ליזה קולית עבור Blotting המערבי
- הכתם המערבי הוא הליך אנליטי לזיהוי חלבונים ספציפיים בדגימה של הומוגנט רקמות או תמצית תאים.
- כדי להפעיל כתם מערבי או למדוד את פעילות האנזים, בדיקות רבות דורשות גישה לחומרים (למשל חלבונים, דנ"א, מקטעים תת-תאיים) הכלואים בתא.
- סוניקציה היא שיטה אמינה וקלה לטיפול להפרעה מבוקרת בתאים וליזה.
הפרעה בתאים על-קוליים
מיצוי חלבונים מרקמות ותאים בתרבית הוא הצעד הראשון עבור טכניקות ביולוגיות, ביוכימיות ואנליטיות רבות (PAGE, Western blotting, ELISA, ספקטרומטריית מסות וכו ') או טיהור חלבונים. כדי להשיג תפוקת חלבון גבוהה, יש לשבש / ליזה ביעילות את חומר התא והרקמה. בין אם מדובר ברקמת תא צמח או רקמת בעלי חיים, סוניקציה היא השיטה להכין את התא שלך ליזט בקלות ובמהירות.
יתרונות הסוניקציה
- מהר & יעיל
- תפעול קל
- תפוקת חלבון גבוהה
- ניתן לשכפול / ניתן לחזרה
- נשלט במדויק
- מדרגי

VialTweeter sonicator להכנת דגימות אולטראסוניות כגון הפרעה בתאים ובידוד חלבונים
פרוטוקול משקעים חיסוניים עבור אימונובלוטינג מערבי
א. ריאגנטים
להכנת התמיסות, השתמש במים מטוהרים כגון Milli-Q.
- 1X מלח חוצץ פוספט (PBS)
- 1X מאגר ליזיס תאים: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM נתרן pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 1 מיקרוגרם / מ"ל Leupeptin
חשוב: יש להוסיף PMSF של 1 mM מיד לפני השימוש. - 15 μl חלבון A + 15 μl חלבון G מספיק עבור IP, אבל זה עשוי להיות תלוי בנוגדן הראשי שלך ואת נפח הדגימה. ניתן גם להשתמש בחלבון A/G אגרוז מעורבב מראש (למשל חלבון A למשיכת IgG של ארנב כלפי מטה וחלבון G למשיכת IgG של עכבר כלפי מטה)
- מאגר דגימה של 3X SDS: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ב-25°C), 6% עם SDS, 30% גליצרול, 150 mM DTT, 0.03% עם ברומופנול כחול
ב. הכנת תאי ליזטים
- קצרו את התאים. כדי לקצור תאים בתנאים שאינם דנטורציה, הסר מדיה ושטוף תאים פעם אחת עם PBS קר כקרח.
- מוציאים PBS ומוסיפים חיץ ליזה 1X קר כקרח לכל צלחת (10 ס"מ) ודגרים על הצלחות על קרח במשך 5 דקות.
- מגרדים תאים מהצלחות ומעבירים לצינורות מיקרוצנטריפוגות. שמור על קרח.
- יש לבצע סוניקציה פעמיים למשך 10 שניות במאגר משקעים חיסוניים קרים כקרח (מאגר IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 ותערובת מעכבי פרוטאז). עבור סוניקציה, VialTweeter או אולטרסאונד בדיקה כגון UP100H או UP200Ht הם המתאימים ביותר.
- צנטריפוגה של הליזטים ב-15,000 גרם למשך 10 דקות ב-4°C.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש. (במידת הצורך, ניתן לאחסן ליזט בטמפרטורה של -80°C).
- הוסף את הנוגדן העיקרי לסופרנטנט. הסופרנאטנט עם הנוגדן הראשוני מודגר במשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה קלה. נוגדן ראשוני מתווסף בדרך כלל בכמות מרוכזת פי 10 יותר מזו המשמשת לכתמים מערביים. (ניתן להתחיל עם 1μg לכל 100μL.)
- לאחר מכן מודגרים על הסופרנאטנט עוד יותר עם תערובת של כמויות שוות של חלבון A-agarose (Invitrogen) וחלבון G agarose למשך שעה נוספת.
- לשטוף את כדורי agarose שלוש פעמים עם מאגר IP. לאחר מכן, חלצו את החלבונים הקשורים עם מאגר הטעינה SDS-PAGE על ידי חימום ב-95°C למשך 5 דקות.
ג. משקעים חיסוניים
- קח 200 μl תאים lysate ולהוסיף נוגדן ראשוני. יש לדגור עם נדנוד עדין למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- מוסיפים חלבון A או G חרוזי אגרוז (20 מיקרוליטר של 50% תמיסת חרוזים). יש לדגור עם נדנוד עדין במשך 1-3 שעות בטמפרטורה של 4°C.
- מיקרוצנטריפוגה למשך 30 שניות ב-4°C. יש לשטוף את הגלולה חמש פעמים עם 500 μl של חיץ ליזה של 1X תאים. יש לשמור על קרח במהלך השטיפה.
- השהה מחדש את הגלולה עם מאגר דגימה של 20 μl 3X SDS. מערבולת, ואז מיקרוצנטריפוגה למשך 30 שניות.
- חממו את הדגימה לטמפרטורה של 95–100 מעלות צלזיוס למשך 2–5 דקות ואת המיקרוצנטריפוגה למשך דקה אחת בטמפרטורה של 14,000 X גרם.
- טען את הדגימה (15-30 מיקרוליטר) על ג'ל SDS-PAGE (12-15%).
