סוניקציה במיקרופלטות בפרוטאומיקת שוטגאן – הערת יישום
פרוטאומיקת שוטגאן תלויה בהכנת דגימות יעילה והדירה כדי להפוך חומר ביולוגי מורכב לפפטידים המוכנים לניתוח ב-LC-MS/MS. מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP תומך בתהליך זה באמצעות סוניקציה מקבילית ואחידה של דגימות בנפח קטן, ומסייע למעבדות לשפר את הפירוק, המיצוי וההמסה מחדש בתהליכי עבודה המבוססים על מיקרופלטות. הערת יישום זו מתארת כיצד ניתן לשלב את UIP400MTP בהכנת דגימות לפרוטאומיקה, תוך שימוש בתהליך עבודה שפורסם עבור שלפוחיות חוץ-תאיות ממחקרי PLA2G12A/Th17 כדוגמה שנבדקה במעבדה.
סוניקציה במיקרופלטות לפרוטאומיקת שוטגאן הדירה יותר
עבור חוקרי פרוטאומיקה, הכנת דגימות הדירה חיונית לקבלת נתוני LC-MS/MS באיכות גבוהה. מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP תומך בסוניקציה מקבילית ואחידה בתהליכי עבודה המבוססים על פלטות ובתהליכי עבודה בנפחים קטנים ובתפוקה גבוהה.
הוא שימושי במיוחד למעבדות העובדות עם:
- מערכי דגימות גדולים הדורשים עיבוד עקבי בבאריות רבות
- חומר שכמותו ההתחלתית מוגבלת, ושיש לצמצם בו ככל האפשר את אובדן הדגימה ואת השונות
- דגימות עשירות בליפידים, כגון שלפוחיות חוץ-תאיות
- תכשירים ביולוגיים מורכבים הדורשים פירוק, מיצוי או המסה מחדש באופן יעיל
- פרוטאומיקת שוטגאן השוואתית, שבה הדירות בין תנאים ובין חזרות חיונית
באמצעות שילוב סוניקציה במיקרופלטות לפני העיכול, חוקרים יכולים לשפר את מוכנות הדגימות ל:
- מיצוי חלבונים והמסה מחדש
- עיכול באמצעות טריפסין/Lys-C
- רכישת נתונים ב-Nano-LC/MS/MS
- ניתוח פרוטאומי כמותי בהמשך התהליך
גלו כיצד סוניקציה במיקרופלטות מסייעת להפחית שונות הנובעת מעבודה ידנית, לשפר את פירוק הדגימות ולהכין דגימות ביולוגיות מורכבות לניתוח LC-MS/MS אמין.
סוניקציה במיקרופלטות יכולה להועיל ל:
- יחידות שירות מרכזיות לפרוטאומיקה
- מעבדות לחקר שלפוחיות חוץ-תאיות (EV)
- מעבדות לאימונולוגיה ולביולוגיה של התא
- קבוצות מחקר תרגומי
- צוותים במדעי החיים המרחיבים את פעילותם מהכנת דגימה יחידה לתהליכי עבודה בתפוקה גבוהה יותר
הכנת דגימות בתפוקה גבוהה לניתוח הפרוטאום של שלפוחיות חוץ-תאיות
מהי פרוטאומיקת שוטגאן?
פרוטאומיקת שוטגאן הפכה לאסטרטגיה אנליטית מרכזית לאפיון דגימות ביולוגיות מורכבות, החל מליזטים של תאים שלמים ומיצויי רקמות ועד לאברונים מטוהרים, שלפוחיות חוץ-תאיות ודגימות קליניות בכמות התחלתית קטנה. עיקר כוחה טמון בשילוב של עיכול חלבונים, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסות בטנדם ברזולוציה גבוהה, והסקה חישובית מפפטידים לחלבונים. עם זאת, איכות מערך נתוני הפרוטאום הסופי נקבעת זמן רב לפני שהדגימה מגיעה לספקטרומטר המסות. פירוק יעיל של הדגימה, המסה של חלבונים, סילוק חומרים מפריעים, עיכול אנזימטי הדיר והשבה יעילה ועקבית של פפטידים הם כולם גורמים מכריעים לעומק הכיסוי ולאמינות הכמותית.
