מיצוי חלבון אולטראסוני מתרביות רקמה ותאים
- מיצוי חלבונים הוא שלב חיוני בהכנת דגימות בפרוטאומיקה.
- חלבונים יכולים להיות מופקים מרקמת צמחים ובעלי חיים, שמרים ומיקרואורגניזמים.
- סוניקציה היא שיטת מיצוי חלבונים אמינה ויעילה המעניקה תפוקת חלבון גבוהה בזמן מיצוי קצר.
מיצוי חלבונים מרקמות ותאים
מיצוי חלבונים מרקמות ותאים בתרבית הוא שלב חיוני להכנת דגימות המבוצע במהלך טכניקות ביוכימיות ואנליטיות רבות כגון ELISA, PAGE, Western blotting, ספקטרומטריית מסות או טיהור חלבונים. שיבוש תאים אולטראסוניים, ליזה ומיצוי היא טכניקה לא תרמית הניתנת לשליטה מדויקת כדי להבטיח תפוקות גבוהות של חלבונים.
מיצוי חלבון מתאים עם בדיקה קולית UP200St
- מהירה
- תשואות גבוהות
- יעילות גבוהה
- שליטה מדויקת בפרמטרים
- תוצאות הניתנות לשחזור
- מדרגיות ליניארית
הוראות כלליות עבור ליזה קולית מיצוי חלבון
- בקרת טמפרטורה: כדי להבטיח תפוקת חלבון גבוהה ללא דנטורציה תרמית, יש לשלוט בטמפרטורה במהלך המיצוי. ההומוגנייזרים האולטרסוניים החדישים של Hielscher – נקרא גם דיסאינטגרטור קולי או Ultrasonifier – ניתנים לשליטה מדויקת. הם מגיעים עם חיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. באפשרויות ההגדרה של הומוגנייזר קולי, ניתן להגדיר טמפרטורה מקסימלית. כאשר מגיעים לטמפרטורה מקסימלית זו, האולטרסאונד מפסיק אוטומטית עד שהדגימה מתקררת.
- מאגר: הבחירה של חיץ מתאים ונפח החיץ הנכון משתנה מרקמה לרקמה ויש להבין אותה על ידי בדיקת ניסוי וטעייה.
- בידוד/טיהור: ליזטים חלבוניים יכולים להכיל עודף של ביומולקולות כגון דנ"א או פחמימות, אשר עשויים להיות מוסרים על ידי משקעים חלבוניים (חומצה deoxycholate-trichloroacetic) או חילופי חיץ.
Chittapalo ו- Noomhorm (2009) דיווחו במחקרם כי תפוקת החלבון גדלה באמצעות סוניקציה וכי תהליך הומוגניזציה וליזה של רקמות על-קוליות יכול לשפר את תהליכי המיצוי הקיימים באופן משמעותי – מתן אפשרות להזדמנויות חילוץ מסחריות חדשות.
כוסית אולטראסונית להכנת דגימות סימולטניות ויעילות ביותר של דגימות מרובות באותם תנאים לבידוד חלבונים ופיצול DNA.
מיצוי חלבון מרקמת בעלי חיים
להכנת רקמה בגודל שלם (למשל כליות, לב, ריאות, שרירים וכו'), יש לנתח את הרקמה לחתיכות קטנות מאוד עם כלים נקיים, רצוי על קרח, ומהר ככל האפשר כדי למנוע התפרקות על ידי פרוטאזות (למשל חיץ ליזה כגון RIPA או חיץ ליזה היפוטוני המכיל פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז). לאחר הניתוח, הדגימה שקועה בחנקן נוזלי להקפאת הצמדה. ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר או להישמר על קרח לצורך הומוגניזציה מיידית. מיד לפני מיצוי קולי, חיץ ליזה קר כקרח (עם מעכבי פרוטאז DTT, leupeptin ו aprotinin) הוא הוסיף במהירות לתוך צינור הדגימה (לכל ~ 10 מ"ג של רקמה כ. ~ 600 μL של חיץ מומלץ). מומלץ כ-20-60 מ"ג רקמה לכל צינור דגימה.
הומוגניזציה קולית, ליזה ומיצוי מבוצעת עם הומוגנייזר קולי כגון UP100H או UP200Ht, מצויד בסונוטרודה מיקרו-טיפ. משך הסוניק הוא 60-90 שניות במצב מחזור על-קולי של 15 שניות סוניקציה ו-10 שניות זמן מנוחה. הדגימה צריכה להישמר בקרח כל הזמן.
לאחר הומוגניזציה / מיצוי קולי, הליזט עובר צנטריפוגה במשקל 27,000 גרם למשך כ-20 דקות. לאחר מכן נאספים הסופרנאטנט, כך שניתן לקבוע את ריכוז החלבון על ידי בדיקת חלבון כגון בדיקת חלבון פירס BCA.
מיצוי חלבון מסרום הדם
עבור תערובת הומוגנית של הסרום ואת חיץ פוספט, הדגימה הוא מערבל הראשון לפני ליזה תאים קולי. עבור הליזה העל-קולית, הדגימה עוברת סוניזציה באמצעות הומוגנייזר מעבדה על-קולי כגון UP100H למשך 8 מחזורים באמפליטודה של 20%, עבור מחזורים של כל 5 שניות דולקות ו-15 שניות כבויות. מיצוי החלבון מתבצע על ידי סוניזציה במחזורים (מצב פעימה) ועל ידי הנחת הדגימה על קרח, כך שנמנעת התחממות יתר והשפלה תרמית של הדגימה. מכיוון שהסרום מכיל כמות גדולה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה (כגון אלבומין, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G ואימונוגלובולין A), אשר מפריעים להפרדת חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך במהלך IEF, מומלץ לרוקן אותם מהסרום באמצעות עמודת דלדול.
מיצוי חלבון מרקמת הצמח
רקמת צמח טרייה ורכה, למשל טחב וכו', יכולה להיות משובשת בקלות פשוט על ידי הנחת חומר הדגימה הקצוץ בחיץ ליזיס לצורך סוניקציה. רקמות צמחים קשות ומזיקות, כגון זרעים, מחטי אשוח וכו', צריכות להיות יבשות. חלק מהחומרים הצמחיים הקשים והעציים חייבים להיות מוקפאים ונטחנים בחנקן נוזלי לפני שהם מופקים על ידי סוניקציה. עבור תרחיפים של תרבית תאי צמחים, טיפול קולי בין 30 ל -150 שניות בחיץ ליזה מספיק בעיקר. חומר קשיח יותר כגון גרעיני דלעת דורש סוניקציה אינטנסיבית יותר כמתואר להלן.
פרוטוקול למיצוי אולטראסוני של אלבומין מזרעי דלעת
עבור מיצוי חלבון קולי של אלבומין אבקת זרעי דלעת טחון דק, 10 גרם של אבקת זרעי דלעת defatted ו 100 מ"ל של מים deionized כמו ממס מתווספים 250mL זכוכית beker. מיצוי החלבון מורכב משני שלבים: ראשית, הדגימה היא סוני עם אולטרסאונד מסוג בדיקה UP400St (400W, 24kHz) מצויד בסונוטרוד S24d7. הזכוכית ממוקמת באמבט מים קרים במהלך ההומוגניזציה הקולית. חיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור והגדרות בקרת הטמפרטורה של האולטרסוניקטור UP400St מבטיחים שטמפרטורת הדגימה תישמר תמיד מתחת ל-30°C. על ידי בקרת הטמפרטורה המדויקת במהלך סוניקציה, דנטורציה של אלבומין נמנע. שנית, החילוץ בוצע באמצעות מיקסר במהירות 200 סל"ד וב-30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכוס מועברת לשייקר תרמוסטטי. גלובולין מוסר באמצעות דיאליזה עם מים מזוקקים. לאחר הסרת הגלובולין, ניתן לדגום את תמצית החלבון לקביעת פרופיל האלבומין ולאחר מכן להתאים אותה ל- pI=3.0 באמצעות 0.1 M HCl לקרישת אלבומין. הפאזה המוצקה מופרדת על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5000 גרם, 20 מעלות צלזיוס ומומסת מחדש במים שעברו דה-יוניזציה. קרישת אלבומין מבוצעת פעמיים כדי להגדיל את יחס החלבון בתרכיז האלבומין.
מיצוי חלבון אלקליין אולטראסוני להכנת תרכיז חלבון מסובין אורז מראה כי הטיפול האולטרסוני מביא לתפוקת חלבון גבוהה יותר בזמן מיצוי קצר משמעותית – בהשוואה לשיטות מיצוי קונבנציונליות.
פרוטוקול הכנת דגימה לאנזים iNOS פונקציונלי
כדי לקבל אנזים iNOS מתפקד במלואו (למשל לבדיקת תרופות), מומלץ להשתמש בפרוטוקול הבא: מתלה התא צריך להיות ממוקם על קרח והוא מסוניק עם UP100H באמפליטודה של 10μm במצב מחזור של 5 שניות סוניקציה ו-25 שניות מנוחה על קרח. יש לחזור על ההליך כ. 3 פעמים. זמן המנוחה בין מחזורי הסוניק מפחית את עליית הטמפרטורה ולכן יפחית את הסיכון לדנטורציה.
מסיסות חלבון על-קולית
סוניקציה עשויה להאיץ את תהליך המסיסות החלבונית, אשר בדרך כלל דורש מספר שעות. על מנת לא לחמם יתר על המידה את הדגימה ולמנוע פירוק חלבונים ושינויים בתמיסות המכילות אוריאה, התפרצויות קוליות לא אמורות להימשך יותר מכמה שניות.
אולטרסאונד UP200Ht עם microtip S26d2 בקוטר 2 מ"מ לסוניק של דגימות קטנות.
ציוד אולטראסוני למיצוי חלבונים
Hielscher Ultrasonics מציעים מגוון רחב של homogenizers קולי עבור התפוררות של תאים, רקמות, חיידקים, מיקרואורגניזמים, שמרים, ונבגים.
אולטרסאונד מעבדה Hielscher הם חזקים וקלים לתפעול. הם בנויים לפעולה 24/7, והם מתוכננים כמכשירי מעבדה וספסל חזקים ויעילים. עבור כל המכשירים, ניתן לשלוט במדויק בתפוקת האנרגיה ובמשרעת. המגוון הרחב של האביזרים פותח אפשרויות התקנה נוספות. האולטרסוניקטורים הדיגיטליים כגון VialTweeter, UP200Ht, UP200St ו- UP400St כוללים בקרת טמפרטורה משולבת וכרטיס SD מובנה להקלטת נתונים אוטומטית.
עבור סוניקציה עקיפה, ללא זיהום צולב ובו-זמנית של דגימות מרובות, אנו מציעים את VialTweeter או את CupHorn קולי.
הטבלה הבאה נותנת סקירה כללית על האולטרסאונד שלנו להכנת דגימה, שיבוש תאים וחילוץ. לחץ על סוג המכשיר כדי לקבל מידע נוסף על כל הומוגנייזר קולי. הצוות הטכני המיומן והוותיק שלנו ישמח לעזור לכם לבחור את האולטרסאונד המתאים ביותר להכנת הדגימה שלכם!
| נפח אצווה | קצב זרימה | מכשירים מומלצים |
|---|---|---|
| עד 10 בקבוקונים או צינורות | נ.א. | VialTweeter |
| צלחות מולטיוול / מיקרוטיטר | נ.א. | UIP400MTP |
| צינורות / כלים מרובים | נ.א. | קופהורן |
| 1 עד 500 מ"ל | 10 עד 200 מ"ל/דקה | UP100H |
| 10 עד 1000 מ"ל | 20 עד 200 מ"ל/דקה | UP200Ht, UP200ST |
| 10 עד 2000 מ"ל | 20 עד 400 מ"ל/דקה | UP400ST |
בהתאם ליישום, לחומר ולנפח הדגימה שלך, אנו נמליץ לך על ההתקנה המתאימה ביותר להכנת הדגימה שלך. צרו קשר עוד היום!
צרו קשר! / שאל אותנו!
Hielscher ultrasonicators דיגיטלי כוללים שלט רחוק דפדפן פרוטוקול נתונים אוטומטי על כרטיס SD משולב.
VialTweeter עבור סוניקציה עקיפה.
עובדות שכדאי לדעת
פרוטאומיקה
פרוטאומיקה היא תחום המחקר החוקר חלבונים ואת הפרוטאום. חלבונים ממלאים מגוון רחב של פונקציות חיוניות בתוך אורגניזמים. פרוטאום הוא כל מערך החלבונים המבוטאים על ידי גנום, תא, רקמה או אורגניזם בזמן מסוים. הפרוטאום משתנה עם הזמן ועם דרישות שונות, או מתחים, שעובר התא או האורגניזם. באופן ספציפי יותר, זוהי קבוצה של חלבונים מבוטא בסוג נתון של תא או אורגניזם, בזמן נתון, בתנאים מוגדרים. המונח הוא תערובת של חלבונים וגנום. פרוטאומיקה היא חקר הפרוטאום.
חלבון
חלבונים הם ביומולקולות גדולות, מה שנקרא מקרומולקולות – אשר מורכבים משרשרת ארוכה אחת או יותר של שאריות חומצות אמינו. חלבונים נמצאים בכל האורגניזמים הן ממקור צמחי והן ממקור מן החי והם חיוניים לרוב התפקודים הביולוגיים. מכיוון שחלבונים מכילים מידע ביולוגי רב, הם מופקים למטרות אנליטיות, למשל למחקר פרוטאומי. הפונקציה החשובה ביותר המבוצעת על ידי חלבונים כוללת קטליזה של תגובות מטבוליות, שכפול DNA, תגובה לגירויים והעברת מולקולות ממקום אחד למשנהו. חלבונים נבדלים זה מזה בעיקר ברצף חומצות האמינו שלהם, המוכתב על ידי רצף הנוקלאוטידים של הגנים שלהם, ואשר בדרך כלל גורם לחלבון להתקפל למבנה תלת ממדי מסוים הקובע את פעילותו. חלבונים הם – מלבד פפטידים – אחד המרכיבים המרכזיים של מזון. לכן, פרוטאומיקה היא כלי רב עוצמה במדעי המזון כדי לייעל תהליכים, בטיחות מזון והערכה תזונתית.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction הוא הליך קדם-אנליטי להפריד ולהתוודות מראש לאנליטים. בשילוב עם אולטרה-סוניקציה, ניתן להגביר את חילוץ נקודות הענן ולהפוך את התהליך ליעיל יותר, מהיר יותר וידידותי יותר לסביבה. עם ultrasonication, חילוץ נקודת ענן היא שיטה יעילה יותר באופן משמעותי של הכנה אנליטית. קרא עוד על חילוץ נקודות ענן בסיוע אולטרסאונד!אלקטרופורזה ג'ל
אלקטרופורזה בג'ל היא השיטה העיקרית להפרדה וניתוח של מקרומולקולות כגון DNA, RNA וחלבונים, כמו גם המקטעים שלהם, בהתבסס על גודלם ומטענם. הוא משמש בכימיה קלינית להפרדת חלבונים לפי מטען ו/או גודל (IEF agarose, למעשה בלתי תלוי בגודל) ובביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית ופרוטאומיקה כדי להפריד אוכלוסייה מעורבת של מקטעי DNA ו-RNA לפי אורך, להעריך את גודלם של מקטעי DNA ו-RNA או להפריד חלבונים לפי מטען.
תרביות תאים
תרבית תאים היא תהליך גידול מבוקר שבו תאים מעובדים בתנאים מבוקרים. תנאי תרבית התאים משתנים עבור כל סוג תא. באופן כללי, הסביבה של תרבית תאים מורכבת מכלי מתאים (למשל צלחת פטרי) עם מצע או תווך המספק את החומרים המזינים החיוניים (חומצות אמינו, פחמימות, ויטמינים, מינרלים), גורמי גדילה, הורמונים וגזים (CO2טו,2), ומווסת את הסביבה הפיזיו-כימית (חיץ pH, לחץ אוסמוטי, טמפרטורה). רוב התאים זקוקים למשטח או למצע מלאכותי, בעוד תרביות תאים אחרות ניתנות לגידול צף חופשי בתווך תרבית (תרבית תרחיף, תרחיף תאים).
תרביות המוניות של קווי תאים של בעלי חיים משמשות בייצור תעשייתי של חיסונים נגיפיים ומוצרים אחרים הנגזרים מביוטכנולוגיה. תאי גזע אנושיים מתורבתים כדי להרחיב את מספר התאים ולהתמיין לסוגי תאים סומטיים שונים למטרות השתלה.
דגימות רקמות
המונח רקמה מתאר מתווך תאי, שבו חומר התא נמצא ברמה ארגונית בין תאים לאיבר שלם. ברקמה, תאים דומים, מאותו מקור כי יחד לבצע פונקציה מסוימת, מורכבים. על ידי קיבוץ פונקציונלי של רקמות מרובות, מבנים מורכבים של איברים נוצרים.
רקמות נדגמות למחקר בביולוגיה, היסטולוגיה / היסטופתולוגיה, פרזיטולוגיה, ביוכימיה, אימונוהיסטוכימיה וכן לטיפוח והפקת DNA. ניתן להבחין בין בעל חיים (תת-חלוקה: רקמת יונק) לבין רקמת צמח. רקמות בעלי חיים מקובצות לארבעת הסוגים הבסיסיים של רקמת חיבור, שרירים, עצבים ואפיתל. רקמת הצמח מחולקת לשלוש מערכות הרקמה הבאות: האפידרמיס, רקמת הקרקע ורקמת כלי הדם.
ניתן להכין דגימות רקמות מחלקי בעלי חיים או צמחים, כגון עצמות, שרירים, עלים וכו '.
נוזלי גוף
דם, סרום, פלזמה, נוזל מוחי שדרתי, רוק ונוזל סינוביאלי הם נוזלי גוף, המציעים מקור נהדר למידע רלוונטי לאבחון. לכן, הכנה מתוחכמת של דגימות נוזלי גוף לניתוח חשוב. הקושי הראשון קשור למגוון הדינמי הרחב של המרכיבים הקיימים בנוזלי הגוף.
קביעת ריכוז החלבונים
בדיקת ברדפורד, בדיקת לורי ובדיקת חומצה ביכומונית (BCA) הן בדיקות נפוצות לקביעת ריכוז החלבונים. אלבומין בסרום בקר (BSA) הוא אחד מתקני החלבון הנפוצים ביותר.
חיץ ליזיס
יש לבחור את חיץ הליזיס בהתאם לחומר התא או הרקמה (תרבית רקמות, צמח, חיידקים, פטריות וכו'), והאם התאים נמצאים במבנה ובסוג המבנה. מגוון רחב של מאגרי ליזה למיצוי חלבונים, ממברנות ואברונים מנוסחים עם דטרגנטים אחד או יותר. חומר הניקוי נבחר בדרך כלל באמצעות בדיקות ניסוי וטעייה או – אם זמין – על פי פרוטוקול מיצוי חלבון קיים. חומר הניקוי חייב להיות תואם למקור הרקמה ולחלבונים. באופן כללי, חומר הניקוי העדין ביותר שעובד עבור רקמה/חלבון ספציפיים, נבחר על מנת לשמור על הפונקציונליות המקסימלית של התמצית. יתר על כן, במקרה של מיצוי של קרומים ואברונים, חומר ניקוי עדין שומר על הממברנה שלמה. חומרי ניקוי נפוצים במאגרי ליזה הם לרוב לא יוניים או זוויטריים, למשל CHAPS, דאוקסיכולאט, טריטון™ X-100, NP40 וטווין 20.
לדוגמה, רקמות כגון מוח, כבד, מעי, כליות, טחול וכו 'ניתן פשוט לאגור עם RIPA – עם זאת, יש לכלול מעכבי פרוטאז ו-DTT (למשל עבור אלקטרופורזה בג'ל).
חיץ ליזיס לרקמת שרירי השלד (קר כקרח): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) גליצרול, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol בתוספת פרוטאז וקוקטייל מעכבי פוספטאז
טבלה של מאגרים נפוצים וטווח החומציות שלהם. באופן כללי, מאגרים אלה משמשים בדרך כלל בריכוזים של 20-50 mM.
| מאגר | טווח pH |
|---|---|
| חומצת לימון – נאוה | 2.2 – 6.5 |
| נתרן ציטראט – חומצת לימון | 3.0 – 6.2 |
| נתרן אצטט – חומצה אצטית | 3.6 – 5.6 |
| חומצה קקודילית, נתרן מלח – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – נאוה | 5.6 – 6.8 |
| נתרן דימימן פוספט – דיסודיום מימן פוספט | 5.8 – 8.0 |
| אימידזול – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – קו | 6.6 – 7.8 |
| טריאתנולמין הידרוכלוריד – נאוה | 6.8 – 8.8 |
| טריס – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – נאוה | 7.2 – 8.2 |
| טריצין – נאוה | 7.6 – 8.6 |
| נתרן טטרבוראט – חומצה בורית | 7.6 – 9.2 |
| ביצין – נאוה | 7.7 – 8.9 |
| גליצין – נאוה | 8.6 – 10.6 |
רוב המאגרים מראים תלות pH עם טמפרטורה. זה נכון במיוחד עבור מאגרי Tris. רמת ה-pKa משתנה מ-8.06 ב-25°C ל-8.85 ב-0°C.
(pH ו-pKa של חיץ: pH מודד את ריכוז יוני המימן בתמיסה מימית. pKa (= קבוע דיסוציאציה חומצית) הוא מדד קשור, אך ספציפי יותר, בכך שהוא עוזר לחזות כיצד מולקולה תפעל בערך pH מסוים.)
טריזול
TRIzol היא תמיסה כימית המשמשת למיצוי RNA/DNA/חלבון במהלך מיצוי גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם. השימוש במיצוי TRIzol בסיוע אולטרה-סאונד מביא לתפוקה גבוהה של DNA, RNA וחלבון מאותה דגימה ומצטיין בשיטות מיצוי אחרות.
ספרות/מקורות
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.