תהליכי עבודה פרוטאומיים עם עיכול חלבונים בתפוקה גבוהה

פרוטאומיקה היא תחום חיוני להבנת תהליכים ומערכות ביולוגיות, כאשר עיכול חלבונים מהווה שלב קריטי בתהליכי העבודה שלה. באופן מסורתי, עיכול חלבונים מתבצע בתמיסה באמצעות אנזימים מפרקי חלבון כמו טריפסין, אשר במיוחד הידרוליזה קשרים פפטידים בשאריות ליזין וארגינין. תהליך זה מייצר פפטידים המתאימים היטב ליינון ופיצול ביישומי ספקטרומטריית מסות (MS). עם זאת, שיטות עיכול קונבנציונליות דורשות 12-24 שעות כדי להגיע להשלמה, מה שיוצר צווארי בקבוק משמעותיים בתהליכי עבודה פרוטאומיים.
אולטרסוניקציה מציעה חלופה רבת עוצמה, ומקצרת באופן דרמטי את זמני העיכול משעות למספר דקות בלבד. בשילוב עם סוניקטורים מרובי דגימות מתקדמים כגון Hielscher CupHorn, VialTweeter, ו-UIP400MTP הסוניקטור בעל 96 בארות, אולטרסוניקציה מאפשרת פרוטאומיקה מואצת בעלת תפוקה גבוהה. טכנולוגיות אלה מייעלות את תהליכי העבודה, מפחיתות את זמן הכנת הדגימות ומגבירות את היעילות מבלי להתפשר על יכולת השחזור או איכות הנתונים.

תפקידה של אנרגיה קולית בעיכול חלבונים

אולטרה-סאונד משתמש בגלי אולטרסאונד ממוקדים כדי ליצור קוויטציה – מיקרו-בועות מקומיות שקורסות ויוצרות כוחות גזירה חזקים. תופעה זו מגבירה את העברת המסה, מקדמת ערבוב של אנזימים עם סובסטרטים, ופותחת מבנים חלבוניים, תוך חשיפת אתרי מחשוף לאנזימים מפרקי חלבון כמו טריפסין.
התוצאה? קיצור משמעותי של זמן העיכול מבלי להתפשר על יעילות או יכולת שחזור.

עיכול מפרקי חלבון משופר קולי: מתודולוגיה ותוצאות

פרוטוקול עיכול מואץ

עיכול בסיוע אולטרסאונד משלב אנזימים מפרקי חלבון ואנרגיה על-קולית כדי לזרז את זרימת העבודה. לדוגמה, באמצעות Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), זרימת העבודה העיכול ממשיך כדלקמן:

1. הפחתה: דגימות חלבון (0.5 מ"ג/מ"ל, 20 מיקרוליטר) מטופלות ב-DTT (2 μL, 110 מילימול) במאגר אמוניום ביקרבונט (12.5 מילימול). סוניקציה מוחלת באמפליטודה של 50% למשך 5 דקות.
2. אלקילציה: לאחר הוספת IAA (2 μL, 400 mM), סוניקציה חוזרת על עצמה באותם תנאים.
3. עיכול: הדגימות מדוללות ומודגרות בננו-חלקיקי טריפסין משותקים. סבב אחרון של סוניקציה (5 דקות) משלים את העיכול. פפטידים מופרדים, מיובשים ומאוחסנים לצורך ניתוח טרשת נפוצה.

שיטה קולית זו מפחיתה את זמן ההכנה הכולל מ -12 שעות לפחות מ -30 דקות. למרות התהליך המואץ, תפוקת הפפטיד ואיכותו נותרו עקביים עם שיטות הלילה המסורתיות.

יעילות עיכול חלבון אולטראסוני

במחקרים השוואתיים המשתמשים בפרוטאומים של E. coli:

• זיהוי חלבונים: דגימות מעוכלות באולטרסאונד זיהו 777 חלבונים תוך 5 דקות, לעומת 817 ב-12 שעות. זיהויי חלבון משותפים עלו על 70%.
• יכולת שחזור: ניתוחי Replicate הראו ערכי מתאם מעל 98% בכל שיטה, מה שמראה אמינות.
• סלקטיביות: חלבונים מסוימים התעכלו באופן מועדף בכל שיטה, כאשר עיכול קולי העדיף 65 חלבונים ועיכול לילה 54 חלבונים. הבדלים דקים כאלה מדגישים את הפוטנציאל הייחודי של אולטרה-סוניקציה עבור יישומים ספציפיים.

תוצאות כימות חלבונים ללא תוויות של שבעה חלבונים שעברו ספייק לתוך E. coli
לדוגמה. החלבונים הבאים נוספו בשתי רמות שונות כפי שצוין בטור
בשם "תיאו רציו". יחס תיאו הוא היחס התיאורטי בין שתי הרמות המשמשות בזה
ניסוי. אלבומין בסרום בקר (ALBU), β-לקטוגלובולין (LACB), קזאין α-S1 (CASA1),
α-S2 קזאין (CASA2), ציטוכרום C (CYC), אובלבומין (סגלגל) ופחמן אנהידראז 2
(כא2). היחסים חושבו באמצעות עוצמות חלבון LFQ שהתקבלו מ-MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
מחקר וגרפיקה: © Martins et al., 2019)

טריפסין משותק ננו-חלקיקים

השילוב של ננו-חלקיקי טריפסין משותקים (למשל, T-FMNPs) עם אולטרה-סוניקציה משפר עוד יותר את זרימת העבודה של פרוטאומיקה. ננו-חלקיקים אלה מספקים שטח פנים גבוה לאינטראקציות אנזים-סובסטרט, ובכך מגבירים את היעילות. כאשר מיושמת על פרוטאומים מורכבים, כגון E. coli, השיטה המשולבת משיגה:

• מהירות: השלם את העיכול תוך 5 דקות.
• דיוק: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• מדרגיות: התאמה לפלטפורמות מרובות בארות כמו UIP400MTP מאפשרת עיבוד בתפוקה גבוהה.

לחץ כאן לפרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב!
(ראה: Martins et al., 2019)

עיכול פרוטאוליטי במהירות גבוהה ובתפוקה גבוהה עם סוניקטורים של Hielscher

דגמי הסוניקטור הטובים ביותר לפרוטאומיקה

Hielscher Ultrasonics מציעה מודלים שונים sonicator עבור הכנה מרובה מדגם בו זמנית להקל על זרימות עבודה תפוקה גבוהה. בין אם אתם עובדים עם בקבוקונים, מבחנות, צלחות מרובות בארות (למשל צלחות 6, 24, 96 בארות) או צלחות פטרי – אנו מציעים לך את הסוניקטורים האידיאליים לניסויים שלך.

UIP400MTP סוניק צלחת רב באר

לקבלת תפוקה אולטימטיבית, UIP400MTP מספק את היכולת לעבד לוחות 96 בארות באופן אולטרה-סאונד. תואם לכל צלחת מיקרו סטנדרטית, UIP400MTP אינו דורש חד פעמיות קנייניות יקרות ונותן לך את החופש לבחור את הצלחת מרובת הבארות הטובה ביותר עבור המחקר שלך. על ידי אספקת אנרגיה אחידה על פני הצלחת, הוא מאפשר הפחתה מהירה, אלקילציה ועיכול של עד 200 פרוטאומים מורכבים תוך שעה אחת בלבד. רמה זו של אוטומציה ויעילות חיונית עבור פרוטאומיקה בתפוקה גבוהה ויישומים קליניים. למידע נוסף על sonicator צלחת multi-well!

VialTweeter

ה- VialTweeter מותאם למעבדות הדורשות סוניקציה בו זמנית של עד 10 בקבוקונים או מבחנות. הגישה הלא פולשנית שלו מבטלת סיכוני זיהום צולב תוך הבטחת עיכול חלבונים הניתן לשחזור. מכשיר זה אידיאלי לחוקרים העובדים עם נפחי דגימה מוגבלים או סוגי מדגם מגוונים.
למידע נוסף על VialTweeter multi-tube sonicator!

Hielscher UP200St-CupHorn

הסוניקטור CupHorn הוא מכשיר רב עוצמה המיועד לעיבוד בו זמנית של דגימות מרובות במיכלים אטומים. הוא מבטיח חלוקת אנרגיה קולית אחידה ובקרת טמפרטורה מדויקת. היכולת לעבד עד חמש דגימות בו זמנית, יחד עם התאימות שלו עם תהליכי עבודה מופחתים, אלקילטים ומעוכלים, הופכים את CupHorn לכלי אמין עבור פרוטאומיקה מבוססת MS.
למידע נוסף על CupHorn SonoReactor!

פרוטוקול שלב אחר שלב לעיכול פרוטאוליטי בסיוע אולטרסוניקציה באמצעות טריפסין משותק ננו-חלקיקים

פרוטוקול זה של Martins et al. (2019) מותאם לעיכול חלבונים מהיר באמצעות אנרגיה קולית וטריפסין משותק ננו-חלקיקים (T-FMNPs). השלבים המתוארים מבטיחים הפחתה יעילה, אלקילציה ופרוטאוליזה המתאימים ליישומי ספקטרומטריית מסות (MS).
שלבי פרוטוקול

1. הפחתת אג"ח דיסולפידים
   • הוסף 2 μL של תמיסת DTT (110 mM) לדגימת חלבון 20 μL (0.5 מ"ג / מ"ל) במאגר AmBic.
   • הניחו את שפופרת הדגימה בסונורקטור UP200St-CupHorn.
   • סוניק את הדגימה למשך 2.5 דקות באמפליטודה של 50% (200 ואט, 26 קילוהרץ).
   • יש לעצור להפסקה קצרה כדי לאפשר קירור, ולאחר מכן לבצע סוניקציה למשך 2.5 דקות נוספות באותם תנאים.
2. אלקילציה של שאריות ציסטאין מופחתות
   • יש להוסיף 2 מיקרוליטר של תמיסת IAA (400 מילימול) לדגימת החלבון המופחתת.
   • סוניק במשך 2.5 דקות באמפליטודה של 50% כדי להקל על אלקילציה.
   • יש להשהות לקירור, ולאחר מכן לבצע סוניקציה למשך 2.5 דקות נוספות.

   הערה: יש למזער את חשיפת הדגימה האלקילית לאור כדי למנוע התפרקות של רשות העתיקות.

3. דילול לדוגמה
   • דללו את דגימת החלבון האלקילציה לנפח סופי של 100 μL באמצעות חיץ AmBic של 25 mM המכיל 4% אצטוניטריל (v/v).
   • מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין.
4. עיכול מפרקי חלבון עם טריפסין משותק ננו-חלקיקים
   • הוסף 20 μL של תמיסת T-FMNP (3 מ"ג/מ"ל) לדגימת החלבון המדולל.
   • סוניק את התערובת בסונורקטור למשך 2.5 דקות באמפליטודה של 50%.
   • יש להשהות לקירור, ולאחר מכן לבצע סוניקציה למשך 2.5 דקות נוספות באותם תנאים.
5. הפרדת ננו-חלקיקי טריפסין
   • השתמשו במגנט כדי להפריד את T-FMNPs מהסופרנאטנט המכיל פפטידים מעוכלים.
   • מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
6. הכנת פפטיד לניתוח טרשת נפוצה
   • יבשו את הסופרנאטנט המכיל פפטידים בצנטריפוגת ואקום.
   • אחסנו את הפפטידים המיובשים בטמפרטורה של -20°C עד לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסות.