מיצוי אולטרסוני של חלבונים מרקמות ומתרביות תאים
- מיצוי חלבונים הוא שלב חיוני בהכנת דגימות בפרוטאומיקה.
- ניתן למצות חלבונים מרקמות צמחיות ומרקמות של בעלי חיים, משמרים וממיקרואורגניזמים.
- סוניקציה היא שיטה אמינה ויעילה למיצוי חלבונים, המניבה תפוקות חלבון גבוהות בזמן מיצוי קצר.
מיצוי חלבונים מרקמות ומתאים
מיצוי חלבונים מרקמות ומתאים בתרבית הוא שלב חיוני בהכנת דגימות, המתבצע במסגרת טכניקות ביוכימיות ואנליטיות רבות, כגון ELISA, PAGE, תספיג מערבי, ספקטרומטריית מסה או טיהור חלבונים. פירוק תאים, ליזיס ומיצוי באמצעות אולטרסאונד הם טכניקה לא תרמית הניתנת לבקרה מדויקת, להבטחת תפוקות חלבון גבוהות.
מיצוי חלבונים מתאים באמצעות הגשושית האולטרסונית UP200St
- מהירות
- תפוקות גבוהות
- יעילות גבוהה מאוד
- בקרה מדויקת של הפרמטרים
- תוצאות הניתנות לשחזור
- הגדלה ליניארית של קנה המידה
הוראות כלליות לליזיס ולמיצוי חלבונים באמצעות אולטרסאונד
- בקרת טמפרטורה: כדי להבטיח תפוקת חלבון גבוהה ללא דנטורציה תרמית, יש לבקר את הטמפרטורה במהלך המיצוי. ההומוגנייזרים האולטרסוניים המתקדמים של Hielscher – המכונים גם מפרקים אולטרסוניים או סוניקטורים – ניתנים לבקרה מדויקת. הם מסופקים עם חיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. באפשרויות ההגדרה של ההומוגנייזר האולטרסוני ניתן להגדיר טמפרטורה מרבית. כאשר הטמפרטורה מגיעה לערך המרבי הזה, המכשיר האולטרסוני נעצר אוטומטית עד שהדגימה מתקררת.
- בופר: הבחירה בבופר מתאים ובנפח הבופר הנכון משתנה מרקמה לרקמה, ויש לקבוע אותם באמצעות בדיקות ניסוי וטעייה.
- בידוד / טיהור: תוצרי ליזיס המכילים חלבונים עשויים להכיל עודף של ביומולקולות כגון DNA או פחמימות, שניתן להסירן באמצעות שיקוע חלבונים (דאוקסיכולאט–חומצה טריכלורואצטית) או החלפת בופר.
Chittapalo ו-Noomhorm (2009) דיווחו במחקרם כי תפוקת החלבון עלתה בעקבות שימוש בסוניקציה, וכי תהליך ההומוגניזציה והליזיס האולטרסוניים של רקמות יכול לשפר במידה ניכרת תהליכי מיצוי קיימים – וכך לפתוח הזדמנויות חדשות למיצוי מסחרי.
CupHorn אולטרסוני להכנה בו-זמנית ויעילה ביותר של דגימות מרובות באותם תנאים, לצורך בידוד חלבונים ופרגמנטציה של DNA.
מיצוי חלבונים מרקמות של בעלי חיים
להכנת רקמה שלמה (למשל כליה, לב, ריאה, שריר וכו'), יש לחתוך את הרקמה לפיסות קטנות מאוד בעזרת כלים נקיים, רצוי על קרח, ובמהירות האפשרית כדי למנוע פירוק על ידי פרוטאזות (למשל בופר ליזיס כגון RIPA או בופר ליזיס היפוטוני המכיל תערובת מעכבי פרוטאזות ופוספטאזות). לאחר החיתוך, הדגימה נטבלת בחנקן נוזלי להקפאה מהירה. ניתן לאחסן את הדגימה ב--80°C לשימוש מאוחר יותר או לשמור אותה על קרח להומוגניזציה מיידית. מיד לפני המיצוי האולטרסוני, מוסיפים במהירות למבחנת הדגימה בופר ליזיס קר כקרח (עם מעכבי הפרוטאזות DTT, לאופפטין ואפרוטינין) (לכל ~10 mg של רקמה מומלצים כ-~600 μL של בופר). מומלצים כ-20–60mg של רקמה לכל מבחנת דגימה.
