פיצול DNA על-קולי לריצוף הדור הבא

ריצוף הדור הבא (NGS) דורש חיתוך ופיצול אמינים של דנ"א גנומי על מנת לרצף גדילי דנ"א גנומיים וליצור ספריות גנום. פיצול מבוקר של דנ"א למקטעי דנ"א הוא שלב חיוני בהכנת הדגימה הנדרש לפני ריצוף הדנ"א. אולטרה-סוניקציה מוכחת כטכניקה יעילה ואמינה לפיצול DNA באורך מסוים. פרוטוקולי פיצול DNA על-קוליים משיגים תוצאות פיצול הניתנות לשחזור. Hielscher ultrasonicators מסוגלים לייצר מגוון רחב של הפצות בגודל מקטע DNA גנומי, לשליטה מדויקת באמצעות הפרמטרים ההפעלה. מכיוון שמערכות גזירת DNA אולטראסוניות של Hielscher זמינות עבור בקבוקונים בודדים ומרובים, כמו גם עבור צלחות מיקרו, הכנת הדגימה הופכת ליעילה ביותר.

ריצוף הדור הבא: פיצול דנ"א על-קולי להכנת הספרייה

על מנת לבצע ריצוף של הדור הבא, יש לבצע את שלושת השלבים הבסיסיים של (1) הכנת ספריה, (2) ריצוף ו-(3) ניתוח נתונים. במהלך הכנת הספרייה, הדנ"א מקוטע, ואז קצות המקטע מתוקנים (מלוטשים) על ידי הוספת בסיס אדנין יחיד ומקטעי המטרה מומרים לדנ"א דו-גדילי. לבסוף מתאמים כביכול מחוברים על ידי קשירה, PCR, או תיוג, כך שניתן לכמת את מוצר ה- DNA של הספרייה הסופית לריצוף.
פיצול DNA באמצעות סוניקציה: במיוחד כאשר טכנולוגיות ריצוף בקריאה קצרה כגון Illumina, שאינן יכולות לקרוא מקטעי DNA ארוכים יותר בקלות, עמדות הדנ"א חייבות להיות מקוטעות לגודל מסוים שניתן להשיג באופן אמין על ידי אולטרה-סוניקציה.
Ultrasonication יכול לשמש באופן אמין עבור DNA, RNA ופיצול כרומטין.

הדור הבא של הרצף – הכנת הספרייה

פיצול DNA על-קולי משמש בדרך כלל בהכנת ספריות ריצוף DNA עבור פלטפורמות ריצוף הדור הבא (NGS). טכניקה זו משמשת לפירוק מולקולות דנ"א למקטעים קטנים יותר בטווח גדלים רצוי, מה שמקל על השלבים הבאים בהכנת הספרייה. פיצול DNA על-קולי נדרש בדרך כלל במהלך שלב הכנת הספרייה של זרימות עבודה של NGS כדי לפצל DNA גנומי לחתיכות קטנות יותר המתאימות לעיבוד וריצוף במורד הזרם. הוא ממלא תפקיד מכריע בהבטחת הצלחת ניסוי הריצוף על ידי יצירת מקטעי DNA בטווח הגדלים המתאים לפלטפורמת הריצוף הספציפית בה נעשה שימוש.

ריצוף הדור הבא – שלבי התהליך:

• פיצול DNA קולי: לפני בניית הספרייה, הדנ"א הגנומי מפוצל לחתיכות קטנות וקלות יותר לניהול. פיצול על-קולי כרוך בשימוש בגלי קול בתדר גבוה כדי לגזור את מולקולות הדנ"א למקטעים בטווח הגדלים הרצוי. שלב זה הוא קריטי מכיוון שהוא מסייע להבטיח שקריאות הרצף שיופקו מאוחר יותר יהיו באורך מתאים לפלטפורמת הרצף בה נעשה שימוש. ניתן להתאים את טווח הגודל של המקטעים בהתאם לדרישות הספציפיות של ניסוי הריצוף.
• הגברה קלונלית על ידי PCR: לאחר פיצול על-קולי, מקטעי הדנ"א עוברים תיקון קצה, קשירת מתאמים והגברת PCR כדי ליצור את ספריות ריצוף הדנ"א הסופיות. שלבים אלה מכינים את מולקולות הדנ"א המפוצלות לתהליך הריצוף על ידי הוספת רצפי מתאם הדרושים להיקשרות לפלטפורמת הריצוף ומתן אתרי הכנה להגברת PCR.
• ריצוף DNA על ידי סינתזה: לאחר הכנת ספריות הריצוף, מתחיל תהליך ריצוף הדנ"א באמצעות סינתזה (SBS). במהלך SBS, רצף הדנ"א נקבע על ידי הוספה רציפה של נוקלאוטידים לגדיל המשלים. שלב זה כולל תגובות מחזוריות של שילוב נוקלאוטידים, הדמיה ומחשוף, מה שמאפשר לקבוע את רצף הדנ"א בהתבסס על האותות הפלואורסצנטיים הנפלטים מהנוקלאוטידים המשולבים.
• רצף מקבילי מאסיבי: בשלב האחרון, תבניות הדנ"א המופרדות מרחבית והמוגברות מרוצפות בו זמנית באופן מקביל מאסיבי. גישת ריצוף בתפוקה גבוהה זו מאפשרת יצירה של מיליוני עד מיליארדי קריאות ריצוף בריצת ריצוף אחת, ומאפשרת קביעה יעילה ומהירה של רצפי DNA.

