – ניטור ובקרת טמפרטורה רציפה מובטחים הודות לחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור ותוכנת המכשיר החכם. על מנת לשמור על הטמפרטורה בטווח מסוים, אתה יכול להגדיר מגבלת טמפרטורה עליונה ותחתונים. כתוצאה מכך, ultrasonicator ישהה ברגע מגבלת טמפרטורה זו היא חריגה באופן אוטומטי ימשיך sonicate כאשר הטמפרטורה ירדה על ידי קבוצה ∆T.
התוכנה המתוחכמת של Hielscher ultrasonicators מבטיח תחזוקה אמינה של תנאי טיפול מדגם אידיאלי.
פיצול DNA מדגם מסה עם UIP400MTP צלחת רב-בארות ultrasonicator
מספר המדגם במדעי החיים גדל משמעותית בעשור האחרון. משמעות הדבר היא שיש לעבד מספר גבוה מאוד של דגימות (לדוגמה, 384, 1536 או 3456 בארות למיקרו-לוח) במהלך הכנה וניתוח מדגם בתנאים שווים באופן עקבי על מנת להשיג תוצאות דומות והתקפות. עם UIP400MTP, Hielscher אולטרסוניקה עוקבת אחר המגמה של עיבוד מדגם המוני. UIP400MTP הוא ultrasonicator להכנת מדגם באמצעות microplates. UIP400MTP יכול לעבד לוחות עם 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536, או 3456 בארות. בהתאם לסוג המיקרו-לוח, כל באר יכולה בדרך כלל להחזיק נפחי דגימה בין עשרות ננו-ליטרים למספר מיליליטרים. בשימוש נרחב במחקר מדעי החיים, UIP400MTP משמש נפוץ מאוד להכנת מדגם לפני בדיקות כגון ELISA (חיסון הקשורים לאנזים assay) או PCR, לפני ניתוח חלבון, כמו גם להכנת כרומטין לפני CHiP ו- CHiP-seq, זיהוי שינוי histone, וטיפולים אנליטיים אחרים (למשל, אלקטרופורזה ג'ל, ספקטרומטריית מסה).
VialTweeter עבור פרפרציה מדגם של עד 10 בקבוקונים
VialTweeter הוא מעבדה בשימוש נרחב ultrasonicator VialTweeter המאפשר sonication יעיל ונוח של עד 10 בקבוקונים בו זמנית. מאז הבקבוקונים ואת המבחנות (למשל, בקבוקונים אפנדורף, בקבוקונים קריו, צינורות צנטריפוגות) הם sonicated בעקיפין, כל זיהום צולב נמנע. כמו אותה עוצמת אולטרסאונד מועבר לכל מדגם, כל תוצאות sonication הם הומוגניים לשחזור. VialTweeter מציע את כל התכונות החכמות כמו המכשירים הדיגיטליים האחרים שלנו (למשל, תפריט חכם, הגדרות ניתנות לתכנות, בקרת טמפרטורה, שלט רחוק וכו ') כך שהובטחה נוחות המשתמש הגבוהה ביותר.
בדיקות מרובות אצבעות ללוחות מיקרווול
זמין עבור homogenizers בדיקה קולית UP200Ht ו UP200St, בדיקות מרובות אצבעות עם 4 או 8 אצבעות הם אפשרות נוחה sonicate מדגם מרובים בו זמנית באותם תנאים. לדוגמה, sonotrode MTP-24-8-96 הוא בדיקה שמונה אצבעות, אשר אידיאלי עבור שילוב לתוך מערכות אוטומטיות או הכנת מדגם ידני יעיל של בארות של לוחות רב-בארות. sonotrode מרובה אצבעות הוא אידיאלי עבור אוטומטי עבור מעבדות, שבו בעיקר כוסות ומבחנות באמצעות sonotrode קולי סטנדרטי מעובדים. הבדיקות מרובות האצבעות והסטנדרט ניתן לשנות במהירות בתוך כמה דקות הפיכת ultrasonicator בדיקה אחת לתוך משבש קולי רב בדיקות.