הומוגניזציה, ליזיס ומיצוי באמצעות אולטרסאונד מתבצעים בעזרת הומוגנייזר אולטרסוני כגון UP100H או UP200Ht, המצויד בסונוטרודה בעלת קצה זעיר. משך הסוניקציה הוא 60–90 sec. במצב פעולה אולטרסוני מחזורי של 15 sec. סוניקציה ו-10 sec. מנוחה. יש לשמור את הדגימה בקרח לאורך כל התהליך.
לאחר ההומוגניזציה / המיצוי האולטרסוניים, תוצר הליזיס עובר צנטריפוגה ב-27,000g למשך כ-20 min. לאחר מכן נאסף הנוזל העליון, כדי שניתן יהיה לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבונים כגון בדיקת BCA לחלבונים של Pierce.
מיצוי חלבונים מנסיוב דם
לקבלת תערובת הומוגנית של הנסיוב ובופר הפוספט, מערבלים תחילה את הדגימה בוורטקס לפני ליזיס אולטרסוני של התאים. לצורך הליזיס האולטרסוני, הדגימה עוברת סוניקציה באמצעות הומוגנייזר אולטרסוני מעבדתי כגון UP100H במשך 8 מחזורים במשרעת של 20%, כאשר כל מחזור כולל 5 שניות פעולה ו-15 שניות הפסקה. מיצוי החלבונים מתבצע באמצעות סוניקציה במחזורים (מצב פעימות) והנחת הדגימה על קרח, כדי למנוע התחממות יתר ופירוק תרמי של הדגימה. מכיוון שהנסיוב מכיל כמות גדולה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה (כגון אלבומין, α1-אנטיטריפסין, טרנספרין, הפטוגלובולין, אימונוגלובולין G ואימונוגלובולין A), המפריעים להפרדת חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך במהלך IEF, מומלץ לסלק אותם מהנסיוב באמצעות עמודת סילוק.
מיצוי חלבונים מרקמת צמח
ניתן לפרק בקלות רקמת צמח טרייה ורכה, כגון טחב וכדומה, פשוט באמצעות הנחת חומר הדגימה הקצוץ בבופר ליזיס לצורך סוניקציה. רקמות צמח קשיחות ומעוצות, כגון זרעים, מחטי אשוח וכדומה, יש לטחון במצב יבש. חלק מהחומרים הצמחיים הקשים והמעוצים חייבים לעבור הקפאה וטחינה בחנקן נוזלי לפני מיצוי באמצעות סוניקציה. עבור תרחיפים של תרביות תאי צמח, טיפול אולטרסוני של 30 עד 150 שניות בבופר ליזיס מספיק ברוב המקרים. חומר קשיח יותר, כגון זרעי דלעת, דורש סוניקציה בעוצמה גבוהה יותר, כמתואר להלן.
