הכנה קולית של דגימות C. elegans

C. elegans, תולעת נמטודה, היא אורגניזם מודל נפוץ בביולוגיה. הכנת הדגימה לפני הניתוח דורשת ליזיס, מיצוי חלבונים ושומנים, כמו גם פיצול RNA, אשר יכול להתבצע באופן אמין באמצעות סוניקציה. משבשי תאים אולטראסוניים הם מכשירים אמינים, מתוחכמים וקלים לשימוש להכנה מהירה של דגימות C. elegans.

הכנה קולית של דגימות C. elegans

C. elegans הן תולעים עגולות, אשר נמצאות בשימוש נרחב במעבדות מחקר לחקר גנומיקה, ביולוגיה התפתחותית ומחלות. לגנים רבים בגנום של C. elegans יש מקבילים פונקציונליים בבני אדם. בכך, תולעת הנמטודה היא מודל שימושי ביותר למחלות אנושיות. יתרונות נוספים לשימוש הנרחב ב-C. elegans הם גידולו הקל והזול על צלחות המכילות חיידקים (למשל, E. coli), שקיפותו, הטיפול הנוח בו, כמו גם האפשרות להקפיא ולאחסן את התולעים לתקופה ארוכה יותר.
ניתוח חלבונים ושומנים הם הליכים קבועים במעבדות והכנת דגימות אולטראסוניות היא השיטה המבוססת לליזה של נמטודות C. elegans בכל שלב התפתחותי (כלומר עוברים, זחלים L1-L4, מבוגרים). מכיוון ש- C. elegans משמש גם כמערכת ביטוי חלבונים לביטוי יתר של חלבונים ממוקדים, נדרשת שיטת ליזה ומיצוי חלבונים אמינה וניתנת לשחזור, המעניקה תפוקת חלבון גבוהה. מערכות שיבוש וחילוץ תאים על-קוליים זמינות כהומוגנייזרים מסוג בדיקה וכאולטראסוניקטורים מרובי דגימות. קייטרינג הכנת דגימה נוחה וכל סוג של מספרי גודל דגימה, Hielscher Ultrasonics יש את משבש תאים קולי אידיאלי עבור הליך המעבדה שלך.

פרוטוקולים קוליים עבור C. elegans הפרעה וליזיס

הומוגניזציה אולטראסונית וליזה של C. elegans ואת מיצוי חלבון ושומנים לאחר מכן ניתן לבצע באמצעות הליכים משתנים באמצעות הומוגניזציה שונה ו lysis buffers וכו '. המשותף לכל פרוטוקולי הליזיס הוא שהדגימות חייבות להישמר ברציפות על קרח כדי למנוע פירוק חלבונים. להלן, אנו מציגים בפניכם כמה פרוטוקולי ליזה ומיצוי אולטראסוניים אמינים ומהירים להכנת דגימות C. elegans איכותיות המכילות חלבון או שומנים.

היתרונות של קולי C. elegans Lysis

• אמין
• ניתן לשחזור
• טמפרטורה מבוקרת במדויק;
• בקרת תהליכים אמינה
• שיטה עדינה
• קל ליישום
• כספת

מיצוי חלבון אולטראסוני מדגימות C. elegans

ליזה קולית ומיצוי חלבונים של תולעי C. elegans יכולים להתבצע באמצעות פרוטוקולים שונים. להלן נציג בפניכם מספר פרוטוקולי ליזה אמינים ומהירים לתוצאות מיצוי חלבון הניתנות לשחזור.

הכנה מהירה של תמצית ציטוסולית מתולעי C. elegans על ידי סוניקציה

עם הפרוטוקול הבא אתה יכול להכין C. elegans lysates בתוך פחות מ 30 דקות.
אוסף C. elegans
בחרו את תולעי C. elegans הרצויות לתוך מלח חוצץ פוספט בצינור 1.5 מ"ל (PBS) או שטפו אותן מצלחת עם PBS של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2000 סל"ד לכדור. שמור את הדגימות בכל עת על קרח.
לאחר מכן, לשטוף את התולעים פעמיים עם PBS.
לאחר מכן, לשטוף את התולעים פעמיים עם ddH₂O.
השהה מחדש את התולעים בלפחות 500ul של מאגר הומוגניזציה (HB). דגימות התולעת מוכנות כעת לליזה קולית.
לקבלת איכות גבוהה יותר של תמצית חלבון, ייתכן שתרצה להפחית את זיהום החיידקים על ידי שטיפת התולעים במשך 5 דקות כל אחת ב- PBS ומים סטריליים טהורים במיוחד (ddH₂O) או לבצע ציפה של סוכרוז. שמור את דגימות התולעת ברציפות על קרח.

פרוטוקול קולי C. elegans Lysis

• הקפד להכין את ultrasonicator מראש, כך homogenizer קולי מוכן לשימוש (בדיקה רכוב, תוכנית סוניקציה מוגדר מראש).

אם האולטרסאונד שלך מותקן בעמידה, מקם את אמבט הקרח עם צינורות הדגימה שלך מתחת לבדיקה העל-קולית והכנס את הבדיקה העל-קולית לצינור של 1.5 מ"ל.

• עבור C. elegans lysis עם UP200St או UP200Ht, אולטרסוניקציה צריכה להתבצע באמצעות microtip (למשל, 2mm probe S26d2; ראה תמונה משמאל) באמפליטודה של 40% למשך שנייה אחת עם הפסקות של 30 שניות בין לבין. 5 מחזורי סוניקציה עבור כל שנייה אחת עם הפסקות של 30 שניות הם אידיאליים עבור C. elegans lysis. אם אתה מבצע את הליזה בפעם הראשונה, אתה יכול לבדוק את התקדמות הליזה ב aliquots קטנים של הדגימה לאחר כל פעימה באמצעות מיקרוסקופ.
• ליזיס הושלמה בהצלחה כאשר התולעים משובשות. סוניקציית יתר גורמת לשבירה של גרעינים והופכת גלויה כאשר הדגימה נעשית צמיגה או קצף. כדי למנוע השפלת דגימה, השתמש בפולסים נוספים במידת הצורך. אין להגדיל את הזמן של כל מחזור פולס קולי כדי לקבל תמציות חלבון באיכות גבוהה.
• נקה את התא ליזט על ידי צנטריפוגה של התולעים שעברו ליזה אולטרה-סאונד ב-14,000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
• לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור טרי ולהתכונן immunoprecipitation או בדיקות אחרות.

הערה עבור מאגר הומוגניזציה: הכן את מאגר ההומוגניזציה עבור פרוטוקול הליזה העל-קולית לעיל באופן הבא:

ליזה בעלת תפוקה גבוהה של C. elegans בלוחות 96 בארות באמצעות UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (נמטודות בוגרות)
UIP400MTP 80% משרעת, 20 מחזורים (כל מחזור סוניקציה: 30 שניות הפעלה, 30 שניות כיבוי)
חיץ ליזיס:

• אפשרות 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• אפשרות 2) עבור Co-immunoprecipitation (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5% NP-40 (קוקטייל מעכב פרוטאינאז מלא)

פיצול DNA בתפוקה גבוהה
C. elegans (נמטודות בוגרות) DNA 200-300bp: סוניק צלחת UIP400MTP – סט 80% משרעת, 30פולסים – כל 30 שניות מופעל, 30 שניות כבוי

UIP400MTP Plate Sonicator להכנת דגימות בתפוקה גבוהה יוצר באופן אחיד דגימות בלוחות מרובי בארות, מיקרוטיטרים ולוחות 96 בארות

ליזה קולית של C. elegans עבור בדיקות טיהור זיקה כמותית

עוברי C. elegans (∼2 מיליון לכל שכפול) נקטפו בטריפליקט ביולוגי על ידי הלבנה של הרמפרודיטים גרבידיים צעירים וסוניקציה על קרח (מחזור: 0.5 שניות, משרעת: 40-45%, 5 פעימות למפגש, 5 מפגשים, מרווח בין מפגשים: 30 שניות; מעבד קולי UP200S עם micro-tip S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) במאגר ליזיס (נפח כולל: ∼600 μl; 50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ DTT, 10% גליצרול, תערובת מעכבי פרוטאזות, 0.1% תחליף Nonidet P-40). לאחר סוניקציה, תחליף Nonidet P-40 נוסף עד 1% והליזטים הודגרו עם סיבוב ראש מעל הזנב ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן נלקח ליזט מנוקה מבלי להפריע לשכבת השומנים העליונה ופוצל לשניים לחרוזי אגרוז אנטי-GFP או לחרוזי הבקרה החסומים (40-50 מיקרוליטר). לאחר סיבוב ראש מעל הזנב בטמפרטורה של 4°C במשך 60-90 דקות, החרוזים נשטפו פעם אחת עם חיץ ליזיס שהכיל 0.1% תחליף Nonidet P-40, ולאחר מכן פעמיים של שטיפה בחיץ I (25 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) או בחיץ II (1 מ"מ Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 מ"מ MgCl2) או שניהם. עבור משיכות GFP:MBK-2, שני ניסויים נפרדים בוצעו בתנאי כביסה שונים. החלבונים הודלקו על ידי טלטול אורביטלי ב-50 μl של 6 m urea / 2 M thiourea בטמפרטורת החדר. בניסויי MBK-1::GFP, חלבונים נמהלו פעמיים על ידי ניעור 50μl של 8 מטר גואנידיניום כלוריד ב-90°C, ולאחר מכן משקעים אתנוליים. דגימות חלבון אלוטות עוכלו בתמיסה.
(ראה: חן ואחרים, 2016)