הילשר אולטרסוניטורים לפיצול DNA
Hielscher אולטרסוניקה מציעה פלטפורמות שונות מבוססות אולטרסאונד עבור DNA, RNA, ו כרומטין פיצול. פלטפורמות שונות אלה כוללות בדיקות קוליות (sonotrodes), פתרונות sonication עקיף להכנת מדגם בו זמנית של צינורות מרובים או לוחות רבים באר (למשל, 96-באר צלחות, לוחות microtiter), sonoreactors, וכוסות קוליות. כל הפלטפורמות לגיזוי DNA מופעלות על ידי תדרים מכווננים, מעבדים קוליים בעלי ביצועים גבוהים, אשר ניתנים לשליטה מדויקת ומספקים תוצאות הניתנות לשחזור.
מעבדי אולטרה סאונד עבור כל מספר וגודל לדוגמה
עם ultrasonicators Multi-sample של Hielscher VialTweeter (עבור עד 10 מבחנות) ו UIP400MTP (עבור microplates / לוחות multiwell) זה הופך להיות אפשרי בקלות כדי להפחית את זמן עיבוד מדגם עקב ultrasonication אינטנסיבי ובדיוק לשליטה תוך קבלת התפלגות גודל שבר DNA הרצוי ותשואה. פיצול DNA אולטרה סאונד עושה הכנת מדגם יעיל, אמין מדרגי. פרוטוקולים ניתן לשנות את קנה המידה הליניארי מדגימות אחת עד רבים על ידי החלת אולטרסאונד מבוקר כל הזמן.
בדיקה ultrasonicators עם אצבע אחת עד חמש הם אידיאליים להכנת מספרי מדגם קטנים יותר. מעבדות של Hielscher זמינים בגדלים שונים, כך שנוכל להמליץ לך על המכשיר האידיאלי עבור היישום והדרישות שלך.
בקרת תהליכים מדויקת
הגדרות sonication לשליטה בדיוק הם קריטיים מאז sonification ממצה יכול להרוס DNA, RNA ו chromatin, אבל תוצאות גיזת קולי לקוי ב- DNA ארוך מדי שברי כרומטין. ultrasonicators הדיגיטלי של Hielscher ניתן להגדיר בקלות פרמטר sonication מדויק. ניתן גם לשמור הגדרות sonication ספציפיות כהגדרה מתוכנתת לחזרה מהירה של אותו הליך.
כל sonication הם פרוטוקול אוטומטי ומאוחסן כקובץ CSV על כרטיס SD מובנה. זה מאפשר תיעוד מדויק של ניסויים שבוצעו ומאפשר לתקן sonication פועל בקלות.
באמצעות שלט רחוק בדפדפן, כל ultrasonicators דיגיטלי ניתן להפעיל ולנטר באמצעות כל דפדפן סטנדרטי. התקנה של תוכנה נוספת אינה נדרשת, שכן חיבור LAN מאפשר התקנה פשוטה מאוד של הכנס-הפעל.
המשתמש-ידידותיות הגבוהה ביותר בהכנה מדגם אולטרה סאונד
כל ultrasonicators Hielscher נועדו לספק אולטרסאונד ביצועים גבוהים, בעוד באותו זמן תמיד להיות מאוד ידידותי למשתמש וקל לתפעול. כל ההגדרות בנויות היטב בתפריט ברור, אליו ניתן לגשת בקלות באמצעות צג מגע צבעוני או שלט רחוק של הדפדפן. התוכנה החכמה עם הגדרות ניתנות לתכנות והקלטת נתונים אוטומטית מבטיחה הגדרות sonication אופטימליות לתוצאות אמינות הניתנות לשחזור. ממשק התפריט הנקי והקלה לשימוש הופך ultrasonicators Hielscher למכשירים ידידותיים למשתמש ויעילים.
הטבלה שלהלן נותנת לך אינדיקציה של יכולת העיבוד המשוערת של ultrasonicators המעבדה שלנו, אשר אידיאלי עבור משימות הכנה מדגם כגון DNA ו RNA פיצול, תמה תא, כמו גם מיצוי חלבון:
| התקן | כוח [W] | סוּג | נפח [מ"ל] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | עבור מיקרו-לוחות | 6 – 3456 בארות | VialTweeter | 200 | עבור עד 10 בקבוקונים בתוספת אפשרות מהדק על | 00.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | Probe-סוג | 00.01 – 250 |
| מעלהay | 100 | Probe-סוג | 00.01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Probe-סוג | 00.1 – 1000 |
| בית Seating | 200 | Probe-סוג | 00.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Probe-סוג | 5.0 – 2000 |
| קופלוקס | 200 | בעלי כיתה, סונריאקטור | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | זיהום ללא תזרים תאים |
תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!
יחידת הכנה מרובת מדגם אולטראסוניות VialTweeter מאפשר sonication בו זמנית של עד 10 בקבוקונים. עם מכשיר הידוק VialPress, עד 4 צינורות נוספים ניתן ללחוץ לחזית עבור sonication אינטנסיבי.
Sonotrode MTP-24-8-96 יש שמונה בדיקות אולטראסוניות עבור sonication של הבארים של לוחות microtiter.
ספרות/הפניות
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
עובדות שראוי לדעת
מהו רצף הדור הבא?
רצף הדור הבא, גם רצף הדור הבא (NGS), רצף תפוקה גבוהה או רצף הדור השני, מתייחס לגישה של רצף מקביל מסיבי, שבו כמויות גדולות מאוד (מסיביות) של DNA של מיליוני שברים רצפים בו זמנית במקביל לכל ריצה.
כדי לבצע רצף של הדור הבא, יש לבצע את שלושת השלבים הבסיסיים של (1) הכנת ספריה, (2) רצף וניתוח נתונים (3). במהלך הכנת הספרייה, גדילי DNA חייבים להיות מקוטעים לרסיסי DNA באורך מסוים. Sonication היא אחת הטכניקות המועדפות לפיצול DNA.
במהלך תהליך ריצוף הדנ"א, סדר הנוקלאוטידים בדנ"א – המכונה רצף חומצת גרעין – נקבע. רצף חומצת הגרעין מורכב מארבעה בסיסי נוקלאוטידים – אדנין, ציטוסין, גואנין, תימין – איזה קוד למידע.
רצף הדור הבא מניע מחקר במדעי החיים וברפואה מותאמת אישית מכיוון שרצף דנ"א ורנ"א משמשים רבות במחקר גנומי, מחקר סרטן, מחקר מחלות נדירות ומורכבות, מחקר מיקרוביאלי, אגריגנומיקה ותחומים רבים אחרים במחקר.
רצף הדור הבא - רצף סנגר
בעוד עם הדור הבא רצף (NGS) ניתן לרצף מספרים מסיביים של דגימות גנומיות, רצף Sanger (הידוע גם בשם שיטת סיום שרשרת או רצף הדור הראשון) יש רק את היכולת לרצף מספרי מדגם קטנים. רצף סנגר רק רצף שבר DNA יחיד בכל פעם וניתן להשיג אותו ביום אחד. בשל אי דיוקו, רצף סנגר נחשב גם לטכנולוגיה בתקן הזהב, המשמשת לאימות תוצאות שהושגו על ידי רצף הדור הבא.
רצף סנגר משיג אורכי קריאה של כ 800bp (בדרך כלל 500-600bp עם DNA לא מועשר). אורכי הקריאה הארוכים יותר ברצף של סנגר מציגים יתרונות משמעותיים על פני שיטות רצף אחרות במיוחד במונחים של ריצוף אזורים חוזרים של הגנום. אתגר של נתוני רצף לקריאה קצרה הוא בעיה במיוחד ברצף גנומים חדשים (דה נובו) וברצף מקטעי גנום מסודרים מאוד, בדרך כלל אלה שנראים של גנומים סרטניים או באזורים של כרומוזומים המציגים וריאציה מבנית. [cp. Morozova ומרה, 2008]
Hielscher אולטרסוניקה מייצרת homogenizers קולי ביצועים גבוהים מ מַעבָּדָה ל גודל תעשייתי.