ליזיס אולטרסוני לתספיג מערבי

• תספיג מערבי הוא הליך אנליטי לזיהוי חלבונים ספציפיים בדגימה של הומוגנט רקמה או תמצית תאים.
• לצורך ביצוע תספיג מערבי או מדידת פעילות אנזימטית, בדיקות רבות דורשות גישה לחומרים (למשל חלבונים, DNA ומקטעים תת־תאיים) הכלואים בתא.
• סוניקציה היא שיטה אמינה וקלה לתפעול לפירוק תאים ולליזיס מבוקרים.

פירוק תאים אולטרסוני

מיצוי חלבונים מרקמות ומתאים בתרבית הוא השלב הראשון בטכניקות ביולוגיות, ביוכימיות ואנליטיות רבות (PAGE, תספיג מערבי, ELISA, ספקטרומטריית מסות וכו') או בטיהור חלבונים. כדי להשיג תפוקת חלבון גבוהה, יש לפרק את החומר התאי ואת הרקמה או לבצע בהם ליזיס ביעילות. בין שמדובר בתא צמחי ובין שברקמה מן החי, סוניקציה היא השיטה להכנת ליזט התאים שלכם בקלות ובמהירות.

יתרונות הסוניקציה

• מהירה ויעילה
• תפעול קל
• תפוקת חלבון גבוהה
• ניתנת לשחזור/ לחזרה
• מבוקרת במדויק
• ניתנת להגדלה בקנה מידה

פרוטוקול אימונופרסיפיטציה לתספיג אימונולוגי מערבי

א. ריאגנטים

להכנת התמיסות, השתמשו במים מטוהרים כגון Milli-Q.

• תמיסת מלח מבופרת בפוספט (PBS) בריכוז 1X
• בופר לליזיס תאים בריכוז 1X: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM נתרן פירופוספט, 1 mM β-גליצרופוספט, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml לאופפטין
  חשוב: הוסיפו 1 mM PMSF מיד לפני השימוש.
• 15 μl חלבון A+15 μl חלבון G מספיקים לביצוע IP, אך הדבר עשוי להיות תלוי בנוגדן הראשוני שלכם ובנפח הדגימה. ניתן גם להשתמש באגרוז עם חלבון A/ G המעורבבים מראש (למשל חלבון A ללכידת IgG של ארנב וחלבון G ללכידת IgG של עכבר)
• בופר דגימה SDS בריכוז 3X: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 בטמפרטורה של 25°C), 6% w/v SDS, 30% גליצרול, 150 mM DTT, 0.03% w/v כחול ברומופנול

ב. הכנת ליזטים של תאים

• אספו את התאים. לאיסוף תאים בתנאים שאינם גורמים לדנטורציה, הסירו את מצע הגידול ושטפו את התאים פעם אחת ב־PBS קר כקרח.
• הסירו את ה־PBS והוסיפו לכל צלחת (10 cm) בופר לליזיס תאים בריכוז 1X, קר כקרח, בנפח 0.5 ml, והדגירו את הצלחות על קרח למשך 5 דקות.
• גרדו את התאים מהצלחות והעבירו למבחנות מיקרוצנטריפוגה. שמרו על קרח.
• בצעו סוניקציה פעמיים למשך 10 שניות בכל פעם בבופר אימונופרסיפיטציה קר כקרח (בופר IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 ותערובת מעכבי הפרוטאזות). לסוניקציה, VialTweeter או מכשיר אולטרסוני מסוג גשוש כגון UP100H או UP200Ht הם המתאימים ביותר.
• צנטריפגו את הליזטים ב־15,000 g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C.
• העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה. (במידת הצורך, ניתן לאחסן את הליזט ב־–80°C.)
• הוסיפו את הנוגדן הראשוני לנוזל העליון. הדגירו את הנוזל העליון עם הנוגדן הראשוני למשך 1 h בטמפרטורה של 4°C תוך ערבול קל. בדרך כלל מוסיפים נוגדן ראשוני בריכוז הגבוה פי 10 מהריכוז המשמש לתספיג מערבי. (ניתן להתחיל ב־1μg לכל 100μL.)
• לאחר מכן המשיכו להדגיר את הנוזל העליון עם תערובת של כמויות שוות של חלבון A-אגרוז (Invitrogen) וחלבון G-אגרוז למשך 1 h נוספת.
• שטפו את משקעי האגרוז שלוש פעמים בבופר IP. לאחר מכן, מצו את החלבונים הקשורים באמצעות בופר ההטענה של SDS-PAGE על ידי חימום ב־95°C למשך 5 דקות.

