Ultrasonic תמוגה עבור המערבי סופג

  • ה"ווסטרן המערבי הוא בנוהל אנליטי לצורך זיהוי של חלבונים ספציפיים במדגם של homogenate רקמות או תמצית התא.
  • כדי להפעיל כתם מערבי או למדוד פעילות אנזים, מבחנים רבים דורשים גישה לחומרים (למשל, חלבונים, DNA, שברי התת-תאי) בפח התא.
  • Sonication היא שיטה אמינה וקלה ידית עבור הפרעת תא מבוקר תמס.

שיבוש תא קולי

מיצוי חלבון מן רקמות תאים בתרבית הוא הצעד הראשון עבור רבים בשיטות ביולוגיות, ביוכימיים אנליטי (עמוד, סופג מערבי, ELISA, ספקטרומטריית מסה, וכו ') או טיהור חלבונים. כדי להשיג תשואה גבוהה חלבון, חומר התאים והרקמות חייבים להיות מופרות ביעילות / lysed. אם תא צמח או רקמה מן החי, sonication היא השיטה להכין lysate התא שלך קל ומהיר.

יתרונות Sonication

  • מָהִיר & יָעִיל
  • ניתוח קל
  • תשואת חלבון גבוהה
  • לשחזור / דיר
  • לשלוט באופן מדויק
  • להרחבה

פרוטוקול Immunoprecipitation עבור Immunoblotting המערבי

ריאגנטים א

להכנת הפתרונות, להשתמש במים מטוהרים כגון-Q מילי.

  • 1X בופר פוספט (PBS)
  • 1X תא הצפת תמוגה: 20 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 pyrophosphate מ"מ נתרן, 1 מ"מ β-glycerophosphate, 1 מ"מ Na3VO4, 1 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin
    חשוב: להוסיף 1 מ"מ PMSF מיד לפני השימוש.
  • 15 החלבון μl A + 15 μl חלבון G מספיק עבור IP, אבל היא יכולה להיות תלויה בנפח הנוגדן ו מדגם הראשי שלך. אתה יכול גם להשתמש חלבון טרום מעורבת / G agarose (חלבון למשל בגין ארנב IgG לנתץ חלבון G עבור העכבר IgG לנתץ)
  • חיץ מדגם 3X SDS: 187.5 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8 ב 25 מעלות צלזיוס), 6% w / v SDS, 30% גליצרול, 150 מ"מ DTT, 0.03% w / v bromophenol כחול

ב הכנת Cell Lysates

  • קציר התאים. כדי לקצור תאים בתנאי nondenaturing, להסיר תקשורת לשטוף תאי פעם עם PBS קר כקרח.
  • הסר PBS ולהוסיף 0.5 מיליליטר קר כקרח תמוגה תא 1X על כל צלחת (10 סנטימטרים) ו דגירת הצלחות על קרח במשך 5 דקות.
  • תאים לגרד את הצלחות להעביר צינורות microcentrifuge. שמור על הקרח.
  • Sonicate פעמיים עבור 10 שניות במאגר immunoprecipitation קר כקרח (חיץ IP: 50 מ"מ טריס-HCl [pH 7.4], 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 0.1% NP-40 ו תמהיל מעכב פרוטאז). עבור sonication, VialTweeter או ultrasonicator בדיקה כגון מעלהay אוֹ Uf200 ः t הם המתאימים ביותר.
  • צנטריפוגה lysates ב 15,000 g עבור 10 דקות ב 4 °.
  • מעבירים את supernatant לצינור חדש. (במידת הצורך, ניתן לאחסן lysate ב -80 ° C.)
  • מוסיפים את הנוגדן הראשוני כדי supernatant. את supernatant עם הנוגדן הראשוני מודגרות למשך 1 שעות ב 4 ° C תחת תסיסת אור. נוגדן ראשוני בדרך כלל מתווסף בסכום 10x מ מרוכז יותר משמש מערבי סופג. (אתה יכול להתחיל עם 1μg לכל 100μL.)
  • Supernatant הוא וטופח אז עוד עם התערובת של כמויות שווות של agarose-חלבון (Invitrogen) ו agarose G חלבון עבור 1 אחר h.
  • לשטוף את כדורי agarose שלוש פעמים עם חיץ IP. לאחר מכן, לחלץ את החלבונים הכבולים עם חיץ טעינת SDS-PAGE ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

ג Immunoprecipitation

  • קח 200 lysate התא μl ולהוסיף נוגדן ראשוני. דגירה עם הנדנדה עדינה הלילה ב 4 ° C..
  • הוספה או חלבון או חרוזי agarose G (20 μl של תרחיף חרוז 50%). דגירה עם נדנדה עדין במשך 1-3 שעות 4 מעלות צלזיוס.
  • Microcentrifuge עבור 30 שניות ב 4 ° C.. ולשטוף עם גלולה חמש פעמים עם 500 μl של חיץ תמוגה התא 1X. שמור על הקרח במהלך שוטף.
  • Resuspend גלולה עם 20 חיץ מדגם μl 3X SDS. וורטקס, אז Microcentrifuge עבור 30 שניות.
  • מחממים המדגם ל- C ° 95-100 במשך 2-5 דקות microcentrifuge דקה 1 על g 14,000 X.
  • טען את המדגם (15-30 μl) על ג'ל SDS-PAGE (12-15%).
  • לנתח מדגם ידי מערבי סופג.