הומוגניזציה של תולעת קולית וליזיס

עבור C.elegans lysis והליך מיצוי חלבונים, 30,000 נמוטודות של השלב הרלוונטי נאספו לכל דגימה ונשטפו בבסיס S קר כקרח, מרוכז על ידי צנטריפוגה ב 1500 סל"ד במשך 2 דקות, נשטף שש פעמים עם S-basal קר כקרח כדי להסיר שאריות חיידקים, ולאחר מכן מאוחסן על קרח עד מוכן לשימוש. לצורך מיצוי חלבונים, תולעים בוגרות גרבידיות הורשו ליצור גלולה קומפקטית לאחר שטיפת ה-S בזאלית האחרונה. כדורי התולעים הושעו מחדש ב-1 מ"ל של חיץ מיצוי קר כקרח [20 mM אשלגן פוספט, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, מעכבי פרוטאז (Sigma P2714)] ועובדו מיד.
∼30,000 תולעים בוגרות (המקבילות ל∼100 מ"ג משקל רטוב), עברו סוניקציה על קרח באמצעות אולטרה-סאונד מסוג בדיקה (למשל UP50H עם microtip MS2) באמפליטודה של 40% למשך 10 מחזורים של 3 שניות על, 30 שניות כבוי, ב-1 מ"ל של חיץ מיצוי קר כקרח. (ראה: Baskharan et al. 2012)

מיצוי שומנים קולי מ C. elegans

בליפידומיה, ענף של מטבולומיקה, מאופיין ומנותח משלים השומנים של מערכות ביולוגיות. C. elegans נמצאים בשימוש נרחב בליפידומיה כדי לחקור את האינטראקציה של שומנים מטבוליים ואת השפעתם על הבריאות ותוחלת החיים.
ליזה קולית ומיצוי משמשים לשחרור שומנים כגון ספינגולפידים מעוברי C. elegans, זחלים ותולעים בוגרות. Ultrasonication משמש להכנת homogenates תולעת ולאחר מכן כדי לחלץ את השומנים מן הדגימה.
פרוטוקול למיצוי שומנים אולטראסוניים מ- C. elegans
הפשירו את כדורי C. elegans על קרח והשהו מחדש עם 0.5 מ"ל אולטרה מים. 
סוניק את דגימות C. elegans במבחנות של 1.5 מ"ל, תוך שמירה רציפה על קרח.
סוניקציה יכולה להתבצע באמצעות בדיקה ultrasonicstor כגון UP200Htיחידת הכנת הדגימה האולטרסונית, VialTweeter (סוניקציה סימולטנית של 10 דגימות) או UIP400MTP (עבור סוניקציה של לוחות מרובי באר כגון לוחות 96 באר). עבור ליזה קולית עם UP200Ht השתמש micro-tip S26d2. הגדר מראש את מצב המחזור העל-קולי בתפריט הדיגיטלי. הגדר משרעת ל- 10% ומצב מחזור סוניקה של 2 שניות פולסים של 20 מחזורים עם הפסקה של 30 שניות בין כל פרץ פעימה על-קולי.
מעבירים את הסופרנאטנטים לצינורות זכוכית עם מכסה בורג. 
בצע מיצוי Folch על ידי הוספת 1 מ"ל ultrawater לכל צינור זכוכית, ולאחר מכן הוספת 6 מ"ל של תערובת כלורופורם/מתנול (יחס = 2: 1) לכל צינור זכוכית.
מערבלים כל צינור זכוכית למשך 30 שניות למשך 4 פעמים. 
צנטריפוגה את הצינורות במהירות של 1,258 x גרם למשך 15 דקות (Eppendorf, 5810 R) כדי לשפר עוד יותר את הפרדת הפאזה. 
מעבירים את החלק ההידרופובי התחתון לצינור זכוכית נקי על ידי פיפטת פסטר זכוכית. 
יבש את החלק ההידרופובי התחתון מתחת לזרימת חנקן במאייד חנקן. 
יש לאחסן את הגלולה המיובשת במקפיא בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

