פרוטוקול לפרוטאומיקה: סוניקציה ללא מגע משפרת את הכנת דגימות הפפטידים לניתוח MS

פרוטאומיקה בגישת מלמטה למעלה הפכה לאבן יסוד בגילוי סמנים ביולוגיים, בביולוגיה מבנית ובאבחון קליני מודרניים. באמצעות עיכול חלבונים לפפטידים לפני ניתוח בספקטרומטריית מסה (MS), חוקרים יכולים להשיג כיסוי רצף מעמיק יותר וכימות אמין יותר. עם זאת, הכנת דגימות ביולוגיות בעלות מורכבות גבוהה לניתוח MS נותרה מאתגרת מבחינה טכנית. התפתחויות מתודולוגיות מהעת האחרונה מדגישות כיצד עיבוד אולטרסוני מבוקר – במיוחד באמצעות הסוניקטור למבחנות מרובות VialTweeter והסוניקטור למיקרופלטות UIP400MTP, הפועלים ללא מגע – יכול לייעל משמעותית את תהליך העבודה הזה, לשפר את ההדירות ולמנוע צווארי בקבוק נפוצים במכשור.
כאן תמצאו פרוטוקול מפורט להכנת דגימות לקבלת פפטידים בגודל מתאים לניתוח MS.

למי כדאי להשתמש בסוניקציה ללא מגע להכנת דגימות פפטידים?

• מעבדות לפרוטאומיקה בגישת מלמטה למעלה ולמחקרי גילוי: חוקרים המכינים דגימות בעלות מורכבות גבוהה לתהליכי עבודה של LC-MS או MALDI, הזקוקים להשבת פפטידים עקבית ובתפוקה גבוהה ממגוון מטריצות ביולוגיות.
• משתמשי S-Trap™ ולכידה בתרחיף: צוותים המסתמכים על ניקוי באמצעות מיקרו־עמודות, הזקוקים לגזירה מבוקרת של DNA כדי למנוע סתימת עמודות ולהבטיח טעינה ועיכול של הדגימות ללא תקלות.
• קבוצות מחקר קליני ותרגומי: מעבדות המעבדות רקמות, תאים, פלזמה, סרום או נוזל מוחי־שדרתי, שבהן הדירות בין אצוות ושלמות הדגימות הן קריטיות.
• צוותי MS כמותי וממוקד: מעבדות המבצעות מחקרים השוואתיים קפדניים, שבהם סוניקטורים עם גשושית יוצרים סיכוני זיהום צולב העלולים לפגוע בכימות פפטידים המצויים בשפע נמוך.
• יחידות שירות מרכזיות ומערכי עבודה בתפוקה גבוהה: קבוצות המעבדות חזרות ביולוגיות מרובות בו־זמנית, הנהנות מסוניקציה בבלוק למבחנות מרובות וסגורות באמצעות VialTweeter, המבטלת את הצורך בניקוי הגשושית, מצמצמת את זמן העבודה הידנית ושומרת על תנאים אספטיים.
• חוקרי שינויים לאחר תרגום (PTM) ומבנה חלבונים: חוקרים הזקוקים לעיבוד עדין ומבוקר טמפרטורה כדי לשמר שינויים בלתי יציבים ולמקסם את כיסוי הרצף במהלך ליזיס של תאים והומוגניזציה.

סקירת הפרוטוקול: מרקמות ותאים לפפטידים מוכנים לניתוח MS

תהליך העבודה לפרוטאומיקה בגישת מלמטה למעלה, שאומץ בהיקף נרחב ומתואר על ידי Wojtkiewicz ועמיתיו, מספק שיטה אמינה הניתנת להרחבה להכנת דגימות פפטידים ממגוון מטריצות ביולוגיות. הפרוטוקול מתחיל ב־50–100 mg של רקמה שהוקפאה בהקפאה מהירה או ב־1–20 מיליון תאים, ומשלב טכנולוגיית לכידה בתרחיף (S-Trap™) להסרה יעילה של דטרגנטים, מלחים ומזהמים לפני עיכול אנזימטי.
לאחר ליזיס, כימות חלבונים, חיזור ואלקילציה, הדגימה מוחמצת ונטענת על עמודת צנטריפוגה מסוג S-Trap™, שבה מתבצע עיכול באמצעות טריפסין/lysC. הפפטידים המתקבלים עוברים אלוציה, מיובשים ומנותחים ב־LC-MS. כאשר תהליך העבודה מיושם על 50 mg של רקמת לב אנושית, הוא מניב באופן עקבי כמות פפטידים המספיקה ל־30–40 הזרקות, ומאפשר זיהוי של יותר מ־4,000 חלבונים ייחודיים בכל הרצה. אף שהכימיה והניקוי באמצעות עמודות מוגדרים היטב, הצלחת תהליך העבודה תלויה במידה רבה בשלבי הפירוק הפיזי הראשוני והטיפול ב־DNA.
הפרוטוקול ממליץ להשתמש בסוניקטור למבחנות מרובות VialTweeter לביצוע ליזיס של התאים וגזירת DNA באמצעות סוניקציה – שני השלבים קריטיים לניתוח פפטידים.

ליזיס אולטרסוני של תאים ורקמות למיצוי חלבונים

בתהליך העבודה של פרוטאומיקה בגישת מלמטה למעלה, סוניקציה היא שלב מרכזי בליזיס של דגימות תאים לצורך מיצוי חלבונים לניתוח בהמשך באמצעות ספקטרומטריית מסה. לאחר הוספת בופר לליזיס תאים המכיל SDS למשקע התאים, הדגימות עוברות עיבוד אולטרסוני באמצעות הסוניקטור הרב־מבחנתי VialTweeter. הפרוטוקול משתמש במבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL ומורה להפעיל את הסוניקטור בהספק של 30%, במשך 10 שניות הפעלה ו־10 שניות הפסקה, לאורך 3 מחזורים. לאחר המתנה של דקה 1, חוזרים על המחזור פעמיים נוספות. הדגימות מקוררות ברציפות באמצעות קרח.
תהליך זה לא רק מסייע בפירוק התאים, אלא נחוץ במיוחד לגזירת ה־DNA הגנומי המשתחרר במהלך הליזיס. גזירה יעילה של DNA חיונית להפחתת צמיגות הדגימה ולמניעת סתימת עמודות S-Trap™, ובכך מבטיחה השבה מיטבית של חלבונים ועיכול אמין של פפטידים בהמשך התהליך.

התפקיד המכריע של גזירת DNA באמצעות אולטרסאונד

אחד הכשלים השכיחים ביותר בתהליכי עבודה המבוססים על S-Trap™ הוא סתימת העמודה, הנגרמת כמעט אך ורק מ־DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה המשתחרר במהלך הומוגניזציה של תאים או רקמות. DNA שלם מגביר באופן דרמטי את צמיגות הדגימה, לוכד פפטידים וחוסם את מצע הספיחה בעל הנקבוביות הזעירות של S-Trap™.
עיבוד אולטרסוני פותר בעיה זו באמצעות פירוק מכני של DNA למקטעים קטנים ומסיסים. באמצעות הפעלת אנרגיה אקוסטית מבוקרת, VialTweeter גוזר ביעילות חומצות גרעין בלי לייצר חום עודף או להחדיר מזהמים זרים. הפחתה זו בצמיגות מבטיחה טעינה חלקה של הדגימה, ספיקות זרימה עקביות דרך העמודה וקינטיקת עיכול ללא הפרעות.

פרמטרי סוניקציה מיטביים עבור VialTweeter

הפרוטוקול מגדיר מתכונת סוניקציה בעלת הדירות גבוהה, המותאמת לשמירה על שלמות הדגימה הביולוגית ולתאימות לניתוח MS בהמשך התהליך. עבור דגימות במבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5mL, בשימוש בסוניקטור הבלוק ללא מגע Hielscher VialTweeter, הפרמטרים הבאים מספקים ליזיס וגזירת DNA מיטבית תוך שמירה על מבנה החלבונים:

• משרעת: הספק של 30%
• מתכונת המחזור: 10 שניות הפעלה / 10 שניות הפסקה
• משך: 3 מחזורים (10sec הפעלה/10sec הפסקה) → מנוחה של 1 דקה על קרח → חזרה 2 פעמים נוספות
• בקרת טמפרטורה: הדגימות מונחות על קרח במהלך העיבוד כדי למנוע דנטורציה תרמית ופעילות אנזימטית מוקדמת

גישה זו של סוניקציה בפולסים מונעת התחממות יתר מקומית, ממזערת חמצון פפטידים ומבטיחה חשיפה אקוסטית אחידה בכל הבקבוקונים. מערך המבחנות הסגורות גם מייתר את הצורך בניקוי הגשושית בין דגימות, ומפחית במידה ניכרת את זמן העבודה הידנית ואת השונות בין מפעילים.

יתרונות מרכזיים לתהליכי עבודה מודרניים בפרוטאומיקה

שילוב VialTweeter בתהליך העבודה שלכם בפרוטאומיקה בגישת מלמטה למעלה מציע כמה יתרונות תפעוליים ומדעיים:

1. פרגמנטציה עקבית של DNA: העברה אחידה של אנרגיה אקוסטית לכל הבקבוקונים מבטיחה הפחתת צמיגות הדירה ומונעת שונות בין אצוות בעת הטעינה ל־S-Trap™.
2. שימור מודיפיקציות בלתי יציבות: עיבוד בטמפרטורה נמוכה באמבט קרח מגן על מודיפיקציות לאחר תרגום (PTMs) ומונע הצטברות חלבונים הנגרמת מחום במהלך ליזיס התאים.
3. ייעול שלבי העיבוד הבאים: ניתן להצליל ליזטים שעובדו באמצעות VialTweeter ישירות באמצעות צנטריפוגה ולבצע בהם כימות ללא שלבי ניקוי נוספים, וכך להאיץ את ההתקדמות לעיכול באמצעות S-Trap™.
4. אפשרות להרחבת היקף העיבוד וגמישות: אותן הגדרות סוניקציה מתאימות הן לדגימות רקמה בעלות מורכבות גבוהה והן לתרחיפי תאים, ותומכות בתהליכי עבודה של פרוטאומיקה לגילוי, כימות ממוקד וגליקופרוטאומיקה. הסוניקטורים למיקרופלטות של Hielscher מאפשרים להרחיב בקלות את היקף העיבוד למספרים גדולים של דגימות בפלטות מרובות באריות.

ספרות / מקורות

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.