תהליכי עבודה בפרוטאומיקה עם עיכול חלבונים בתפוקה גבוהה

פרוטאומיקה היא תחום חיוני להבנת תהליכים ומערכות ביולוגיים, ועיכול חלבונים הוא שלב קריטי בתהליכי העבודה שלה. באופן מסורתי, עיכול חלבונים מתבצע בתמיסה באמצעות אנזימים פרוטאוליטיים כגון טריפסין, המבצע הידרוליזה ספציפית של קשרים פפטידיים בשיירי ליזין וארגינין. תהליך זה מייצר פפטידים המתאימים היטב ליינון ולפרגמנטציה ביישומי ספקטרומטריית מסות (MS). עם זאת, שיטות עיכול קונבנציונליות דורשות 12–24 שעות להשלמת התהליך, ויוצרות צווארי בקבוק משמעותיים בתהליכי עבודה בפרוטאומיקה.
סוניקציה מציעה חלופה עוצמתית, המקצרת באופן דרמטי את זמני העיכול משעות לדקות ספורות בלבד. בשילוב עם מכשירי סוניקציה מתקדמים לעיבוד דגימות מרובות, כגון Hielscher CupHorn, ‏VialTweeter ומכשיר הסוניקציה לפלטות בעלות 96 באריות UIP400MTP, סוניקציה מאפשרת פרוטאומיקה מואצת בתפוקה גבוהה. טכנולוגיות אלו מייעלות את תהליכי העבודה, מקצרות את זמן הכנת הדגימות ומגבירות את היעילות בלי לפגוע בהדירות או באיכות הנתונים.

תפקידה של אנרגיה אולטרסונית בעיכול חלבונים

סוניקציה משתמשת בגלי אולטרסאונד ממוקדים ליצירת קוויטציה – מיקרו־בועות מקומיות שקורסות ויוצרות כוחות גזירה עזים. תופעה זו מגבירה את מעבר המסה, מקדמת ערבוב של אנזימים עם סובסטרטים ופורשת מבני חלבונים, ובכך חושפת אתרי ביקוע לאנזימים פרוטאוליטיים כגון טריפסין.
התוצאה? קיצור משמעותי בזמן העיכול בלי לפגוע ביעילות או בהדירות.

עיכול פרוטאוליטי משופר באמצעות אולטרסאונד: מתודולוגיה ותוצאות

פרוטוקול לעיכול מואץ

עיכול בסיוע אולטרסאונד משלב אנזימים פרוטאוליטיים ואנרגיה אולטרסונית כדי להאיץ את תהליכי העבודה. לדוגמה, בשימוש ב־Hielscher UP200St-CupHorn ‏(200 W, 26 kHz), תהליך העבודה לעיכול מתנהל כך:

1. חיזור: דגימות חלבון (0.5 mg/mL, 20 µL) מטופלות ב־DTT ‏(2 µL, 110 mM) בבופר אמוניום ביקרבונט (12.5 mM). מתבצעת סוניקציה באמפליטודה של 50% במשך 5 דקות.
2. אלקילציה: לאחר הוספת IAA ‏(2 µL, 400 mM), חוזרים על הסוניקציה באותם תנאים.
3. עיכול: הדגימות נמהלות ומודגרות עם ננו־חלקיקים הנושאים טריפסין מקובע. סבב סוניקציה אחרון (5 דקות) משלים את העיכול. הפפטידים מופרדים, מיובשים ומאוחסנים לצורך אנליזת MS.

שיטה אולטרסונית זו מקצרת את זמן ההכנה הכולל מ־12 שעות לפחות מ־30 דקות. למרות התהליך המואץ, תפוקת הפפטידים ואיכותם נותרות דומות לאלו המתקבלות בשיטות המסורתיות הנמשכות לילה שלם.

יעילות עיכול חלבונים באמצעות אולטרסאונד

במחקרים השוואתיים שנערכו באמצעות פרוטאומים של E. coli:

• זיהוי חלבונים: בדגימות שעוכלו באמצעות אולטרסאונד זוהו 777 חלבונים בתוך 5 דקות, לעומת 817 בתוך 12 שעות. שיעור החלבונים שזוהו בשתי השיטות עלה על 70%.
• הדירות: אנליזות חוזרות הראו ערכי מתאם מעל 98% בתוך כל שיטה, המעידים על אמינות.
• סלקטיביות: כל שיטה עיכלה באופן מועדף חלבונים מסוימים: עיכול באמצעות אולטרסאונד העדיף 65 חלבונים, ועיכול במשך לילה שלם העדיף 54 חלבונים. הבדלים דקים אלו מדגישים את הפוטנציאל הייחודי של סוניקציה ליישומים מסוימים.

תוצאות כימות חלבונים ללא סימון של שבעה חלבונים שנוספו לדגימת E. coli.
החלבונים הבאים נוספו בשתי רמות שונות, כפי שמצוין בעמודה
ששמה "Theo Ratio". ‏Theo Ratio הוא היחס התאורטי בין שתי הרמות ששימשו בניסוי
זה. אלבומין מסרום בקר (ALBU), ‏β-לקטוגלובולין (LACB), קזאין α-S1 ‏(CASA1),
קזאין α-S2 ‏(CASA2), ציטוכרום c ‏(CYC), אובלבומין (OVAL) ואנהידראז פחמתי 2
(CAH2). היחסים חושבו באמצעות עוצמות החלבונים ב־LFQ שהתקבלו מאנליזה ב־MaxQuant.
מבחן t של סטודנט שימש להשוואת הערכים שהתקבלו בכל שיטה (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
מחקר ותרשים: © Martins et al., 2019)

טריפסין מקובע על ננו־חלקיקים

שילוב ננו־חלקיקים הנושאים טריפסין מקובע (למשל, T-FMNPs) עם סוניקציה משפר עוד יותר את תהליכי העבודה בפרוטאומיקה. ננו־חלקיקים אלה מספקים שטח פנים גדול לאינטראקציות בין האנזים לסובסטרט, וכך מגבירים את היעילות. ביישום על פרוטאומים מורכבים, כגון זה של E. coli, השיטה המשולבת משיגה:

• מהירות: עיכול מלא בתוך 5 דקות.
• דיוק: כימות חלבונים ברמה דומה לזו של שיטות מסורתיות (p > 0.01, n=3).
• יכולת הרחבה: התאמה לפלטפורמות מרובות באריות כגון UIP400MTP מאפשרת עיבוד בתפוקה גבוהה.

לחצו כאן לפרוטוקול המפורט עם הוראות שלב אחר שלב!
(השוו Martins et al., 2019)

עיכול פרוטאוליטי במהירות גבוהה ובתפוקה גבוהה באמצעות מכשירי סוניקציה של Hielscher

דגמי מכשירי הסוניקציה הטובים ביותר לפרוטאומיקה

Hielscher Ultrasonics מציעה מגוון דגמים של מכשירי סוניקציה להכנה בו־זמנית של מספר דגימות, המאפשרים תהליכי עבודה בתפוקה גבוהה. בין שאתם עובדים עם בקבוקונים, מבחנות, פלטות מרובות באריות (למשל, פלטות בעלות 6, 24 או 96 באריות) או צלחות פטרי – אנו מציעים לכם את מכשירי הסוניקציה האידיאליים לניסויים שלכם.

מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP

לתפוקה מרבית, UIP400MTP מאפשר עיבוד אולטרסוני של פלטות בעלות 96 באריות. UIP400MTP תואם לכל מיקרופלטה סטנדרטית, אינו דורש מוצרים מתכלים יקרים הייחודיים ליצרן ומעניק לכם את החופש לבחור את הפלטה מרובת הבאריות הטובה ביותר למחקר שלכם. באמצעות העברת אנרגיה אחידה על פני כל הפלטה, הוא מאפשר חיזור, אלקילציה ועיכול מהירים של עד 200 פרוטאומים מורכבים בתוך 1 שעה בלבד. רמה זו של אוטומציה ויעילות חיונית לפרוטאומיקה בתפוקה גבוהה וליישומים קליניים. למידע נוסף על מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות!

VialTweeter

VialTweeter מותאם למעבדות הזקוקות לסוניקציה בו־זמנית של עד 10 בקבוקונים או מבחנות. הגישה הלא פולשנית שלו מבטלת את הסיכונים לזיהום צולב תוך הבטחת עיכול חלבונים הדיר. מכשיר זה אידיאלי לחוקרים העובדים עם נפחי דגימה מוגבלים או עם סוגי דגימות מגוונים.
למידע נוסף על מכשיר הסוניקציה למספר מבחנות VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

מכשיר הסוניקציה CupHorn הוא מכשיר רב־עוצמה המיועד לעיבוד בו־זמני של מספר דגימות במכלים אטומים. הוא מבטיח פיזור אחיד של אנרגיה אולטרסונית ובקרת טמפרטורה מדויקת. היכולת לעבד עד חמש דגימות בו־זמנית, בשילוב התאמתו לתהליכי עבודה הכוללים חיזור, אלקילציה ועיכול, הופכת את CupHorn לכלי אמין לפרוטאומיקה המבוססת על MS.
למידע נוסף על CupHorn SonoReactor!

פרוטוקול שלב אחר שלב לעיכול פרוטאוליטי בסיוע סוניקציה באמצעות טריפסין המקובע על ננו־חלקיקים

פרוטוקול זה מאת Martins et al. (2019) מותאם לעיכול מהיר של חלבונים באמצעות אנרגיה אולטרסונית וטריפסין המקובע על ננו־חלקיקים (T-FMNPs). השלבים המתוארים מבטיחים חיזור, אלקילציה ופרוטאוליזה יעילים המתאימים ליישומי ספקטרומטריית מסה (MS).
שלבי הפרוטוקול

1. חיזור קשרים דיסולפידיים
   • הוסיפו 2 µL של תמיסת DTT בריכוז 110 mM לדגימת החלבון בנפח 20 µL ובריכוז 0.5 mg/mL בבופר AmBic.
   • הניחו את מבחנת הדגימה בריאקטור האולטרסוני UP200St-CupHorn.
   • בצעו סוניקציה של הדגימה במשך 2.5 דקות באמפליטודה של 50% (200 W, 26 kHz).
   • הפסיקו לזמן קצר כדי לאפשר קירור, ולאחר מכן בצעו סוניקציה במשך 2.5 דקות נוספות באותם תנאים.
2. אלקילציה של שיירי ציסטאין מחוזרים
   • הוסיפו 2 µL של תמיסת IAA בריכוז 400 mM לדגימת החלבון המחוזרת.
   • בצעו סוניקציה במשך 2.5 דקות באמפליטודה של 50% כדי לקדם אלקילציה.
   • הפסיקו לצורך קירור, ולאחר מכן בצעו סוניקציה במשך 2.5 דקות נוספות.

   הערה: צמצמו למינימום את חשיפת הדגימה שעברה אלקילציה לאור כדי למנוע פירוק של IAA.

3. דילול הדגימה
   • דללו את דגימת החלבון שעברה אלקילציה לנפח סופי של 100 µL באמצעות בופר AmBic בריכוז 25 mM המכיל 4% אצטוניטריל (v/v).
   • ערבבו היטב באמצעות פיפטציה עדינה.
4. עיכול פרוטאוליטי באמצעות טריפסין המקובע על ננו־חלקיקים
   • הוסיפו 20 µL של תמיסת T-FMNP בריכוז 3 mg/mL לדגימת החלבון המדוללת.
   • בצעו סוניקציה של התערובת בסונוריאקטור במשך 2.5 דקות באמפליטודה של 50%.
   • הפסיקו לצורך קירור, ולאחר מכן בצעו סוניקציה במשך 2.5 דקות נוספות באותם תנאים.
5. הפרדת הננו־חלקיקים הנושאים טריפסין מקובע
   • השתמשו במגנט כדי להפריד את ה-T-FMNPs מהנוזל העליון המכיל פפטידים שעברו עיכול.
   • העבירו את הנוזל העליון למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה.
6. הכנת פפטידים לאנליזת MS
   • יבשו את הנוזל העליון המכיל פפטידים בצנטריפוגת ואקום.
   • אחסנו את הפפטידים המיובשים בטמפרטורה של -20°C עד לאנליזה נוספת בספקטרומטריית מסה.