הכנה קולית של תולעת lysates

ליזט תולעת: תולעי שלב L4 נקטפו ונשטפו שלוש פעמים עם חיץ M9 (42.26 mM Na₂קופת חולים₄, 22.04 מ"מ KH₂פו₄, 85.56 mM NaCl ו- 0.87 mM MgSO₄) על מנת להסיר את כל החיידקים. לאחר הסרת ככל האפשר של חיץ M9, התולעים הושעו מחדש במאגר ליזיס: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM פוספט β-גליצרול, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM נתרן פלואוריד, 1 mM נתרן אורתוונדאט, 5 mM נתרן pyrophosphate, 0.2 mM פנילמתאן sulfonylfluoride ומעכב פרוטאז. התולעים הוקפאו בחנקן נוזלי והופשרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש פעמים, ואז התולעים הופעלו על קרח יבש באמצעות יחידת VialTweeter על-קולית להכנה סימולטנית של 10 צינורות דגימה. הסוניקציה בוצעה באמפליטודה של 50% ב-10 מחזורים של 2 שניות עם הפסקה של 30 שניות בין התפרצויות הסוניקציה. לאחר מכן, הדגימות היו צנטריפוגות ב 12000 סל"ד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הסופרנאטנט נאסף ואוחסן בטמפרטורה של מינוס 70 מעלות צלזיוס. אליקוט שימש לכימות חלבונים על ידי בדיקת ברדפורד.
קביעת סך גלוטתיון, GSH ו-GSSG: לצורך כימות גלוטתיון, ליזטים וקביעה נעשו באותו יום. זחלי L4 שניזונו מגלוקוז ונשטפו עם חיץ M9 שלוש פעמים. לאחר הסרת חיץ M9 ככל האפשר, התולעים הושעו מחדש בחומצה מטפוספורית קרה כקרח (5% w/v), ואז התולעים הושעו בקרח עם VialTweeter על-קולי באמפליטודה של 50% בעשרה מחזורי סוניקציה של 2 שניות עם הפסקה של 30 שניות בין כל מחזור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 12000 סל"ד ב 4 ̊C במשך 15 דקות.
(ראה: Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Sample Prep לפני Immunoprecipitation ו-Western Blotting

בקצרה, עבור תמציות עובריות, זחלי C. elegans L1 גודלו בתרביות S-medium נוזליות בקנה מידה גדול עד לבגרות. העוברים נאספו בשיטת האקונומיקה הסטנדרטית והושעו בחיץ ליזה (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% גליצרול, 0.05% NP-40, קוקטייל מעכב פרוטאז 1. וקוקטייל מעכב פוספטאז 1. ו-II), הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי ועברו שיבוש תאים על-קוליים באמצעות אולטרסאונד עם microtip כגון UP200Ht עם S26d2 עבור 10 פולסים מעל 10 שניות באמפליטודה של 30%. אם מספר גדול יותר של דגימות חייב להיות מוכן, קולי VialTweeter או מומלץ UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator עבור צלחות היטב. לאחר סוניקציה, התמציות נוקו מראש על ידי צנטריפוגה ב-30,000 גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. התמצית שסולקה מראש (300 מיקרוגרם של חלבון כולל) הודגרה עם 40μ. . . נוגדן מטוהר זיקה אנטי-CDC-25.1 (מחקר זה) צולב לחלבון A-אגרוז, או כביקורת, כמות דומה של אימונוגלובולין ארנב (Ig)G צולב לחלבון A-agarose שימש בנפח כולל של 200μl של חיץ ליזה המכיל 1% NP-40, הכללתו הפחיתה קשירה לא ספציפית של חלבונים למטריצה. הדגימות סובבו במשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, החרוזים נשטפו שלוש פעמים עם חיץ ליזיס, ונמהלו ב-30μl גליצין/HCl ו-200 mM NaCl, pH 2.2. לאחר משקעים חיסוניים, דוללו הפולטים ב-30μ. . . חיץ דגימת SDS, שחומם ל-95°C למשך 4 דקות, ובדרך כלל 3% מכלל הקולט ו-30% עבור האלוטים הוחלו על SDS-PAGE ולאחר מכן הוחלו נוגדנים מערביים עם anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3��� (1:500) או anti-β. כאשר תמציות לא היו חשופות למשקעים חיסוניים, אותה כמות של חלבון כוללת שהופקה מתמציות אלה הושעתה מחדש במאגר דגימות SDS, חוממה ל-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן יושמה ישירות על SDS-PAGE ונותחה על ידי כתמים מערביים. (ראה: Segref et al. 2020)