- נתח מדגם לפי כתם מערבי.
ניתוח כתמים מערביים עם Sonicator UP50H
בעקבות פרוטוקול באמצעות סוניקטור מסוג בדיקה UP50H שימש במחקר של Kriebisch et al. (2011):
סה"כ חלבון בודד מתאי MC3T3-E1 שטופלו ב-1,25(OH)2D3 (10−8 M) או רכב. התאים עברו ליזה באמצעות חיץ שהכיל 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (פישר מדעי); 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ו-0.5% נתרן deoxycholate (Merck). התא ליזט סוניק במשך 2 × 10 שניות במחזור 1 ומשרעת 80 עם UP50H מעבד קולי (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, גרמניה). לאחר מכן החומר היה צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 14,000 סל"ד ואת supernatant שימש עבור כתמים מערביים. עשרים וחמישה מיקרוגרם חלבון הורתח במאגר דגימה ובחומר מחזר (Invitrogen) ולאחר מכן הופרד על ידי SDS-PAGE באמצעות 4-12% ג'ל פוליאקרילאמיד (Invitrogen) והועבר לקרום ניטרוצלולוז (GE health care). הממברנה נחסמה למשך שעה אחת עם TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) שהכיל 1% קזאין (Sigma-Aldrich) ו-1% Tris (1 M). לאחר החסימה, הממברנה הודגרה עם תסיסה קלה במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם הנוגדן הראשוני (ארנב אנטי אנושי CBS 1/500, שפותח במעבדתו של פרופ' ר. בנרג'י, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב). הדגירה עם נוגדן משני מצומד (Dako) של חזרת (HPR) בוצעה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כל הכתמים פותחו על ידי כימילומינסנציה משופרת (Perkin Elmer).
לחץ כאן כדי לקרוא עוד על שיטות עבודה מומלצות לליזה וחילוץ תאים על-קוליים, הכנת ליזט והמלצות לשיפור תהליכים!
הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה לגבי יכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד בגודל מעבדה שלנו:
מכשירים מומלצים | נפח אצווה | קצב זרימה |
---|---|---|
UIP400MTP סוניק צלחת 96 בארות | צלחות מרובות באר / מיקרוטיטר | נ.א. |
כוסית אולטראסונית | CupHorn עבור בקבוקונים או | נ.א. |
GDmini2 | כור מיקרו-זרימה על-קולי | נ.א. |
VialTweeter | 00.5 עד 1.5 מ"ל | נ.א. |
UP100H | 1 עד 500 מ"ל | 10 עד 200 מ"ל/דקה |
UP200Ht, UP200ST | 10 עד 1000 מ"ל | 20 עד 200 מ"ל/דקה |
UP400ST | 10 עד 2000 מ"ל | 20 עד 400 מ"ל/דקה |
שייקר מסננת אולטראסוני | נ.א. | נ.א. |
צרו קשר! / שאל אותנו!

UIP400MTP סוניק צלחת לסוניקציה בתפוקה גבוהה של לוחות 96 בארות
אודות Western Blotting
כתמים הם הליכים אנליטיים שבהם דנ"א, רנ"א וחלבונים מועברים לנשא כדי שיוכלו להיפרד.
הכתם הדרומי משמש לזיהוי דנ"א, הכתם הצפוני לרנ"א והכתם המערבי לחלבונים.
הדבקה מערבית נקראת גם אימונובלוטינג חלבוני מכיוון שנוגדן משמש לזיהוי ספציפי של האנטיגן שלו. Western Blotting היא אחת משיטות הניתוח החשובות ביותר לאיתור חלבונים ספציפיים בדגימה. בכתם המערבי, החלבונים משותקים על הממברנות כדי לזהות אותם באמצעות נוגדנים חד שבטיים או רב-שבטיים.
על ידי אלקטרופורזה ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) חלבונים טבעיים מופרדים על ידי מבנה 3-D או חלבונים דנטורציה על ידי אורך הפוליפפטיד. החלבונים מועברים לאחר מכן לממברנה (בדרך כלל ניטרוצלולוז או PVDF), שם הם מוכתמים בנוגדנים ספציפיים לחלבון המטרה. שלב אלקטרופורזה ג'ל נכלל בניתוח כתמים מערביים כדי לפתור את הבעיה של תגובתיות צולבת של נוגדנים.
לאחר מכן, החלבונים המופרדים מוכתמים על מטריצה (בעיקר על קרום ניטרוצלולוז או PVDF), שם הם מוכתמים בנוגדנים. הנוגדנים מתפקדים כבדיקה ונבחרים במיוחד לחלבון המטרה. ניתוח המיקום והעוצמה של התגובה הספציפית מגלה פרטי ביטוי של חלבוני המטרה במדגם הנתון. קרישה מערבית יכולה לזהות חלבון מטרה שהוא נמוך כמו 1ng בשל רזולוציה גבוהה של אלקטרופורזה ג'ל ספציפיות חזקה ורגישות גבוהה של immunoassay. שיטת הכתם המערבית משמשת בביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, אימונוגנטיקה ותחומי מחקר מולקולריים אחרים.
טכניקות קשורות אחרות כוללות ניתוח כתם נקודה, אימונוהיסטוכימיה ואימונוציטוכימיה שבה נוגדנים משמשים לזיהוי חלבונים ברקמות ובתאים על ידי צביעה חיסונית, ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA).
ספרות / מקורות
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter sonicator להכנת מדגם בו זמנית של בקבוקונים מרובים