צור קשר / בקש מידע נוסף

דבר איתנו על דרישות העיבוד שלך. נמליץ פרמטרי ההתקנה ועיבוד המתאימים ביותר עבור הפרויקט שלכם.





הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.


נוספים פרוטוקולי Sonication

ניתוח כתם המערבי עם ultrasonicator UP50H

פרוטוקול בעקבות נעשה שימוש במחקר ואח Kriebisch. (2011):
חלבון סה"כ היה מבודד מתאי MC3T3-E1 שטופלו 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) או ברכב. התאים היו lysed עם מאגר המכיל 50 מ"מ טריס HCl, pH 8 (סיגמא אולדריץ); 150 מ"מ NaCl (פישר סיינטיפיק); 0.1% dodecyl נתרן גופרתי (SDS) (פישר סיינטיפיק); 1% IGEPAL CA-630 (סיגמא אולדריץ) ו deoxycholate נתרן 0.5% (Merck). Lysate התא היה sonicated עבור 2 × 10 שניות על מחזור 1 ו משרעת 80 עם מעבד אולטרסאונד UP50H (Hielscher, אולטרסאונד טכנולוגיה, Teltow, גרמניה). לאחר מכן החומר היה centrifuged במשך 10 דקות בסל"ד 14,000 ו supernatant שימש המערבי סופג. עשרים וחמישה מיקרוגרם של חלבון היה מבושל חיץ מדגם והפחתת הסוכן (Invitrogen) ולאחר מכן מופרדים על ידי SDS-PAGE באמצעות ג'ל polyacrylamide 4-12% (Invitrogen) והועברו קרום nitrocellulose (GE הבריאות). הממברנה נחסמה במשך שעה אחת עם TBS (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6, 150 מ"מ NaCl) המכיל 1% casein (Sigma-Aldrich) ו 1% Tris (1 M). לאחר החסימה, הממברנה הודגרה עם תסיסה קלה בין לילה ב- 4 ° C עם הנוגדן העיקרי (ארנב אנטי-אנושי CBS 1/500, שפותח במעבדה של פרופ 'ר בנרג'י, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב). הדגירה עם חזרת peroxidase (HPR) - נוגדנים משני conjugated (Dako) בוצעה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. כל הכתמים פותחו על ידי chemiluminescence משופרת (פרקיין אלמר).

ספרות / הפניות



אודות מערבי סופג

כתמים הם נהלים אנליטיים שבו DNA, RNA וחלבונים מועברים על גבי נושאת כדי שיוכלו להפריד.
ה"ווסטרן הדרום משמש לצורך זיהוי של דנ"א, הכתם הצפון עבור RNA ואת הכתם המערבי עבור חלבונים.
המערבי סופג נקרא גם immunoblotting חלבון כי נוגדן משמש לזיהוי אנטיגן שלה במיוחד. המערבי סופג הוא אחת השיטות לניתוח החשובות ביותר לזהות חלבונים ספציפיים במדגם. ב הכתם המערבי, החלבונים הם משותקים על ממברנות לזהות אותם באמצעות נוגדנים חד שבטיים או polyclonal.
על ידי SDS-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) חלבונים ילידים מופרדים על ידי מבנה 3-D או חלבונים מפוגל על ​​ידי אורך הפוליפפטיד. החלבונים מועברים לאחר מכן לקרום (בדרך כלל ניטרוצלולוזה או PVDF), שם הם מוכתמים בנוגדנים ספציפיים לחלבון המטרה. בשלב ג'ל אלקטרופורזה נכלל ניתוח כתם המערבי כדי לפתור את הבעיה של תגובה צולבת של נוגדנים.
לאחר מכן, חלבונים מופרדים הם על גבי מטריצה ​​(בעיקר על ניטרוסלולוזה או PVDF קרום), שם הם מוכתמים נוגדנים. הנוגדנים מתפקדים כחיישן ונבחרים במיוחד לחלבון המטרה. ניתוח המיקום והיעילות של התגובה הספציפית חושף את פרטי הביטוי של חלבוני המטרה במדגם הנתון. המערבי סופג יכול לזהות חלבון היעד שהוא נמוך כמו 1ng עקב רזולוציה גבוהה של ג 'ל אלקטרופורזה סגוליות חזקה ורגישות גבוהה של immunoassay. שיטת כתם המערבי משמש ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, immunogenetics ושאר תחומי המחקר המולקולרי.
טכניקות נלוות אחרות כוללות ניתוח כתם נקודה, אימונוהיסטוכימיה ו immunocytochemistry שבו נוגדנים המשמשים לאיתור חלבונים ברקמות ותאים ידי immunostaining, ו assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter עבור הכנת מדגם קולית

תיצור איתנו קשר! / שאל אותנו!





הינכם מתבקשים לשים לב מדיניות פרטיות.


Sonication היא צעד חשוב במהלך הכנת המדגם

UP200St עם-קצה מיקרו עבור sonication מדגם