ג. אימונופרסיפיטציה

• קחו 200 μl ליזט תאים והוסיפו נוגדן ראשוני. הדגירו תוך נדנוד עדין למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
• הוסיפו חרוזי אגרוז עם חלבון A או G (20 μl של תרחיף חרוזים בריכוז 50%). הדגירו תוך נדנוד עדין למשך 1–3 שעות בטמפרטורה של 4°C.
• צנטריפגו במיקרוצנטריפוגה למשך 30 שניות בטמפרטורה של 4°C. שטפו את המשקע חמש פעמים ב־500 µl בופר לליזיס תאים בריכוז 1X. שמרו על קרח במהלך השטיפות.
• הרחיפו מחדש את המשקע ב־20 μl בופר דגימה SDS בריכוז 3X. ערבבו בוורטקס, ולאחר מכן צנטריפגו במיקרוצנטריפוגה למשך 30 שניות.
• חממו את הדגימה ל־95–100°C למשך 2–5 דקות וצנטריפגו במיקרוצנטריפוגה למשך 1 דקה ב־14,000 X g.
• הטעינו את הדגימה (15–30 μl) על ג'ל SDS-PAGE (12–15%).
• נתחו את הדגימה באמצעות תספיג מערבי.

אנליזת תספיג מערבי באמצעות הסוניקטור UP50H

הפרוטוקול הבא, שבו נעשה שימוש בסוניקטור מסוג גשוש UP50H, שימש במחקר של Kriebisch ועמיתיו (2011):
כלל החלבונים בודדו מתאי MC3T3-E1 שטופלו ב־1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) או בנשא. התאים עברו ליזיס באמצעות בופר המכיל 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ו־0.5% נתרן דאוקסיכולאט (Merck). ליזט התאים עבר סוניקציה במשך 2 × 10 s בהגדרת מחזור 1 ובמשרעת 80 באמצעות המעבד האולטרסוני UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, גרמניה). לאחר מכן החומר צונטריפג למשך 10 min במהירות של 14,000 rpm והנוזל העליון שימש לתספיג מערבי. עשרים וחמישה μg של חלבון הורתחו בבופר דגימה ובחומר מחזר (Invitrogen), ולאחר מכן הופרדו באמצעות SDS-PAGE תוך שימוש בג'לי פוליאקרילאמיד בריכוז 4–12% (Invitrogen) והועברו לממברנת ניטרוצלולוז (GE health care). הממברנה נחסמה למשך 1 h באמצעות TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) המכיל 1% קזאין (Sigma-Aldrich) ו־1% Tris (1 M). לאחר החסימה, הממברנה הודגרה תוך ערבול קל למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדן הראשוני (נוגדן ארנב נגד CBS אנושי בדילול 1/500, שפותח במעבדתו של פרופ' R. Banerjee, אן ארבור, מישיגן, ארה״ב). הדגרה עם נוגדן שניוני מצומד לפרוקסידאז חזרת (HPR) (Dako) בוצעה למשך 1 h בטמפרטורת החדר. כל התספיגים פותחו באמצעות כימילומינסנציה מוגברת (Perkin Elmer).
 

לחצו כאן לקריאה נוספת על שיטות עבודה מיטביות לליזיס ולמיצוי אולטרסוניים של תאים, הכנת ליזטים והמלצות לשיפור התהליך!
 
הטבלה שלהלן מציגה הערכה של כושר העיבוד המשוער של המכשירים האולטרסוניים המעבדתיים שלנו:

ספרות / מקורות

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.