עבור חוקרי פרוטאומיקה ומעבדות במדעי החיים העובדים עם דגימות שכמותן מוגבלת או שהן יקרות ערך, הכנת הדגימות היא לעיתים קרובות צוואר הבקבוק.
UIP400MTP מבטיח הכנת דגימות אמינה ושילוב קל בתהליכי העבודה הקיימים במעבדה
האתגר שמציבות שלפוחיות חוץ-תאיות בפרוטאומיקה
שלפוחיות חוץ־תאיות (EVs), למשל, הן סוג דגימות מאתגר במיוחד. אלה חלקיקים בקנה מידה ננומטרי, מוקפים בממברנה ועשירים בליפידים, בעלי תפוקת חלבון נמוכה יחסית ופוטנציאל גבוה להעברה נלווית של ליפידים, מלחים, דטרגנטים, חלבוני סרום ורכיבי מטריצה אחרים. מאפיינים אלה עלולים לפגוע ביעילות העיכול, בביצועים הכרומטוגרפיים, ביציבות הריסוס האלקטרוני ובזיהוי הפפטידים. לפיכך, תהליך הכנה לפרוטאומיקה של EV חייב להיות יעיל דיו לפירוק מבני השלפוחיות ולהמסת המטען החלבוני, ובה בעת להישאר תואם לעיכול האנזימטי ולאנליזת LC-MS/MS בהמשך התהליך.
בהקשר זה, טיפול אולטרסוני התואם למיקרופלטות מציע גישה מעשית לעיבוד דגימות באופן שחזורי ובמקביל. מכשירי הסוניקציה למיקרופלטות של Hielscher, מדגמי UIP400MTP (400 W) ו־UIP550MTP (550 W), מיועדים לסוניקציה של דגימות בפלטות מרובות באריות ובכלים בנפח קטן, ותומכים בתהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה יותר מזו של מכשירי סוניקציה קונבנציונליים בעלי גשוש יחיד. עבור מעבדות פרוטאומיקה, מתכונת זו מושכת משום שהיא יכולה להפחית את השונות הנובעת מעבודה ידנית, לשפר את הטיפול המקביל בדגימות מרובות ולהשתלב באופן טבעי יותר בתהליכי הכנת דגימות המבוססים על פלטות.
תהליך עבודה לדוגמה
תהליך עבודה עדכני לפרוטאומיקה של שלפוחיות חוץ־תאיות, במסגרת חקר הביולוגיה של תאי Th17 המונעת על ידי PLA2G12A, מספק דוגמה שימושית שנבדקה במעבדה לאופן שבו ניתן לשלב את מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP בהכנת דגימות לפרוטאומיקת שוטגאן. בסדרת מחקרים זו עובדו דגימות EV לצורך אנליזת הפרוטאום באמצעות טיפול במתנול, סוניקציה באמצעות UIP400MTP, סרכוז, ייבוש, עיכול באמצעות trypsin/Lys-C וכרומטוגרפיה נוזלית בזרימת ננו (LC) בשילוב ספקטרומטריית מסות בטנדם ברזולוציה גבוהה (MS). המחקר הביולוגי דווח בשנת 2026 על ידי Mochizuki-Ono ועמיתים, ובו סייעה האנליזה הפרוטאומית לאפיין כיצד PLA2G12A משנה את חלבוני המטען של EV בהקשר של תגובות פתוגניות של תאי T.
מכשיר הסוניקציה לפלטות של 96 באריות UIP400MTP למיצוי חלבונים בתפוקה גבוהה
מכשיר סוניקציה: מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP
כמות חומר מוצא: כמות EV השקולה ל־5 µg חלבון
עיכול: Trypsin/Lys-C
שיטת מדידה: Nano-LC-MS/MS / פרוטאומיקת DIA
הוראות שלב אחר שלב: הכנת דגימות EV בעזרת UIP400MTP לפרוטאומיקת שוטגאן
תהליך עבודה זה מתאר שיטה להכנת דגימות של שלפוחיות חוץ־תאיות (EV) בכמות חומר מוצא קטנה לפרוטאומיקת שוטגאן, באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP. הוא מבוסס על תהליך עבודה שפורסם לפרוטאומיקה של EV, שבו דגימות EV נורמלו, יובשו, טופלו במתנול, עברו סוניקציה, עוכלו באמצעות trypsin/Lys-C, הוחמצו ונותחו באמצעות nano-LC-MS/MS.
ההליך מיועד לחוקרי פרוטאומיקה ולמעבדות למדעי החיים המכינים EV או דגימות ביולוגיות אחרות בנפח קטן ועשירות בליפידים לפרוטאומיקת שוטגאן בגישת bottom-up.
סקירת תהליך העבודה
| שלב | מטרה | תוצר עיקרי |
|---|---|---|
| הכנת EV | בידוד, שטיפה וכימות של דגימות EV | כמות חומר מוצא מנורמלת של EV |
| ייבוש הדגימות | הסרת נוזל לפני עיבוד בסיוע ממס | חומר EV מיובש |
| טיפול במתנול | סיוע בפירוק חומר EV עשיר בליפידים | דגימה מורטבת במתנול |
| סוניקציה באמצעות UIP400MTP | קידום פירוק, מיצוי והומוגניזציה | דגימת EV מעובדת |
| עיכול | יצירת פפטידים מחלבוני EV | תוצר עיכול פפטידי באמצעות Trypsin/Lys-C |
| אנליזת LC-MS/MS | הפרדה, גילוי וכימות של פפטידים | מערך נתוני פרוטאומיקה |
| ניתוח נתונים | זיהוי וכימות של פפטידים וחלבונים | תוצאות ברמת החלבון |
פרוטוקול שלב אחר שלב
| שלב | הוראה | פרמטרים קריטיים |
|---|---|---|
| 1 | הכינו דגימות EV מטוהרות באמצעות תהליך הבידוד המקובל במעבדה. | הסירו תאים, שברי תאים ומזהמים עיקריים לפני ההכנה לפרוטאומיקה. |
| 2 | כמתו את תכולת החלבון של EV, למשל באמצעות מבחן BCA. | נרמלו את כל הדגימות לכמות חומר מוצא שוות־ערך מבחינת חלבון. |
| 3 | העבירו כמות EV השקולה ל־5 µg חלבון למבחנות PCR נקיות או למבחנות תואמות בנפח קטן. | השתמשו במבחנות בעלות קישור נמוך כאשר יש חשש לאובדן דגימה. |
| 4 | ייבשו את דגימות ה־EV לחלוטין. | הימנעו מחימום יתר; ודאו שלא נותר נוזל הנראה לעין. |
| 5 | הוסיפו 25 µL מתנול לכל דגימת EV מיובשת. | ודאו שהחומר המיובש מורטב במלואו. |
| 6 | בצעו סוניקציה של הדגימות במשך 3 דקות באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP. | השתמשו בהגדרות סוניקציה זהות ובאותם עקרונות לסידור הדגימות עבור כל הדגימות. |
| 7 | סרכזו את הדגימות שעברו סוניקציה ב־19,000 × g במשך 20 דקות ב־4°C. | הימנעו מהפרעת המשקע או כל חומר בלתי מסיס לאחר הסרכוז. |
| 8 | הסירו בזהירות 20 µL מהנוזל העליון. | השתמשו בטכניקת פיפטציה אחידה בכל הדגימות. |
| 9 | יבשו לחלוטין את חומר הדגימה שנותר. | המשיכו ישירות לעיכול או אחסנו רק בתנאים שעברו תיקוף. |
| 10 | הוסיפו 4 µL תמיסת trypsin/Lys-C בריכוז 100 ng/µL באמוניום ביקרבונט בריכוז 50 mM. | הכינו תמיסת אנזים טרייה או השתמשו במנות שחולקו מראש ואוחסנו כראוי. |
| 11 | בצעו סוניקציה קצרה כדי להמיס את החומר החלבוני המיובש בתמיסת העיכול. | רכזו את כל הנוזל בתחתית המבחנה לאחר הסוניקציה. |
| 12 | בצעו עיכול במשך 2 שעות ב־37°C תוך ניעור ב־300 rpm. | הקפידו שהמכסים יישארו סגורים היטב למניעת התאדות. |
| 13 | הוסיפו 1 µL של TFA בריכוז 1.25% להחמצת תוצר העיכול. | ההחמצה עוצרת את העיכול ומכינה את הפפטידים ל־LC-MS/MS. |
| 14 | העבירו את תוצר העיכול לבקבוקונים או לפלטות המתאימים ל־LC-MS. | הימנעו מהעברת שאריות בלתי מסיסות. |
| 15 | בצעו אנליזה באמצעות nano-LC-MS/MS. | השתמשו בנפח הזרקה, בגרדיאנט LC ובהגדרות רכישת נתוני MS אחידים. |
| 16 | עבדו את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנה לפרוטאומיקה מסוג DIA, DDA או פרוטאומיקה ממוקדת, לפי הצורך. | השתמשו במסד נתונים מתאים, בסגוליות אנזים מתאימה, בהגדרות מודיפיקציות מתאימות ובערכי סף מתאימים של FDR. |
(cf. Mochizuki-Ono et al., 2026)
מכשיר סוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP
מדוע להשתמש בסוניקציה במיקרופלטות?
ה־UIP400MTP מאפשר סוניקציה מקבילית בתנאים אחידים של דגימות בנפח קטן. הדבר מועיל כאשר הדירות, כמות התחלתית קטנה של דגימה ותפוקת עיבוד של דגימות מרובות הן שיקולים חשובים.
השתמשו בכל מיקרופלטה סטנדרטית! הכנת דגימות בתפוקה גבוהה באמצעות UIP400MTP
בתהליך העבודה לפרוטאומיקה של EV המוזכר כאן נעשה שימוש בכמות התחלתית של EV השקולה ל־5 µg חלבון, ב־25 µL מתנול, ב־3 דקות סוניקציה באמצעות UIP400MTP, בעיכול באמצעות trypsin/Lys-C, בהחמצה באמצעות TFA ובאנליזה באמצעות nano-LC-MS/MS.
שלבים מומלצים ל־LC-MS/MS ולניתוח נתונים
לאחר העיכול וההחמצה, ניתן לבצע אנליזה של הדגימות באמצעות LC בפאזה הפוכה בזרימת ננו, המצומדת לספקטרומטריית מסות בטנדם ברזולוציה גבוהה. בתהליך העבודה שפורסם, הפפטידים הופרדו במערכת nano-LC ונותחו באמצעות רכישת נתונים בלתי תלויה בנתונים בספקטרומטר מסות Orbitrap.
| שלב | המלצה | מטרה |
|---|---|---|
| טעינת דגימה | השתמשו במלכודת C18 או במערך מקביל לטעינת פפטידים. | מרכז פפטידים ומסיר מזהמים בעלי קוטביות גבוהה. |
| הפרדת פפטידים | השתמשו ב־LC בפאזה הפוכה בזרימת ננו. | משפר את הפרדת הפפטידים ואת רגישות ה־MS. |
| רכישת נתוני MS | השתמשו ב־DIA, ב־DDA או ב־MS ממוקד בהתאם לתכנון המחקר. | מפיק נתונים ספקטרליים ברמת הפפטיד. |
| חיפוש במסד נתונים | השתמשו במסד נתוני ייחוס המתאים למין הביולוגי. | תומך בזיהוי פפטידים וחלבונים. |
| בקרת FDR | החילו ערכי סף לשיעור הגילויים הכוזבים ברמת הפפטיד וברמת החלבון. | מבקר את רמת הביטחון בזיהוי. |
| כימות | ייצאו טבלאות של שפע פפטידים, יוני קודמן וחלבונים. | מאפשר השוואה סטטיסטית בין קבוצות. |
רשימת בדיקה לבקרת איכות
- ודאו שכמות ה־EV ההתחלתית, במונחי כמות חלבון שקולה, שווה בכל הדגימות.
- השתמשו בסידורי דגימות אקראיים או מאוזנים לעיבוד הדגימות.
- שמרו על נפח מתנול, זמן סוניקציה, זמן ייבוש ונפח עיכול אחידים.
- נטרו את תפוקת הפפטידים ואת המספר הכולל של זיהויי החלבונים.
- בדקו את שיעור אתרי הביקוע שלא בוקעו ואת התפלגות אורכי הפפטידים.
- בחנו את צורת הפסגות הכרומטוגרפיות ואת הדירות זמני השהייה.
- כללו דגימות ריקות לניטור זליגה בין דגימות.
- השתמשו בדגימות בקרת איכות מאוגמות במחקרים גדולים יותר.
- העריכו את מקדם השונות בין החזרות.
- השתמשו ב־PCA או בשיטות דומות לזיהוי השפעות אצווה או דגימות חריגות.
המלצות לתיעוד
בעת פרסום או תיעוד של תהליך עבודה זה, דווחו על כמות ה־EV ההתחלתית, תצורת הפלטה, נפח המתנול, המשרעת וזמן הסוניקציה של UIP400MTP, תנאי הסרכוז, שיטת הייבוש, בופר העיכול, ריכוז האנזים, זמן העיכול, תנאי ההחמצה, פלטפורמת ה־LC-MS/MS, מצב רכישת הנתונים, גרסת התוכנה, מסד הנתונים, ערך הסף של FDR, שיטת הנרמול ותהליך העבודה הסטטיסטי.
כל הסוניקטורים למיקרופלטות של Hielscher מתעדים באופן אוטומטי פרמטרים חשובים של התהליך, כגון משרעת, משך הסוניקציה וטמפרטורה, עם חותמת תאריך ושעה, בקובץ CVS בכרטיס ה-SD המובנה. תיעוד נתונים לצורך שחזוריות ובקרת איכות מעולם לא היה קל יותר!
בפרוטאומיקה בשיטת DIA, השתמשו בהגדרות רכישת נתונים אחידות בכל הדגימות וכללו דגימות בקרת איכות מאוגמות ככל האפשר. עקבו אחר מספר יוני הקודמן, יציבות זמני השהייה והשונות בין החזרות.
תהליך עבודה זה הוא דוגמה שנבדקה במעבדה לפרוטאומיקה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV). עבור סוגי דגימות אחרים, בצעו אופטימיזציה של כמות חומר המוצא, תנאי הממס, משך הסוניקציה, נפח העיכול ואסטרטגיית ההזרקה ל-LC-MS/MS לפני הרחבת היקף העבודה למחקר מלא.
המחקר בפירוט: פרוטאומיקת שוטגאן של שלפוחיות חוץ-תאיות במחקר PLA2G12A
המחקר על PLA2G12A מספק דוגמה קונקרטית לשימוש ב-UIP400MTP בתהליך עבודה של פרוטאומיקת שוטגאן. השאלה הביולוגית הייתה כיצד הפוספוליפאז המופרש PLA2G12A משנה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי Th17 ובכך משפיע על התמיינות פתוגנית של תאי T. המחברים הראו כי PLA2G12A פועל על ממברנות של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ליצירת ליזופוספוליפידים, לרבות 1-אולאואיל-ליזופוספטידילאתנולאמין, וכי איתות של חומצה ליזופוספטידית בהמשך המסלול דרך LPA2 תורם להתמיינות תאי Th17. מעבר לאיתות הליפידי, המחקרים בחנו גם את מטען השלפוחיות החוץ-תאיות, לרבות תכולת RNA וחלבונים, ולכן פרוטאומיקת שוטגאן הייתה מרכיב חשוב באסטרטגיית האפיון.
בתהליך העבודה להכנת השלפוחיות החוץ-תאיות, תאי Th17 גודלו במצע המכיל סרום עוברי בקר שדולדל מאקסוזומים. הנוזלים העליונים של התרביות עברו תחילה צנטריפוגציה לסילוק תאים, סוננו דרך מסנן של 0.22 µm, רוכזו באמצעות אולטרה-פילטרציה/אולטרה-צנטריפוגציה, נשטפו, הורחפו מחדש ב-PBS וכומתו באמצעות בדיקת חלבון בשיטת BCA. הכנה מקדימה זו של השלפוחיות החוץ-תאיות הבטיחה שניתן יהיה להעביר לתהליך העבודה הפרוטאומי כמות מוגדרת של חומר שלפוחיות חוץ-תאיות במונחי שווה ערך חלבוני.
לצורך אנליזה בפרוטאומיקת שוטגאן, המחברים השתמשו בדגימות שלפוחיות חוץ-תאיות המקבילות ל-5 µg חלבון. דגימות אלו יובשו במבחנות PCR, ונוספו להן 25 µL מתנול. לאחר מכן הדגימות עברו סוניקציה במשך 3 דקות באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP. לאחר הסוניקציה, הדגימות עברו צנטריפוגציה ב-4°C במשך 20 דקות ב-19,000 × g. לאחר הסרת 20 µL מהנוזל העליון, הדגימות עברו צנטריפוגציה עד ליובש. לאחר מכן החלבונים הומסו באמצעות סוניקציה ב-4 µL תמיסת טריפסין/Lys-C בריכוז 100 ng/µL באמוניום ביקרבונט בריכוז 50 mM. העיכול בוצע במשך 2 שעות ב-37°C תוך ניעור ב-300 rpm. תוצר העיכול הוחמץ באמצעות 1 µL חומצה טריפלואורואצטית בריכוז 1.25% והועבר לכרומטוגרפיה נוזלית בזרימת ננו בשילוב ספקטרומטריית מסות בטנדם ברזולוציה גבוהה.
תהליך עבודה זה מדגיש כמה עקרונות שימושיים לפרוטאומיקה של שלפוחיות חוץ-תאיות עם כמות חומר מוצא קטנה. ראשית, כמות חומר המוצא נורמלה לפי שווה ערך חלבוני, דבר החשוב בהשוואה בין שלפוחיות חוץ-תאיות מגנוטיפים שונים או מטיפולים שונים. שנית, נעשה שימוש במתנול לפני הסוניקציה כדי לסייע בפירוק ובמיצוי, תוך הימנעות ממערכות דטרגנטים העלולות לסבך את אנליזת LC-MS/MS. שלישית, שלב הסוניקציה היה קצר ותקני, דבר המתאים לעיבוד דגימות במקביל. רביעית, עיכול באמצעות טריפסין/Lys-C בוצע בנפח קטן מאוד, וכך הפחית את הדילול וסייע בהשבת פפטידים מכמות חומר מוצא קטנה. לבסוף, מעבר ישיר מעיכול להחמצה ול-LC-MS/MS צמצם למינימום שלבי טיפול מיותרים.
שיטת ה-LC-MS/MS ששימשה בהמשך התהליך כללה הפרדה בפאזה הפוכה בזרימת ננו בשילוב ספקטרומטר מסות Q-Exactive HF Orbitrap. הדגימות נלכדו על קדם-עמודת C18 ולאחר מכן הופרדו בעמודה אנליטית בקוטר פנימי של 50 µm, בספיקת זרימה של 200 nL/min וב-40°C. הגרדיאנט התקדם מתכולה נמוכה של ממס אורגני ל-35% ממס B במשך 60 דקות, ולאחר מכן בוצעו שטיפה בתכולה גבוהה של ממס אורגני ואיזון מחדש. רכישת נתוני MS בוצעה במצב יונים חיוביים באמצעות רכישת נתונים בלתי תלויה (DIA), עם דיסוציאציה בהתנגשויות באנרגיה גבוהה יותר. קובצי הנתונים הגולמיים של DIA נותחו באמצעות DIA-NN 1.8 עם ספרייה ספקטרלית שנחזתה חישובית (in silico).
מיצוי חלבונים בתפוקה גבוהה באמצעות מכשיר הסוניקציה לפלטות בעלות 96 באריות UIP400MTP
שאלות נפוצות
מי מפיק את התועלת הרבה ביותר מסוניקציה במיקרופלטות בפרוטאומיקת שוטגאן?
סוניקציה במיקרופלטות שימושית במיוחד למעבדות פרוטאומיקה המעבדות דגימות רבות במקביל, לרבות מתקני שירות מרכזיים, קבוצות לחקר הפרוטאום, מעבדות אימונולוגיה, צוותי מחקר תרגומי ומעבדות למדעי החיים העוברות לתהליכי עבודה של LC-MS/MS בתפוקה גבוהה יותר. היא רלוונטית במיוחד כאשר שחזוריות בין דגימות היא קריטית.
מדוע להשתמש ב-UIP400MTP במקום במכשיר סוניקציה קונבנציונלי בעל גשוש?
מכשיר סוניקציה קונבנציונלי עם גשוש מעבד בדרך כלל דגימה אחת בכל פעם ומחייב ניקוי קפדני בין דגימות כדי להפחית העברה של שאריות מדגימה לדגימה. מכשירי הסוניקציה למיקרופלטות מדגמי UIP400MTP ו-UIP550MTP תומכים בסוניקציה מקבילה בפורמט מבוסס פלטות או בנפחים קטנים, ומסייעים לצמצם טיפול ידני, לשפר את העקביות ולייעל הכנה של דגימות מרובות. הם גם מאפשרים שילוב קל בתהליכי עבודה אוטומטיים.
היכן משתלבת הסוניקציה בתהליך העבודה של פרוטאומיקת שוטגאן?
סוניקציה מיושמת בדרך כלל בשלב הכנת הדגימות שלפני העיכול. היא יכולה לסייע בפירוק, במיצוי, בהומוגניזציה ובהמסה מחדש לפני עיכול אנזימטי באמצעות טריפסין, Lys-C או תערובת של טריפסין/Lys-C.
בנוסף, ניתן ליישם סוניקציה גם במהלך העיכול כדי להאיץ במידה ניכרת את העיכול האנזימטי של חלבונים. גלו את הפוטנציאל של עיכול חלבונים בתפוקה גבוהה באמצעות סוניקציה לתהליך עבודה פרוטאומי מהיר!
האם סוניקציה במיקרופלטות שימושית לפרוטאומיקה של שלפוחיות חוץ-תאיות?
כן. שלפוחיות חוץ-תאיות הן חלקיקים עשירים בליפידים ותחומים בממברנה, שעיבודם באופן הדיר עשוי להיות מאתגר. במחקרי PLA2G12A המוזכרים, דגימות EV טופלו במתנול, עברו סוניקציה באמצעות UIP400MTP, יובשו, עברו עיכול באמצעות טריפסין/Lys-C ונותחו באמצעות nano-LC/MS/MS.
אילו סוגי דגימות יכולים להפיק תועלת מסוניקציה במיקרופלטות?
סוניקציה במיקרופלטות יכולה להיות שימושית לליזטים של תאים, למקטעי אברונים, למשקעים אימוניים, לצברי חלבונים, לדגימות עשירות בממברנות, לשלפוחיות חוץ-תאיות ולהכנות ביולוגיות אחרות בנפח קטן. לכל סוג דגימה יש לבצע אופטימיזציה של עוצמת הסוניקציה ומשכה, תנאי הממס, כמות חומר המוצא ואסטרטגיית העיכול.
האם סוניקציה מחליפה עיכול אנזימטי?
לא. סוניקציה מסייעת להכין את הדגימה לעיכול באמצעות שיפור הפירוק, המיצוי או ההמסה מחדש. עיכול פרוטאוליטי עדיין נדרש ליצירת פפטידים לצורך פרוטאומיקת שוטגאן בגישת bottom-up.
קראו עוד על עיכול חלבונים המואץ באמצעות אולטרסאונד בתהליכי עבודה פרוטאומיים!
האם UIP400MTP מתאים לפרוטאומיקה עם כמות חומר מוצא קטנה?
כן, פורמט המיקרופלטות מתאים היטב לתהליכי עבודה בנפחים קטנים שבהם חשובים שימור הדגימה ועיבוד עקבי. בתהליך העבודה שפורסם עבור EV, ההכנה לפרוטאומיקה בוצעה עם כמות חומר מוצא של EV השקולה ל-5 µg חלבון.
האם סוניקציה במיקרופלטות יכולה לשפר את ההדירות?
מכשירי הסוניקציה של Hielscher תומכים בהדירות באמצעות החלת תנאי סוניקציה אחידים על דגימות מרובות. עם זאת, גורמים אחרים כגון בידוד תאים או EV, נרמול כמות חומר המוצא, יעילות העיכול, יציבות LC-MS/MS, עיבוד הנתונים והניתוח הסטטיסטי תורמים גם הם להדירות הכוללת בפרוטאומיקה.
האם סוניקציה במיקרופלטות משפרת את עומק זיהוי החלבונים?
היא עשויה לתרום לשיפור עומק הזיהוי כאשר פירוק הדגימה או המסה מחדש הם גורם מגביל. ההשפעה תלויה בסוג הדגימה, בכימיה של החלבונים, באסטרטגיית הניקוי, בתנאי העיכול ובביצועי שיטת LC-MS/MS.
מה יש למטב לפני שימוש שגרתי בתהליך העבודה?
הפרמטרים העיקריים כוללים את כמות חומר המוצא של הדגימה, הרכב הבופר או הממס, פורמט הפלטה, משרעת האולטרסאונד ומשכו, תנאי הייבוש, נפח העיכול, ריכוז האנזים, זמן ההדגרה וכמות הדגימה המוזרקת ל-LC-MS/MS. מומלץ לבצע ניסוי מקדים לפני יישום תהליך העבודה על מערך ניסויי מלא.
האם ניתן להשתמש בתהליך עבודה זה בפרוטאומיקת DIA?
כן. בתהליך העבודה המוזכר עבור EV נעשה שימוש ברכישת נתונים בלתי תלויה בנתונים, ולאחריה ניתוח באמצעות DIA-NN. סוניקציה במיקרופלטות היא חלק מתהליך הכנת הדגימות המקדים, וניתן לשלב אותה עם שיטות פרוטאומיקה מסוג DIA, DDA או פרוטאומיקה ממוקדת.
אחר אילו מדדי בקרת איכות יש לעקוב?
מדדי בקרת האיכות המומלצים כוללים את תפוקת הפפטידים, מספר הפפטידים וקבוצות החלבונים שזוהו, שיעור אתרי החיתוך שלא נחתכו, התפלגות אורכי הפפטידים, צורת השיאים הכרומטוגרפיים, יציבות זמן השהייה, מקדם השונות בין חזרות, זליגה בין דגימות והפרדה בין קבוצות ביולוגיות באמצעות PCA או שיטות דומות.
מהו היתרון העיקרי של שילוב מכשירי הסוניקציה למיקרופלטות מדגמי UIP400MTP או UIP550MTP בהכנת דגימות לפרוטאומיקה?
היתרון העיקרי הוא עיבוד מקבילי ואחיד של דגימות בנפח קטן. הדבר מסייע למעבדות להפחית שונות הנובעת מעבודה ידנית ולהכין דגימות ביולוגיות מורכבות באופן עקבי יותר לעיכול, לאיסוף נתוני LC-MS/MS ולניתוח פרוטאומי כמותי.
ניתן לשלב את מכשירי הסוניקציה למיקרופלטות של Hielscher באופן חלק בתהליכי עבודה אוטומטיים.
ספרות / מקורות
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for "Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles". Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