כיצד פועל פיצול DNA קולי?

סוניקציה, הידועה גם בשם עיבוד דגימה אקוסטית, היא שיטה נפוצה לפיצול DNA. עבור גזירת DNA קולית, הדגימות נחשפות לגלים על-קוליים במצב מבוקר. עקרון העבודה של פיצול DNA קולי מבוסס על תנודות וקוויטציה שנוצרו על ידי גלי אולטרסאונד. כוחות הגזירה הנובעים מקוויטציה על-קולית (אקוסטית) שוברים מולקולות DNA בעלות משקל מולקולרי גבוה. הגדרת סוניקציה כגון עוצמה (משרעת, משך), מצב פעימה וטמפרטורה מאפשרים פיצול DNA מדויק לאורך רצוי מסוים של מקטעי DNA. בעוד DNA לעתים קרובות מופחת ל 100 עד 600 bp באמצעות ultrasonication, קטעי DNA ארוכים יותר של עד 1300 bp ניתן להשיג כאשר תנאים קוליים מתונים מוחלים.

בקרת טמפרטורה למניעת התפרקות DNA

הצורה המולקולרית הדו-גדילית של הדנ"א רגישה מאוד לטמפרטורות גבוהות, כך ששליטה מדויקת על הטמפרטורה במהלך שלבי הכנת הדגימה היא גורם מכריע לתוצאות ניתוח אמינות.
Whether you are using Hielscher’s probe ultrasonicators, the VialTweeter or the UIP400MTP – ניטור ובקרת טמפרטורה רציפים מובטחים הודות לחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור ולתוכנת המכשיר החכם. על מנת לשמור על הטמפרטורה בטווח מסוים, ניתן לקבוע מגבלת טמפרטורה עליונה ותחתונה. כתוצאה מכך, האולטרה-סאונד ישהה ברגע שהטמפרטורה תחרוג ממגבלת טמפרטורה זו וימשיך באופן אוטומטי לסוניק כאשר הטמפרטורה ירדה ב-∆T מוגדר.
התוכנה המתוחכמת של Hielscher ultrasonicators מבטיח תחזוקה אמינה של תנאי טיפול מדגם אידיאלי.

פיצול DNA של דגימת מסה עם האולטרסוניקטור UIP400MTP Multi-Well Plate

מספרי המדגמים במדעי החיים גדלו משמעותית בעשור האחרון. משמעות הדבר היא שיש לעבד מספר גבוה מאוד של דגימות (למשל, 384, 1536 או 3456 בארות לכל מיקרו-לוחית) במהלך הכנת הדגימה וניתוחה בתנאים שווים באופן עקבי על מנת לקבל תוצאות דומות ותקפות. עם UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics עוקב אחר המגמה של עיבוד מדגם המוני. UIP400MTP הוא אולטרסאונד להכנת דגימה באמצעות microplates. UIP400MTP יכול לעבד לוחות עם 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 או 3456 בארות. בהתאם לסוג המיקרו-לוחית, כל באר יכולה בדרך כלל להכיל נפחי דגימה בין עשרות ננוליטרים למספר מיליליטרים. UIP400MTP נמצא בשימוש נרחב במחקר מדעי החיים, והוא נפוץ מאוד להכנת דגימות לפני בדיקות כגון ELISA (בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים) או PCR, לפני ניתוח חלבונים, כמו גם להכנת כרומטין לפני CHiP ו- CHiP-seq, זיהוי שינוי היסטון וטיפולים אנליטיים אחרים (למשל, אלקטרופורזה בג'ל, ספקטרומטריית מסה).
קרא עוד על עיבוד בתפוקה גבוהה של לוחות PCR!

VialTweeter עבור מדגם Praparation של עד 10 בקבוקונים

VialTweeter הוא אולטרסוניקטור מעבדה בשימוש נרחב VialTweeter המאפשר סוניקציה יעילה ונוחה של עד 10 בקבוקונים בו זמנית. מכיוון שהבקבוקונים והמבחנות (למשל, בקבוקוני אפנדורף, בקבוקוני קריו, מבחנות צנטריפוגות) עוברים סוניקציה עקיפה, נמנע כל זיהום צולב. מכיוון שאותה עוצמת אולטרסאונד מועברת לכל דגימה, כל תוצאות הסוניקציה הומוגניות וניתנות לשחזור. ה- VialTweeter מציע את כל התכונות החכמות כמו המכשירים הדיגיטליים האחרים שלנו (למשל, תפריט חכם, הגדרות ניתנות לתכנות, בקרת טמפרטורה, שלט רחוק וכו ') כך שנוחות המשתמש הגבוהה ביותר מובטחת.

בדיקות מרובות אצבעות לצלחות Microwell

זמין עבור הומוגנייזרים בדיקה קולי UP200Ht ו UP200St, בדיקות מרובות אצבעות עם 4 או 8 אצבעות הם אפשרות נוחה לסניק דגימה מרובים בו זמנית באותם תנאים. לדוגמה, הסונוטרוד MTP-24-8-96 הוא בדיקה של שמונה אצבעות, שהיא אידיאלית לשילוב במערכות אוטומטיות או להכנת דגימה ידנית יעילה של בארות של לוחות מרובי בארות. הסונוטרוד מרובה האצבעות אידיאלי לאוטומציה למעבדות, שם מעובדים בעיקר כוסות ומבחנות באמצעות סונוטרודה קולית סטנדרטית. ניתן להחליף במהירות את הגשושיות מרובות האצבעות והסטנדרטיות תוך מספר דקות, ולהפוך את האולטראסוניק של הגשושית היחידה למשבש קולי רב-גשושי.

Hielscher Ultrasonicators עבור פיצול DNA

Hielscher Ultrasonics מציעה פלטפורמות שונות מבוססות אולטרסאונד עבור DNA, RNA, פיצול כרומטין. פלטפורמות שונות אלה כוללות בדיקות על-קוליות (סונוטרודים), פתרונות סוניקציה עקיפים להכנת דגימה בו זמנית של צינורות מרובים או לוחות מרובי בארות (למשל, לוחות 96 בארות, לוחות מיקרוטיטר), סונורקטורים וכוסות קוליות. כל הפלטפורמות לגזירת DNA מופעלות על ידי מעבדים על-קוליים מכווני תדר ובעלי ביצועים גבוהים, הניתנים לשליטה מדויקת ומספקים תוצאות הניתנות לשחזור.

מעבדים קוליים עבור כל מספר מדגם וגודל

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes sample preparation efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constantly controlled ultrasound.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s laboratory ultrasonicators are available at various sizes so that we can recommend you the ideal device for your application and requirements.

בקרת תהליכים מדויקת

Precisely controllable sonication settings are crucial since exhaustive sonification can destroy DNA, RNA and chromatin, but inadequate ultrasonic shearing results in too long DNA and chromatin fragments. Hielscher’s digital ultrasonicators can be easily set to precise sonication parameter. Specific sonication settings can be also saved as programmed setting for fast repetition of the same procedure.
כל הסוניקציה מפרוטוקולת אוטומטית ומאוחסנת כקובץ CSV בכרטיס SD מובנה. זה מאפשר תיעוד מדויק של ניסויים שבוצעו ומאפשר לשנות את ריצות הסוניק בקלות.
באמצעות שלט רחוק של דפדפן, ניתן להפעיל ולנטר את כל האולטרסוניקטורים הדיגיטליים באמצעות כל דפדפן סטנדרטי. התקנה של תוכנה נוספת אינה נדרשת, שכן חיבור LAN מאפשר הגדרת plug-n-play פשוטה מאוד.

הידידותיות הגבוהה ביותר למשתמש בהכנת דגימה קולית

כל Hielscher ultrasonicators נועדו לספק אולטרסאונד ביצועים גבוהים, תוך באותו זמן תמיד להיות מאוד ידידותי למשתמש וקל לתפעול. כל ההגדרות בנויות היטב בתפריט ברור, שניתן לגשת אליו בקלות באמצעות צג מגע צבעוני או שלט רחוק של הדפדפן. התוכנה החכמה עם הגדרות ניתנות לתכנות והקלטת נתונים אוטומטית מבטיחה הגדרות סוניקציה אופטימליות לתוצאות אמינות וניתנות לשחזור. ממשק התפריט הנקי והקל לשימוש הופך את האולטרסוניקטורים של Hielscher למכשירים ידידותיים ויעילים למשתמש.
הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה ליכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד במעבדה שלנו, שהם אידיאליים למשימות הכנת דגימות כגון פיצול DNA ו- RNA, ליזה של תאים וכן מיצוי חלבונים: