היגישר טכנולוגיית אולטרה סאונד

חלץ חלבון Ultrasonic מ תרבויות רקמות תאים

  • מיצוי חלבון מהווה צעד הכנת מדגם חיוני פרוטאומיקה.
  • חלבונים ניתן לחלץ מרקמות צמחים ובעלי חיים, שמרים מיקרואורגניזמים.
  • Sonication היא שיטה להפקת חלבון אמינה, יעיל נותנת תשואות חלבון גבוהות תוך זמן קצר חילוץ.

 

חילוץ חלבונים מרקמות ותאים

מיצוי חלבון מן רקמות תאים בתרבית הוא צעד הכנת מדגם חיוני אשר מבוצע במהלך רבות בטכניקות ביוכימיות אנליטי כגון ELISA, עמוד, מערבי סופג, ספקטרומטריית מסה, או טיהור חלבונים. Ultrasonic תא שיבוש, תמס וחילוץ הוא טכניקה לשליטה מדויקת כדי להבטיח תשואות של חלבונים גבוהות.

מיצוי חלבון מן החי רקמות

להכנת רקמות בגודל מלא (למשל, כליות, לב, ריאות, שרירים וכו '), יש לרקוח את הרקמות לחתיכות קטנות מאוד עם כלים נקיים, על הקרח עדיף, ובמהירות האפשרית כדי למנוע השפלה על ידי פרוטאזות (למשל המאגר תמוגה כגון RIPA או מאגר תמוגה hypotonic המכיל פרוטאז ו phosphatase קוקטייל מעכב). לאחר ניתוחים, המדגם הוא שקוע חנקן נוזלי להקפיא הצמד. המדגם ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר או להיות keept על הקרח עבור homogenization מיידית. מיד לפני החילוץ קולי, קר חיץ קר תמוגה (עם מעכבי פרוטאז DTT, leupeptin ו aprotinin) מתווסף במהירות לתוך צינור מדגם (לכל ~ 10 מ"ג של רקמות כ ~ 600 μL של חיץ מומלץ). כ. 20-60 מ"ג של רקמות מומלץ לכל צינור מדגם.
הומוגניזציה, תמס וחילוץ אולטרסאונד מבוצע עם homogenizer קולי כגון Uf200 ः t אוֹ בית Seating, מצויד sonotrode מיקרו-קצה. משך Sonication הוא 60-90 שניות. במכירת מצב מחזור קולי של 15 שניות. sonication ו 10 שניות. זמן מנוחה. המדגם צריך להישמר קרח כל הזמן.
לאחר הומוגניזציה / החילוץ קולי, lysate centrifuged ב 27,000g עבור כ. 20 דקות. לאחר מכן supernatent נאסף, כך ריכוז החלבון יכול להיקבע על ידי assay חלבון כגון BCA assay חלבון פירס.

Sonication חלבונים היא שיטה חשובה להכנה לדוגמא

הפקת חלבון אולטרה סאונד מתאים עם בית Seating

בקשת מידע





מיצוי חלבון מן בסרום הדם

עבור תערובת הומוגנית של הסרום ואת חיץ פוספט, המדגם הוא vortexed הראשון לפני תמוגה תא קולי. עבור תמוגה קולי, המדגם הוא sonicated עם homogenizer מעבדה קולי כגון מעלהay עבור 8 מחזורים בבית משרעת 20%, במחזורים של כל 5 שניות ועוד 15 שניות מעל. Sonocation מתבצעת על ידי sonicationg במחזורים ועל ידי צבת המדגם על קרח כך כי התחממות יתר ושפלת תרמית של המדגם הוא נמנע. מאז הסרום מכיל כמות גדולה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה (כגון אלבומין, α1-טרפסין, transferrin, haptoglobulin, G אימונוגלובולינים ו אימונוגלובולינים), אשר יפריע הפרדת חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך במהלך IEF, מומלץ לרוקן אותם מן בסרום באמצעות טור דלדול.

מיצוי חלבון מרקמות הצמח

טרי, רקמות צמח רכות, למשל: מוס וכו ', יכול להיות מופר בקלות על ידי הצבת חומר המדגם הקצוץ פשוט חיץ תמוגה עבור sonication. רקמות הצמח Tough, ligenous, כגון זרעים, אשוח מחטים וכו ', יש קרקע יבשה. חומרים צמחיים קשה, וודי חלק חייב להיות קפוא הקרקע בחנקן נוזלי חילוץ לפני על ידי sonication. עבור השעיות תרבות תא צמח, טיפול קולי בין 30 לבין 150 שניות במאגר ימס מספיקה בעיקר. קשוח חומר כגון גרעין דלעת דורש sonication אינטנסיבי יותר כפי שמפורט בהמשך.