ליזה קולית תחת בקרת טמפרטורה Prescise

בקרת הטמפרטורה המדויקת והאמינה חיונית בעת טיפול בדגימות ביולוגיות. טמפרטורות גבוהות גורמות לפירוק חלבונים המושרה תרמית בדגימות.
כמו כל טכניקות הכנת הדגימות המכניות, סוניקציה יוצרת חום. עם זאת, הטמפרטורה של הדגימות יכולה להיות נשלטת היטב בעת שימוש VialTweeter. אנו מציגים בפניכם אפשרויות שונות לניטור ובקרה על טמפרטורת הדגימות שלכם תוך הכנתם עם VialTweeter ו- VialPress לניתוח.

1. ניטור טמפרטורת הדגימה: המעבד העל-קולי UP200St, המניע את ה- VialTweeter, מצויד בתוכנה חכמה ובחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור. חבר את חיישן הטמפרטורה ל- UP200St והכנס את קצה חיישן הטמפרטורה לאחד מצינורות הדגימה. באמצעות צג מגע צבעוני דיגיטלי, תוכל להגדיר בתפריט של UP200St טווח טמפרטורות ספציפי עבור הסוניקציה לדוגמה שלך. האולטרסאונד יעצור אוטומטית כאשר תגיע לטמפרטורה המקסימלית וישהה עד שטמפרטורת הדגימה תרד לערך הנמוך יותר של הטמפרטורה שנקבעה ∆. ואז הסוניקציה מתחילה שוב באופן אוטומטי. תכונה חכמה זו מונעת התפרקות הנגרמת על ידי חום.
2. ניתן לקרר מראש את בלוק VialTweeter. הכניסו את בלוק VialTweeter (רק הסונוטרוד ללא מתמר!) למקרר או למקפיא כדי לקרר מראש את בלוק הטיטניום עוזר לדחות את עליית הטמפרטורה בדגימה. במידת האפשר, ניתן גם לקרר מראש את הדגימה עצמה.
3. השתמשו בקרח יבש כדי להתקרר במהלך סוניקציה. השתמש במגש רדוד מלא בקרח יבש והנח את ה- VialTweeter על הקרח היבש כך שהחום יוכל להתפזר במהירות.

מצא את משבש התאים העל-קולי האופטימלי עבור יישום הליזיס שלך

Hielscher Ultrasonics היא יצרנית מנוסה מזה זמן רב של משבשי תאים קוליים בעלי ביצועים גבוהים והומוגנייזרים למעבדות, מערכות בקנה מידה עליון ותעשייתי. גודל תרבית תאי החיידק שלך, מטרת המחקר או הייצור שלך ונפח התא לעיבוד בשעה או ביום הם גורמים חיוניים כדי למצוא את משבש התאים העל-קולי הנכון עבור היישום שלך.
Hielscher Ultrasonics מציעה פתרונות שונים עבור סוניקציה בו זמנית של דגימות מרובות (עד 10 בקבוקונים), כמו גם דגימות המוני (כלומר, לוחות microtiter / 96-well צלחות), ultrasonicator מעבדה קלאסי מסוג בדיקה עם רמות כוח שונות מ 50 עד 400 וואט למעבדים קוליים תעשייתיים לחלוטין עם עד 16,000watts ליחידה עבור שיבוש תאים מסחריים מיצוי חלבון בייצור גדול. כל Hielscher ultrasonicators בנויים עבור המבצע 24/7/365 תחת עומס מלא. חוסן ואמינות הם תכונות הליבה של המכשירים האולטרסוניים שלנו.
כל ההומוגנייזרים האולטרה-סוניים הדיגיטליים מצוידים בתוכנה חכמה, תצוגת מגע צבעונית ופרוטוקול נתונים אוטומטי, שהופכים את המכשיר העל-קולי לכלי עבודה נוח במעבדות ובמתקני ייצור.
ספר לנו, איזה סוג של תאים, איזה נפח, באיזו תדירות ועם איזו מטרה יש לך לעבד את הדגימות הביולוגיות שלך. אנו נמליץ לך על משבש התאים העל-קולי המתאים ביותר לדרישות התהליך שלך.

הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה לגבי יכולת העיבוד המשוערת של המערכות העל-קוליות שלנו, החל מהומוגנייזרים ידניים קומפקטיים ואולטרסוניקטורים MultiSample ועד מעבדים על-קוליים תעשייתיים ליישומים מסחריים: