פרוטוקול פרוטאומיקה: טיפול באולטרסאונד ללא מגע משפר את הכנת דגימות הפפטידים לקראת MS
פרוטאומיקה "מלמטה למעלה" הפכה לאבן יסוד בגילוי סמנים ביולוגיים מודרניים, בביולוגיה מבנית ובאבחון קליני. באמצעות פירוק חלבונים לפפטידים לפני ניתוח בספקטרומטריית מסות (MS), יכולים החוקרים להשיג כיסוי רצפים מעמיק יותר וכימות אמין יותר. עם זאת, הכנת דגימות ביולוגיות בעלות מורכבות גבוהה ל-MS נותרת משימה טכנית מאתגרת. התקדמות מתודולוגית אחרונה מדגישה כיצד עיבוד קולי מבוקר – בפרט עם מכשיר הסוניקציה ללא מגע VialTweeter Multi-Tube ומכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP – יכול לייעל באופן משמעותי את תהליך העבודה הזה, לשפר את יכולת השחזור ולמנוע צווארי בקבוק נפוצים במכשירים.
מצאו פרוטוקול מפורט להכנת דגימות, שמטרתו להפיק פפטידים בגודל מתאים לניתוח באמצעות MS.
מי צריך להשתמש בשיטת הסוניקציה ללא מגע להכנת דגימות פפטידים?
- פרוטאומיקה מלמטה למעלה & Discovery Labs: חוקרים המכינים דגימות בעלות מורכבות גבוהה לתהליכי עבודה של LC-MS או MALDI, הזקוקים להפקת פפטידים עקבית ובעלת תפוקה גבוהה ממטריצות ביולוגיות מגוונות.
- S-Trap™ & השעיית משתמשים: צוותים המסתמכים על טיהור באמצעות מיקרו-עמודות, הזקוקים לחיתוך מבוקר של ה-DNA כדי למנוע סתימת העמודות ולהבטיח העמסה ועיכול חלקים של הדגימות.
- קליני & קבוצות מחקר תרגומי: מעבדות העוסקות בעיבוד רקמות, תאים, פלזמה, סרום או נוזל מוחי-שדרתי, שבהן השחזור בין אצוות שונות ושלמות הדגימות הם גורמים מכריעים.
- כמותי & צוותי MS ייעודיים: מעבדות המקיימות מחקרים השוואתיים קפדניים, שבהן מכשירי סוניקציה עם בדיקות רב-פעמיות מהווים סיכון לזיהום צולב שעלול לפגוע בכימות פפטידים בעלי שכיחות נמוכה.
- מתקנים מרכזיים & פעולות בתפוקה גבוהה: קבוצות המעבדות מספר חזרות ביולוגיות במקביל, המפיקות תועלת משימוש במכשיר VialTweeter לביצוע סוניקציה של בלוקים מרובי מבחנות במבחנות סגורות, מה שמבטל את הצורך בניקוי החלליות, מקצר את זמן העבודה הידנית ושומר על תנאים סטריליים.
- מפגש הורים-מורים & חוקרי חלבונים מבניים: חוקרים הזקוקים לעיבוד עדין ובטמפרטורה מבוקרת, כדי לשמר שינויים בלתי יציבים ולמקסם את כיסוי הרצף במהלך פירוק התאים והומוגניזציה.
סוניק רב-דגמי “VialTweeter” להכנת דגימות ללא מגע של מספר בקבוקונים אטומים לצורכי פרוטאומיקה
סקירה כללית של הפרוטוקול: מרקמות ותאים ועד לפפטידים המוכנים ל-MS
תהליך העבודה הפרוטאומי "מלמטה למעלה" (bottom-up), שזכה לאימוץ נרחב ושתואר על ידי Wojtkiewicz et al., מספק שיטה אמינה וניתנת להרחבה להכנת דגימות פפטידים ממטריצות ביולוגיות מגוונות. הפרוטוקול, המתחיל ב-50–100 מ"ג של רקמה שהוקפאה במהירות או ב-1–20 מיליון תאים, משלב את טכנולוגיית לכידת התרחיף (S-Trap™) כדי להסיר ביעילות חומרי ניקוי, מלחים ומזהמים לפני העיכול האנזימטי.
לאחר הליזה, כימות החלבונים, הפחתה ואלקילציה, הדגימה עוברת חומצה ומועברת לעמודת ספינינג S-Trap™, שם מתבצע פירוק באמצעות טריפסין/ליס-C. הפפטידים המתקבלים נשטפים, מיובשים ומועברים לניתוח LC-MS. כאשר מיישמים תהליך זה על 50 מ"ג של רקמת לב אנושית, הוא מניב באופן עקבי כמות מספקת של פפטידים ל-30–40 הזרקות, ומזהה למעלה מ-4,000 חלבונים ייחודיים בכל ריצה. בעוד שהכימיה והטיהור המבוסס על עמודות מוגדרים היטב, הצלחת התהליך תלויה במידה רבה בשלבי הפירוק הפיזי הראשוני וניהול ה-DNA.
הפרוטוקול ממליץ על שימוש במכשיר ה-VialTweeter Multi-Tube Sonicator לביצוע פירוק תאים באמצעות סוניקציה ופירוק ה-DNA – שני השלבים חיוניים לניתוח פפטידים.
מכשיר ה-VialTweeter מבצע טיפול באולטרסאונד על מבחנות Eppendorf אטומות בנפח 1.0, 1.5 ו-2.0 מ"ל, וכן על מבחנות NUNC מסוגים שונים
פירוק תאים ורקמות באמצעות אולטרסאונד לצורך מיצוי חלבונים
בתהליך הפרוטאומיקה "מלמטה למעלה", הטיפול באולטרסאונד מהווה שלב מרכזי בפירוק דגימות התאים לצורך מיצוי חלבונים לקראת ניתוח ספקטרומטריית מסות. לאחר הוספת תמיסת פירוק תאים המכילה SDS למשקע התאים, הדגימות עוברות טיפול באולטרסאונד באמצעות מכשיר ה-VialTweeter Multi-Tube Sonicator. הפרוטוקול משתמש במבחנות מיקרו-פוג'ה בנפח 1.5 מ"ל ומציין הפעלת מכשיר האולטרסאונד בעוצמה של 30% למשך 10 שניות, עם הפסקה של 10 שניות, וחזרה על התהליך במשך 3 מחזורים. לאחר המתנה של דקה אחת, המחזור חוזר על עצמו פעמיים נוספות. הדגימות מקוררות ברציפות בעזרת קרח.
תהליך זה לא רק מסייע בפירוק התאים, אלא הוא חיוני במיוחד לפירוק ה-DNA הגנומי המשתחרר במהלך הליזה. פירוק יעיל של ה-DNA הוא חיוני להפחתת צמיגות הדגימה ולמניעת סתימת עמודי ה-S-Trap™, ובכך להבטיח השבת חלבונים מיטבית ועיכול פפטידים אמין בשלבים הבאים.
התפקיד המכריע של גזירת ה-DNA באמצעות אולטרסאונד
אחת התקלות הנפוצות ביותר בתהליכי עבודה המבוססים על S-Trap™ היא סתימת העמודה, הנגרמת כמעט אך ורק על ידי DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה המשתחרר במהלך ההומוגניזציה של תאים או רקמות. ה-DNA השלם מגביר באופן דרמטי את צמיגות הדגימה, לוכד פפטידים וחוסם את מצע הסופג המיקרו-נקבובי של S-Trap™.
עיבוד אולטראסוני פותר בעיה זו על ידי פירוק מכני של ה-DNA לרסיסים קטנים ומסיסים. באמצעות הפעלת אנרגיה אקוסטית מבוקרת, מכשיר ה-VialTweeter מבצע גזירה יעילה של חומצות גרעין מבלי לייצר חום עודף או להכניס מזהמים זרים. הפחתת הצמיגות הזו מבטיחה טעינה חלקה של הדגימה, קצב זרימה עקבי וקינטיקה של פירוק ללא הפרעות.
פרמטרים מיטביים לעיבוד קולי באמצעות VialTweeter
הפרוטוקול מפרט משטר סוניקציה בעל רמת שחזור גבוהה, המותאם באופן מיטבי לשמירה על שלמות הדגימה הביולוגית ולתאימות עם ניתוח MS בהמשך התהליך. עבור דגימות הנמצאות במבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, תוך שימוש במכשיר הסוניקציה ללא מגע Hielscher VialTweeter, הפרמטרים הבאים מבטיחים ליזיס וחתך אופטימלי של ה-DNA תוך שמירה על מבנה החלבון:
- משרעת: 30% מההספק
- דפוס מחזור: 10 שניות פועל / 10 שניות כבוי
- משך: 3 מחזורים (10 שניות פעילות/10 שניות מנוחה) → מנוחה של דקה אחת על קרח → חוזרים על התרגיל עוד פעמיים
- ניהול טמפרטורה: הדגימות מונחות על קרח במהלך העיבוד כדי למנוע דנטורציה תרמית ופעילות אנזימטית מוקדמת
שיטת הסוניקציה הפועמת הזו מונעת התחממות יתר מקומית, מצמצמת את חמצון הפפטידים ומבטיחה חשיפה אקוסטית אחידה בכל הבקבוקונים. בנוסף, התצורה של הצינור הסגור מבטלת את הצורך בניקוי החללית בין דגימה לדגימה, מה שמקצר באופן משמעותי את זמן העבודה הידנית ומצמצם את השונות בין המפעילים.
יתרונות מרכזיים בתהליכי עבודה מודרניים בתחום הפרוטאומיקה
שילוב ה-VialTweeter בתהליך הפרוטאומיקה שלכם, המתבסס על גישה מלמטה למעלה, מציע מספר יתרונות תפעוליים ומדעיים:
- פיצול DNA עקבי: אספקה אחידה של אנרגיה אקוסטית לכל הבקבוקונים מבטיחה הפחתת צמיגות הניתנת לשחזור ומונעת שונות בין אצוות שונות בתהליך הטעינה של S-Trap™.
- שימור שינויים בלתי יציבים: עיבוד בטמפרטורה נמוכה באמבט קרח שומר על השינויים שלאחר התרגום (PTM) ומונע הצטברות חלבונים הנגרמת מחום במהלך פירוק התאים.
- עיבוד משופר בשלב הבא: ניתן להבהיר ישירות את התמציות שעברו עיבוד ב-VialTweeter באמצעות צנטריפוגה ולבצע כימות שלהן ללא שלבי ניקוי נוספים, דבר המאיץ את התהליך לקראת עיכול ב-S-Trap™.
- מדרגיות & גמישות: אותן הגדרות סוניקציה חלות הן על דגימות רקמה בעלות מורכבות גבוהה והן על תמיסות תאים, ומאפשרות ביצוע תהליכי עבודה בתחום הפרוטאומיקה המגלית, כימות ממוקד וגליקופרוטאומיקה. מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה של Hielscher מאפשרים הרחבה קלה של התהליך למספר רב של דגימות בתאים מרובים.
ניתן להפעיל את מכשיר ה-VialTweeter, סוניקטור רב-צינורות ללא מגע, בתוך ארונות קירור
מכשירים אולטראסוניים להכנת דגימות פרוטאומיות
הכנת דגימות פפטידים באיכות גבוהה לצורך ספקטרומטריית מסות דורשת יותר מאשר פירוק יעיל – תהליך זה דורש שליטה מדויקת על גזירת ה-DNA, על הטמפרטורה ועל מניעת זיהום. על ידי שילוב מכשיר ה-VialTweeter של Hielscher בתהליך העבודה הפרוטאומי "מלמטה למעלה" שלכם, תוכלו למנוע סתימת ה-S-Trap™, להבטיח השבת חלבונים הניתנת לשחזור ולשמור על רמת הניקיון הנדרשת לניתוחי MS רגישים. בין אם אתם מעבדים רקמה אנושית, תאים מתורבתים או תמציות מורכבות, עיבוד בלוקים באמצעות אולטרה-סאונד מספק את האמינות, את יכולת ההרחבה ואת השליטה בתהליך הנדרשות במעבדות פרוטאומיקה מודרניות.
כדי להגדיל את היקף הטיפול למספר דגימות גדול יותר, נצלו את דגמי הסוניקטור למיקרו-פלטה של Hielscher, בעלי מיקוד וללא מגע: UIP400MTP ו-UIP550MTP! עבדו כל צלחת רב-בארות סטנדרטית לצורך פרוטאומיקה בתפוקה גבוהה!
עיבוד בצינור סגור לעומת מכשירי סוניקציה מסורתיים עם בדיקה
מבחינה היסטורית, חוקרים הסתמכו על מכשירי סוניקציה עם בדיקה במגע ישיר לצורך גזירת ה-DNA. אף על פי שמערכות אלה יעילות, הן מטילות מספר מגבלות קריטיות על תהליכי העבודה בתחום הפרוטאומיקה:
- סיכון לזיהום צולב: שימוש חוזר באותה בדיקה במספר דגימות יוצר העברה של חלקיקים באוויר ומכניס מזהמים צולבים, מה שמטה את תוצאות ה-MS הכמותיות.
- דוגמה לאובדן: החדרה ישירה עלולה לגרום להתזות, לאידוי ולהידבקות של פפטידים יקרי ערך למשטח הגשוש.
- ניקוי: טיהור יסודי של הבדיקה בין סבבים הוא תהליך שדורש זמן רב ולעתים קרובות אינו מושלם, דבר הפוגע במחקרים העוסקים בחלבונים בעלי שכיחות נמוכה.
מכשיר הסוניקציה מסוג VialTweeter מעבד דגימות באופן מלא בתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה אטומות. תכנון המערכת הסגורה הזה מבטל מגע בין הבדיקה לדגימה, מונע יצירת אירוסול ושומר על תנאים סטריליים קפדניים לאורך כל תהליך ההומוגניזציה והליזה. עבור מעבדות המעבדות תמציות רקמה מורכבות במיוחד או קווי תאים מרובים, הדבר מתורגם לנתוני MS נקיים יותר, שיעור השבה גבוה יותר של פפטידים, ושיכפולים ביולוגיים אמינים יותר.
הרחבת היקף הכנת הדגימות לתפוקה גבוהה בצלחות רב-תאים
עם דגמי הסוניקטור למיקרו-פלטה UIP400MTP ו-UIP550MTP, ניתן להרחיב את תהליך הטיפול במבחנות בקלות לעיבוד דגימות בתפוקה גבוהה בכל צלחת רב-בארות סטנדרטית.
סוניק צלחת רב באר UIP400MTP למיצוי חלבונים בתפוקה גבוהה מדגימות
שאלות נפוצות בנושא שימוש באולטרסאונד להכנת דגימות פפטידים
מדוע יש צורך בעיבוד באולטרסאונד לפני עיבוד הפפטיד באמצעות S-Trap™?
יש צורך בשימוש באולטרסאונד כדי לפרק DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה, המשתחרר במהלך פירוק תאים או רקמות. DNA שלם מעלה באופן דרסטי את צמיגות הדגימה, מה שעלול לסתום את המיקרו-עמודה S-Trap™ וללכוד פפטידים, ובכך להפחית באופן משמעותי את שיעור ההשבה ואת התאימות ל-MS.
כיצד מכשיר ה-VialTweeter לחסימת סוניקטור משפר את הכנת הדגימות בהשוואה לסוניקטורים מסורתיים עם בדיקה?
בניגוד למכשירי סוניקציה עם בדיקה במגע ישיר, הדורשים ניקוי קפדני בין מחזורי הפעלה ומציבים סיכון להעברת חלקיקים באוויר, מכשיר ה-VialTweeter מעבד את הדגימות באופן מלא בתוך בקבוקונים אטומים וצינורות מיקרוצנטריפוגה. תכנון הצינורות הסגורים מבטל זיהום צולב, מונע אובדן דגימות ושומר על תנאים סטריליים קפדניים לאורך כל תהליך ההומוגניזציה והפירוק התאי.
מהם הפרמטרים האופטימליים לטיפול באולטרסאונד לצורך הכנת דגימות לפרוטאומיקה?
עבור דגימות ביולוגיות כגון תאים ורקמות, הפרוטוקול המומלץ הוא שימוש במכשיר סוניקציה מסוג VialTweeter בעוצמה של 30%, במחזור של 10 שניות הפעלה ו-10 שניות כיבוי, החוזר על עצמו 3 פעמים. יש לשמור את הדגימות על קרח במהלך העיבוד, ולחזור על המחזור פעמיים נוספות אם מעבדים 5 מיליון תאים ומעלה. (ראו Wojtkiewicz et al., 2021)
מה עליי לעשות אם עמודת ה-S-Trap™ שלי נסתמת במהלך טעינת הדגימה?
סתימת העמודה נגרמת בדרך כלל כתוצאה מצמיגות גבוהה של ה-DNA או מהבהרה לא מספקת. כדי לפתור בעיה זו, יש לבצע צנטריפוגה יסודית של התוצר המפורק לפני השימוש בפיפטה, ולהבטיח שה-DNA עבר גזירה מספקת באמצעות סוניקציה.
כיצד תורמת שיטת האולטרסאונד ללא מגע לתהליכי עבודה בתחום הפרוטאומיקה הכמותית?
במחקרים כמותיים, אפילו זיהום צולב זעיר בין דגימות עלול להטות את תוצאות המדידה של פפטידים בעלי שכיחות נמוכה. תהליך העיבוד של ה-VialTweeter, המתבצע בתוך צינור סגור ומאפשר טיפול במספר מבחנות בו-זמנית, מבטל את הצורך בהחדרת בדיקה, מבטיח שעתוק בין אצוות שונות ושומר על שלמות הדגימה לצורך ביצוע ניתוחים השוואתיים מדויקים.
לאיזו תפוקת חלבון ועומק MS אני יכול לצפות לפי פרוטוקול זה?
בהתחלה עם 50 מ"ג של רקמת לב אנושית או 5 מיליון תאים, תהליך העבודה של S-Trap™ מספק בדרך כלל כמות פפטידים מספקת ל-30–50 הזרקות LC-MS, ומזהה באופן עקבי למעלה מ-4,000 חלבונים ייחודיים בכל ריצה. (ראו: Wojtkiewicz et al., 2021)
ספרות / מקורות
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
חברת Hielscher Ultrasonics מספקת מכשירי סוניקציה עוצמתיים ללא מגע, המיועדים להכנת דגימות ולניתוח קליני. מכשיר הסוניקציה לצלחות רב-תאיות UIP400MTP, ה-VialTweeter, ה-CupHorn ומכשיר הסוניקציה הזרימתי GDmini2 מעבדים את הדגימות מבלי לגעת בהן.