פרוטוקול למיצוי אולטרסוני של אלבומין מזרעי דלעת
לצורך מיצוי אולטרסוני של החלבון אלבומין מאבקת זרעי דלעת שנטחנה דק, מוסיפים לכוס כימית מזכוכית בנפח 250mL אבקת זרעי דלעת שהשומן הוסר ממנה בכמות של 10 g ומים שעברו דה-יוניזציה בכמות של 100 mL כממס. מיצוי החלבונים מורכב משני שלבים: תחילה, הדגימה עוברת סוניקציה באמצעות מכשיר אולטרסוני מסוג גשוש UP400St (400W, 24kHz) המצויד בסונוטרודה S24d7. הכוס הכימית מזכוכית מונחת באמבט מים קרים במהלך ההומוגניזציה האולטרסונית. חיישן הטמפרטורה הניתן לחיבור והגדרות בקרת הטמפרטורה של המכשיר האולטרסוני UP400St מבטיחים שטמפרטורת הדגימה תישמר תמיד מתחת ל-30°C. בקרת הטמפרטורה המדויקת במהלך הסוניקציה מונעת דנטורציה של אלבומין. בשלב השני, המיצוי בוצע באמצעות מערבל במהירות של 200 rpm ובטמפרטורה של 30°C. לאחר מכן מעבירים את הכוס הכימית למנער מבוקר טמפרטורה. גלובולין מסולק באמצעות דיאליזה עם מים מזוקקים. לאחר סילוק הגלובולין, ניתן ליטול דגימה מתמצית החלבונים לקביעת פרופיל האלבומין, ולאחר מכן מכוונים את התמצית ל-pI=3.0 באמצעות 0.1 M HCl לצורך הקרשת האלבומין. הפאזה המוצקה מופרדת באמצעות צנטריפוגה ב-5000g וב-20°C ומומסת מחדש במים שעברו דה-יוניזציה. הקרשת האלבומין מתבצעת פעמיים כדי להגדיל את שיעור החלבון בתרכיז האלבומין.
מיצוי חלבונים בסיסי בסיוע אולטרסאונד להכנת תרכיז חלבונים מסובין אורז מראה כי הטיפול האולטרסוני מניב תפוקת חלבונים גבוהה יותר בזמן מיצוי קצר משמעותית – בהשוואה לשיטות מיצוי קונבנציונליות.
פרוטוקול להכנת דגימות לקבלת אנזים iNOS פעיל
לקבלת אנזים iNOS בעל פעילות מלאה (למשל, לסריקת תרופות), מומלץ להשתמש בפרוטוקול הבא: יש להניח את תרחיף התאים על קרח ולבצע סוניקציה באמצעות UP100H במשרעת של 10µm, במצב מחזורי הכולל 5 שניות סוניקציה ו-25 שניות מנוחה על קרח. יש לחזור על ההליך כ-3 פעמים. זמן המנוחה בין מחזורי הסוניקציה מפחית את עליית הטמפרטורה ולכן יפחית את הסיכון לדנטורציה.
המסה אולטרסונית של חלבונים
סוניקציה עשויה להאיץ את תהליך המסת החלבונים, שבדרך כלל דורש מספר שעות. כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה ופירוק ושינויים בחלבונים בתמיסות המכילות אוראה, פעימות האולטרסאונד צריכות להימשך לא יותר משניות ספורות.
המכשיר האולטרסוני UP200Ht עם קצה זעיר S26d2 בגודל 2mm לסוניקציה של דגימות קטנות.
ציוד אולטרסוני למיצוי חלבונים
Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון רחב של הומוגנייזרים אולטרסוניים לפירוק תאים, רקמות, חיידקים, מיקרואורגניזמים, שמרים ונבגים.
המכשירים האולטרסוניים המעבדתיים של Hielscher רבי עוצמה וקלים לתפעול. הם נבנו לפעולה 24/7 ותוכננו כמכשירים מעבדתיים ושולחניים עמידים ויעילים. בכל המכשירים ניתן לשלוט במדויק בתפוקת האנרגיה ובמשרעת. המגוון הרחב של אביזרים מאפשר תצורות נוספות. המכשירים האולטרסוניים הדיגיטליים, כגון VialTweeter, UP200Ht, UP200St ו-UP400St, כוללים בקרת טמפרטורה משולבת וכרטיס SD מובנה לרישום נתונים אוטומטי.
לסוניקציה עקיפה ובו-זמנית של דגימות מרובות, ללא זיהום צולב, אנו מציעים את VialTweeter או את CupHorn האולטרסוני.
הטבלה שלהלן מספקת סקירה של המכשירים האולטרסוניים שלנו להכנת דגימות, לפירוק תאים ולמיצוי. לחצו על סוג המכשיר לקבלת מידע נוסף על כל הומוגנייזר אולטרסוני. הצוות הטכני שלנו, בעל ההכשרה המקיפה ושנות הניסיון הרבות, ישמח לעזור לכם לבחור את המכשיר האולטרסוני המתאים ביותר להכנת הדגימות שלכם!
| נפח אצווה | ספיקת זרימה | מכשירים מומלצים |
|---|---|---|
| עד 10 בקבוקונים או מבחנות | n.a. | VialTweeter |
| פלטות מרובות באריות / מיקרוטיטר | n.a. | UIP400MTP |
| מבחנות / כלים מרובים | n.a. | CupHorn |
| 1 עד 500mL | 10 עד 200mL/min | UP100H |
| 10 עד 1000mL | 20 עד 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 עד 2000mL | 20 עד 400mL/min | UP400St |
בהתאם ליישום, לחומר ולנפח הדגימה שלכם, נמליץ לכם על התצורה המתאימה ביותר להכנת הדגימות שלכם. צרו איתנו קשר עוד היום!
צרו איתנו קשר! / שאלו אותנו!
המכשירים האולטרסוניים הדיגיטליים של Hielscher כוללים שליטה מרחוק באמצעות דפדפן ותיעוד נתונים אוטומטי בכרטיס SD משולב.
VialTweeter לסוניקציה עקיפה.
עובדות שכדאי לדעת
פרוטאומיקה
פרוטאומיקה היא תחום המחקר העוסק בחלבונים ובפרוטאום. חלבונים ממלאים מגוון עצום של תפקידים חיוניים באורגניזמים. הפרוטאום הוא מכלול החלבונים המבוטאים על ידי גנום, תא, רקמה או אורגניזם בזמן מסוים. הפרוטאום משתנה עם הזמן ובהתאם לדרישות מסוימות או למצבי עקה שהתא או האורגניזם חווים. ליתר דיוק, זהו מכלול החלבונים המבוטאים בסוג נתון של תא או אורגניזם, בזמן נתון ובתנאים מוגדרים. המונח הוא שילוב של המילים חלבונים וגנום. פרוטאומיקה היא חקר הפרוטאום.
חלבון
חלבונים הם ביומולקולות גדולות, המכונות מקרומולקולות – המורכבות משרשרת ארוכה אחת או יותר של שיירי חומצות אמינו. חלבונים מצויים בכל האורגניזמים, הן ממקור צמחי והן ממקור מן החי, והם חיוניים לרוב התפקודים הביולוגיים. מכיוון שחלבונים מכילים מידע ביולוגי רב, ממצים אותם למטרות אנליטיות, למשל למחקר פרוטאומי. התפקידים החשובים ביותר שממלאים חלבונים כוללים זירוז של תגובות מטבוליות, שכפול DNA, תגובה לגירויים והעברת מולקולות ממקום אחד לאחר. חלבונים נבדלים זה מזה בעיקר ברצף חומצות האמינו שלהם, המוכתב על ידי רצף הנוקלאוטידים של הגנים שלהם, ובדרך כלל מביא לקיפול החלבון למבנה תלת-ממדי מסוים הקובע את פעילותו. חלבונים הם – לצד פפטידים – אחד המרכיבים המרכזיים של המזון. לכן, פרוטאומיקה היא כלי רב עוצמה במדעי המזון למיטוב תהליכים, בטיחות המזון והערכה תזונתית.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction הוא הליך קדם-אנליטי להפרדה ולריכוז מוקדם של אנליטים. בשילוב עם טיפול אולטרסוני, ניתן להגביר את המיצוי בנקודת העננות ולהפוך את התהליך ליעיל יותר, מהיר יותר וידידותי יותר לסביבה. באמצעות טיפול אולטרסוני, מיצוי בנקודת העננות הוא שיטה יעילה יותר במידה ניכרת להכנת אנליטים. קראו עוד על מיצוי בנקודת העננות בסיוע אולטרסוני!
אלקטרופורזה בג'ל
אלקטרופורזה בג'ל היא השיטה העיקרית להפרדה ולאנליזה של מקרומולקולות כגון DNA, RNA וחלבונים, וכן של מקטעים שלהן, על סמך גודלן ומטענן. היא משמשת בכימיה קלינית להפרדת חלבונים לפי מטען ו/או גודל (אגרוז IEF, למעשה ללא תלות בגודל), ובביוכימיה, בביולוגיה מולקולרית ובפרוטאומיקה להפרדת אוכלוסייה מעורבת של מקטעי DNA ו-RNA לפי אורך, להערכת גודלם של מקטעי DNA ו-RNA או להפרדת חלבונים לפי מטען.
תרביות תאים
תרבית תאים היא תהליך גידול מבוקר שבו מגדלים תאים בתנאים מבוקרים. תנאי תרבית התאים משתנים בהתאם לסוג התא. באופן כללי, סביבת תרבית תאים כוללת כלי מתאים (למשל צלחת פטרי) עם מצע או מדיום המספק את חומרי המזון החיוניים (חומצות אמינו, פחמימות, ויטמינים, מינרלים), גורמי גדילה, הורמונים וגזים (CO2, O2), ומווסת את הסביבה הפיזיקוכימית (בופר pH, לחץ אוסמוטי, טמפרטורה). רוב התאים זקוקים למשטח או למצע מלאכותי, ואילו תרביות תאים אחרות ניתנות לגידול כשהתאים צפים בחופשיות במדיום התרבית (תרבית תרחיף, תרחיף תאים).
תרביות בהיקף גדול של שורות תאים מבעלי חיים משמשות בייצור תעשייתי של חיסונים נגיפיים ושל מוצרים אחרים המופקים בשיטות ביוטכנולוגיות. תאי גזע אנושיים מגודלים בתרבית כדי להגדיל את מספר התאים ולהביא להתמיינותם לסוגים שונים של תאים סומטיים למטרות השתלה.
דגימות רקמה
המונח רקמה מתאר רמת ביניים של ארגון תאי, שבה החומר התאי נמצא ברמת ארגון שבין תאים לבין איבר שלם. ברקמה מאוגדים תאים דומים ממקור משותף, המבצעים יחד תפקיד מסוים. המבנים המורכבים של האיברים נוצרים באמצעות קיבוץ תפקודי של רקמות מרובות.
דגימות רקמה נלקחות לצורך מחקר בביולוגיה, בהיסטולוגיה/היסטופתולוגיה, בפרזיטולוגיה, בביוכימיה ובאימונוהיסטוכימיה, וכן לצורך גידול בתרבית והפקת DNA. ניתן להבחין בין רקמה מן החי (תת-חלוקה: רקמת יונקים) לבין רקמה צמחית. רקמות מן החי מחולקות לארבעה סוגים בסיסיים: רקמת חיבור, רקמת שריר, רקמת עצב ורקמת אפיתל. רקמה צמחית מחולקת לשלוש מערכות הרקמה הבאות: האפידרמיס, רקמת היסוד ורקמת ההובלה.
ניתן להכין דגימות רקמה מחלקים של בעלי חיים או צמחים, למשל עצם, שריר, עלים וכדומה.
נוזלי גוף
דם, סרום, פלזמה, נוזל המוח והשדרה, רוק ונוזל סינוביאלי הם נוזלי גוף המהווים מקור מצוין למידע בעל חשיבות אבחונית. לכן חשובה הכנה מתוחכמת של דגימות נוזלי גוף לאנליזה. הקושי הראשון קשור לטווח הדינמי הרחב של הרכיבים המצויים בנוזלי הגוף.
קביעת ריכוז החלבון
בדיקת Bradford, בדיקת Lowry ובדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA) הן בדיקות נפוצות לקביעת ריכוז החלבונים. אלבומין מסרום בקר (BSA) הוא אחד מתקני החלבון הנפוצים ביותר בשימוש.
בופר ליזיס
יש לבחור בופר ליזיס בהתאם לחומר התאי או לרקמה (תרבית רקמה, צמח, חיידקים, פטריות וכו'), וכן בהתאם לשאלה אם התאים מאורגנים במבנה ומהו סוג המבנה. מגוון רחב של בופרי ליזיס להפקת חלבונים, ממברנות ואברונים מכילים דטרגנט אחד או יותר. הדטרגנט נבחר בדרך כלל באמצעות ניסוי וטעייה או – אם קיים פרוטוקול מתאים – בהתאם לפרוטוקול קיים להפקת חלבונים. הדטרגנט חייב להתאים למקור הרקמה ולחלבונים. באופן כללי, נבחר הדטרגנט העדין ביותר שפועל עבור הרקמה / החלבון המסוימים, כדי לשמר את התפקוד המרבי של התמצית. יתר על כן, בעת הפקת ממברנות ואברונים, דטרגנט עדין שומר על שלמות הממברנה. הדטרגנטים הנפוצים בבופרי ליזיס הם לרוב לא־יוניים או זוויטריוניים, כגון CHAPS, דאוקסיכולאט, Triton™ X-100, NP40 ו־Tween 20.
לדוגמה, ניתן להשתמש בבופר RIPA בלבד עבור רקמות כגון מוח, כבד, מעי, כליה, טחול וכו' – אולם יש לכלול מעכבי פרוטאזות ו־DTT (למשל, לצורך אלקטרופורזה בג'ל).
בופר ליזיס לרקמת שריר שלד (קר כקרח): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) גליצרול, 1 mM EDTA, 1 mM דיתיותראיטול, בתוספת תערובת מעכבי פרוטאזות ופוספטאזות
טבלת בופרים נפוצים וטווח ה־pH שלהם. באופן כללי, בופרים אלה משמשים בדרך כלל בריכוזים של 20–50 mM.
| בופר | טווח pH |
|---|---|
| חומצה ציטרית – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| נתרן ציטראט – חומצה ציטרית | 3.0 – 6.2 |
| נתרן אצטאט – חומצה אצטית | 3.6 – 5.6 |
| מלח נתרן של חומצה קקודילית – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| נתרן דו־מימן פוספט – דו־נתרן מימן פוספט | 5.8 – 8.0 |
| אימידזול – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| טריאתנולאמין הידרוכלוריד – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| טריצין – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| נתרן טטראבוראט – חומצה בורית | 7.6 – 9.2 |
| ביצין – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| גליצין – NaOH | 8.6 – 10.6 |
ברוב הבופרים, ה־pH תלוי בטמפרטורה. הדבר נכון במיוחד לגבי בופרי Tris. ה־pKa משתנה מ־8.06 ב־25°C ל־8.85 ב־0°C.
(pH ו־pKa של בופר: pH מודד את ריכוז יוני המימן בתמיסה מימית. pKa (= קבוע הדיסוציאציה של חומצה) הוא מדד קשור אך ספציפי יותר, המסייע לחזות כיצד מולקולה תתנהג בערך pH מסוים.)
TRIzol
TRIzol הוא תמיסה כימית המשמשת להפקת RNA/DNA/חלבון במהלך מיצוי בגואנידיניום תיוציאנאט–פנול–כלורופורם. השימוש במיצוי באמצעות TRIzol בסיוע אולטרסאונד מניב תפוקות גבוהות של DNA, RNA וחלבון מאותה דגימה, ובכך עולה על שיטות מיצוי אחרות.
ספרות/מקורות
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.