פרוטוקול עבור חילוץ קולי של אלבומין מ גרעיני דלעת

homogenizer רקמות אולטרסאונד UP400St עם S24d40 - להפקת חלבון מן הצומח ורקמות בעלי חיים (לחץ להגדלה!)להפקת החלבון הקולית של אלבומין מן אבקת זרעי דלעת משובחת טחון, 10 גרם של אבקת זרעי דלעת נטולה שומן ו 100 מ"ל מי deionised כמו ממס מתווספים בכוס זכוכית 250 מיליליטר. מיצוי חלבון מורכב בשני שלבים: ראשית, המדגם sonicated עם ultrasonicator בדיקה מסוג UP400St (400 ואט, 24kHz) עם S24d7 sonotrode רכוב. כוס מעבדת הזכוכית מושמת באמבט מים קר במהלך הומוגניזציה הקולי. את ההגדרה של ultrasonicator UP400St עם חיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור הבטיחו כי טמפרטורת המדגם נשמרת תמיד מתחת ל -30 מעלות צלזיוס. על ידי בקרת טמפרטורה מדויקת במהלך sonication, denaturation של אלבומין הוא נמנע. שנית, מיצוי בוצע עם מיקסר במהירות 200 סל"ד ו ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן את הכוס מועבר לתוך שייקר תרמוסטטי. Globulin מוסר באמצעות דיאליזה עם מים מזוקקים. לאחר הסרת globulin, ניתן לחלץ את תמצית החלבון לקביעת פרופיל האלבומין והוא מותאם לאחר מכן ל- pI = 3.0 באמצעות 0.1 M HCl עבור קרישת אלבומין. בשלב מוצק מופרדת על ידי צנטריפוגה ב 5000 גרם, 20 ° C ו redysolved במים deionised. קרישת אלבומין מבוצעת פעמיים כדי להגדיל את יחס החלבון באלבומין.

מיצוי אלקליין חלבון אולטרסאונד הכין תרכיז חלבון מסובין אורז עולה כי תוצאות הטיפול הקוליות בתשואת חלבון גבוהה יותר בזמן חילוץ משמעותי קצר יותר – לעומת שיטות חילוץ קונבנציונליות.

מכשיר VialTweeter אולטרסאונד מיצוי חלבון מן דגימות רקמה (לחץ להגדלה!)

VialTweeter עבור sonication עקיף.

יתרונות

  • מָהִיר
  • תשואות גבוהות
  • היעיל ביותר
  • שליטה מדויקת פרמטרים
  • תוצאות לשחזור
  • מדרגיות לינארית

פרוטוקול לדוגמא כהכנה אנזים אינוס פונקציונלי

כדי להשיג אנזים פונקציונלי אינוס באופן מלא (למשל עבור הקרנת סמים), הפרוטוקול הבא מומלץ: השעית התא צריכה להיות ממוקמת על קרח sonicate עם מעלהay ב משרעת 10μm ב מצב מחזור של 5 שניות. sonication ו 25 שניות. לנוח על הקרח. ההליך יש לחזור כ. 3 פעמים. להשראת הזמן בין מחזורי sonication מפחיתה את עליית הטמפרטורה ולכן יקטין את הסיכון denaturation.

Solubilization חלבון אולטרה סאונד

Sonication עלול להאיץ את תהליך solubilization חלבון, אשר בדרך כלל דורש כמה שעות. כדי לא לחמם יותר מדי את המדגם למנוע פירוק חלבונים ושינויים בפתרונות המכילים אוריאה, פרצי הקולי לא צריכים להימשך זמן רב יותר מאשר כמה שניות.

הוראות כלליות

בקרת טמפרטורת הגוף: כדי להבטיח תשואת חלבון גבוהה ללא denaturation תרמי, הטמפרטורה במהלך החילוץ חייבת להיות מבוקרת. homogenizers קולי המדינה- of-art של Hielscher – המכונה גם שמפריד או sonificator קוליים – הם דווקא לשליטה. הם באים עם חיישן טמפרטורה plugable. באפשרויות ההגדרה של homogenizer קולי, טמפרטורה מקסימלית ניתן להגדיר. כשמקס בטמפרטורה זו הוא הגיע, ultrasonicator מפסיק באופן אוטומטי עד המדגם התקרר.
בַּלָם: Choise של חיץ מתאים ואת הנפח התקין של חיץ משתנה בין רקמה לרקמה וחייב להיות הבנתי-אאוט על ידי בדיקות ניסוי וטעייה.
בידוד / טיהור: lysates חלבון יכול להכיל עודף של מולקולות ביולוגיות כגון DNA או פחמימות, אשר ניתן להסיר על ידי (חומצה trichloroacetic-deoxycholate) משקעים חלבון או חיץ החליפין.

Chittapalo ו Noomhorm (2009) דיווחו כי חלבון מגידול בתשואה באמצעות sonication וכי תהליך הומוגניזציה תמוגה רקמות הקולי יכול לשפר תהליכי מיצוי קיימים באופן משמעותי – מה שמאפשר הזדמנויות הפקה מסחריות חדשות.

נשמע הגנה עם מארז צליל של Hielscher SPB-L ו- מכשיר אולטראסאונד UP200St. (לחץ להגדלה!)

homogenizer רקמות אולטרסאונד בית Seating להפקת חלבון יעילה

שליטה מדויקת של הטיפול הקולי (לחץ להגדלה!)

פקד דפדפן לתפעול וניטור מדויק של תהליך sonication

ציוד אולטרסאונד מיצוי חלבון

Hielscher אולטרסוניקה מציע מגוון רחב של homogenizers הקולי עבור ההתפוררות של תאים, רקמות, חיידקים, מיקרואורגניזמים, שמרים, ו נבגים.
ultrasonicators מעבדת Hielscher חזק ונוח לתפעול. נבנה עבור 24/7 מבצע, הם נועדו התקני מעבדה חזקים ויעילים ספסל העליון. לכל המכשירים, תפוקת האנרגיה ואת משרעת ניתן לשלוט באופן מדויק. המגוון הרחב של אביזרים פותח אפשרויות הגדרה נוספות. המכשירים הדיגיטליים כגון VialTweeter, Uf200 ः t, בית Seating, ו UP400St יש בקרת טמפרטורה משולבת ו מובנית כרטיס SD להקלטת נתונים אוטומטית.
עבור עקיף, בין הזיהום הנטול sonication סימולטני של דגימות מרובות, אנו מציעים את VialTweeter או ה cuphorn אולטרסאונד.
בהתאם נפח היישום, החומר, ואת המדגם שלך, אנו ממליצים לך את ההתקנה המתאימה ביותר עבור הכנת המדגם שלך. צור קשר עוד היום!

תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!

אנא השתמש בטופס להלן, אם אתה רוצה לבקש מידע נוסף על homogenization קולי. נשמח להציע לך מערכת קולי הפגישה הדרישות שלך.









הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.


ספרות / הפניות

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): אולטרסאונד סייע חילוץ אלקלי של חלבון מן הסובין אורז נטול שומן ומאפיינים של תרכיזי החלבון. Technol Sci מזון J Int 44: 1843-1849.
  • Simões, אנדרה E.S :; פריירה, דיאן M .; אמארל, ג'ואנה D .; נונס, אנה F .; גומז, סופיה E .; רודריגז, פדרו M .; Lo, אדריאן ג .; D'Hooge, רודי; Steer, קליפורד J .; Thibodeau, סטיבן N .; Borralho, פדרו M .; רודריגז, ססיליה M.P. (2013): התאוששות יעילה של חלבונים מן דגימות מקור מרובות לאחר מיצוי RNA TRIzol או TRIzol LS אחסון לטווח ארוך. BMC Genomics 2013, 14: 181.


עובדות שראוי לדעת

פרוטאומיקה

פרוטאומיקה הוא בתחום המחקר כי חוקר חלבונים ואת proteome. חלבונים fullfil מגוון רחב של פונקציות חיוניות בתוך אורגניזמים. Proteome הוא הסט השלם של חלבונים לידי ביטוי על ידי הגנום, תא, רקמה, או אורגניזם בזמן מסוים. Proteome משתנה עם דרישות הזמן נבדל, או מדגיש, כי תא או אורגניזם עובר. באופן ספציפי יותר, הוא הסט של חלבונים לידי ביטוי בסוג מסוים של תאים או אורגניזם, בכל זמן נתון, בתנאים מוגדרים. המונח הוא תערובת של חלבונים בגנום. פרוטאומיקה הוא המחקר של proteome.

חֶלְבּוֹן

חלבונים הם נמצאים ביומולקולות גדולים, מקרומולקולות שנקרא – אשר מורכבים מרשת אחת ארוכה או ארוכה של שאריות חומצות אמינו. חלבונים קיימים בכל האורגניזמים שמקורם צמחוני ובעלי חיים והם חיוניים לרוב התפקודים הביולוגיים. מאז החלבונים מכילים הרבה מידע ביולוגי, הם מופקים למטרות אנליטיות, למשל עבור מחקר proteomic. הפונקציה החשובה ביותר שמבוצעת על ידי חלבונים כוללת את קטליזה של תגובות מטבוליות, שכפול דנ"א, תגובה לגירויים, והעברת מולקולות ממקום אחד למשנהו. חלבונים שונים זה מזה בעיקר ברצף חומצות האמינו שלהם, המוכתב על ידי רצף הנוקליאוטידים של הגנים שלהם, ובדרך כלל גורם לחלבון המתקפל למבנה תלת-ממדי ספציפי הקובע את פעילותו. חלבונים הם – מלבד פפטידים – אחד המרכיבים העיקריים של מזון. לכן, חקר חלבונים הוא כלי רב עצמה במדע מזון כדי לייעל תהליכים, בטיחות מזון הערכה תזונתית.

ג'ל אלקטרופורזה

ג'ל אלקטרופורזה היא השיטה מרכזי ההפרדה וניתוח של מקרומולקולות כגון דנ"א, רנ"א וחלבונים וכן שברי שלהם, המבוסס על גודל ממשלח ידם. הוא משמש כימיה קלינית להפריד חלבונים על ידי תשלום ו / או גודל (IEF agarose, בעצם גודל עצמאי) ואת בביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית פרוטאומיקה להפריד אוכלוסייה מעורבת של שברי DNA ו- RNA לפי אורך, כדי להעריך את גודלו של ה- DNA ושברי RNA או להפריד חלבונים על ידי הממונה.

תא תרבויות

תרבית תאים היא התהליך הגוברת בשליטה אשר תאי מעובדות בתנאים מבוקרים. תנאי תרבית תאים להשתנות לכל סוג תא. באופן כללי, את הסביבה של תרבית תאים מורכבת כלי מתאים (צלחת פטרי למשל) עם מצע או בינוני המספק את החומרים מזינים החיוניים (חומצות אמינו, פחמימות, ויטמינים, מינרלים), גורמי גדילה, הורמונים, וגזים (CO2, The2), וכן מסדיר את הסביבה פיזיו-כימיים (חיץ pH, הלחץ האוסמוטי, טמפרטורה). רוב התאים צריכים משטח או מצע מלאכותי, בעוד תרביות תאים אחרות יכולות להיות מעובדים צפות חופשיות בינוני תרבות (תרבות השעיה, השעית תא).
תרבויות המוניות של שורות תאי בעלי חיים משמשות בייצור תעשייתי של חיסונים ויראלי ומוצרים שמקורם biotechnologically אחרים. תאי גזע אנושיים בתרבית כדי להרחיב את מספר התאים ולבדל את התאים לתוך סוגי תאים סומטיים שונים למטרות השתלה.

דגימות רקמה

הרקמה המונחת מתארת ​​ביניים הסלולר, שבו חומר התא הוא ברמה ארגונית בין תאים לבין איבר שלם. בשנת רקמות, תאים דומים, מאותו מוצא כי יחד לבצע פונקציה מסוימת, הם התאספו. עד הקיבוץ הפונקציונלי של רקמות מרובות, המבנים המורכבים של איברים נוצרים.
רקמות נדגם למחקר בביולוגיה, היסטולוגיה / histopathology, פרזיטולוגיה, הביוכימיה, אימונוהיסטוכימיה כמו גם לטפח ולחלץ DNA. זה ניתן להבחין בין בעלי חיים (יחיד משנה: רקמות יונקות) ורקמות צמח. רקמות חיות נחלקות לארבעת הסוגים הבסיסיים של חיבור, שרירים, עצבים, רקמות אפיתל. רקמת צמח מחולקת למערכות השלוש הרקמות הבאות: האפידרמיס, רקמת הקרקע, ואת רקמת כלי הדם.
דגימות רקמות ניתן להכין מחלקי חיים או צמח, למשל, עצם, שריר, עלים, וכו '

נוזלי גוף

דם, סרום, פלזמה, הנוזל השדרתי, רוק נוזל סינוביאלי הם נוזלים בגוף, אשר מציעים מקור מצוין של מידע רלוונטי אבחנתית. לכן, הכנה מתוחכמת של דגימות נוזל גוף לניתוח חשובה. הקושי הראשון קשור הטווח הדינמי הרחב של רכיבים הנמצאים בנוזלי גוף.

קביעת ריכוז חלבון

assay ברדפורד, assay לורי וחומצת bicinchoninic (BCA) assay הם מבחנים משותפים כדי לקבוע את הריכוז של חלבונים. אלבומין בסרום שור (BSA) הוא אחד סטנדרטי חלבון השכיח ביותר.

תמוגה

חיץ תמוגה חייב להיבחר בהתאם לחומר תא או רקמה (בתרבית רקמה, צמח, חיידקים, פטריות, וכו '), והאם התאים במבנה ובסוג המבנה. קיים מגוון רחב של ימס מאגרים להפקת חלבונים, ממברנות, האברונים מנוסחים עם דטרגנטים אחד או יותר. הדטרגנט בדרך כלל מסומן באמצעות בדיקות ניסוי וטעייה או – אם זמין – על פי פרוטוקול מיצוי חלבון קיים. הדטרגנט חייב להיות תואם את מקור רקמות ואת החלבונים. באופן כללי, חומר הניקוי המתון ביותר שמתאים רקמה / חלבון ספציפי, נבחר על מנת לשמור על פונקציונליות מירבית של התמצית. יתר על כן, במקרה של מיצוי של ממברנות האברונים, ניקוי עדין שומר על בקרומית. בדרך כלל דטרגנטים המשמשים מאגרים תמס הם ברובם nonionic או zwitterionic, למשל: בחורים, deoxycholate, טריטון ™ X-100, NP40, ו Tween 20.
למשל, ברקמות כגון מוח, כבד, מעי, כליות, וכו 'טחול ניתן שנאגרו פשוט עם ריפה – אולם מעכבי פרוטאז DTT (לדוגמא ג'ל אלקטרופורזה) צריכים להיכלל.
תמוגה חיץ עבור רקמת שריר השלד (קר כקרח): 20 מ"מ טריס (pH 7.8), 137 מ"מ NaCl, 2.7 KCl mM, 1 מ"מ MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) גליצרול, 1 מ"מ EDTA , 1 מ"מ dithiothreitol בתוספת קוקטייל פרוטאז מעכב phosphatase
טבלה של מאגרים משותפים טווח ה- pH שלהם. באופן כללי, מאגרים אלה משמשים בדרך כלל בריכוזים של 20-50 מ"מ.

בַּלָם טווח ה- pH
חוּמצַת לִימוֹן – מיכל שנקר 2.2 – 6.5
נתרן ציטרט – חוּמצַת לִימוֹן 3.0 – 6.2
אצטט נתרן – חומצה אצטית 3.6 – 5.6
מלח נתרן של חומצה Cacodylic – HCl 5.0 – 7.4
שלי – מיכל שנקר 5.6 – 6.8
פוספט dihydrogen נתרן – פוספט מימן disodium 5.8 – 8.0
סרדאמיד – HCl 6.2 – 7.8
מגבים – קו 6.6 – 7.8
הידרוכלוריד triethanolamine – מיכל שנקר 6.8 – 8.8
טריס – HCl 7.0 – 9.0
מיכל ביטון – מיכל שנקר 7.2 – 8.2
tricine – מיכל שנקר 7.6 – 8.6
נתרן tetraborate – חומצה בורית 7.6 – 9.2
ביקס – מיכל שנקר 7.7 – 8.9
גליצין – מיכל שנקר 8.6 – 10.6

רוב מאגרי להראות-תלות pH עם טמפרטורה. הדבר נכון במיוחד עבור מאגרים טריס. PKa משתנה מעת 8.06 בשעה 25 ° C עד 8.85 ב 0 מעלות צלזיוס.
(PH ו pKa של מאגר: pH מודד את ריכוז יוני מימן בתמיסה מימית pKa (= ניתוק חומצה קבועה) הוא מדד קשור, אבל יותר ספציפי, בכך שהוא מסייע לנבא כיצד מולקולה תפעל בכל ספציפיים. ערך חומציות.)

טריזיול

TRIzol פתרון כימי המשמש לחלץ RNA / DNA / חלבון במהלך החילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium. השימוש בתוצאות מיצוי TRIzol סייעו באולטרסאונד ב DNA הגבוהה, RNA, ותשואות חלבון מאותו המדגם ומצטיין ובכך שיטות חילוץ אחרות.