שימוש באולטרסאונד על מיקרו-פלטה בפרוטאומיקה בשיטת "שוטגאן" – הערה בנוגע ליישום
פרוטאומיקה בשיטת "Shotgun" תלויה בהכנה יעילה וניתנת לשחזור של הדגימות, כדי להמיר חומר ביולוגי מורכב לפפטידים המוכנים לניתוח ב-LC-MS/MS. מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP תומך בתהליך זה על ידי מתן אפשרות לסוניקציה סטנדרטית ומקבילה של דגימות בנפח קטן, ובכך מסייע למעבדות לשפר את תהליכי הפירוק, החילוץ וההמסה מחדש בתהליכי עבודה המבוססים על מיקרו-פלטה. הערות יישום אלו מתארות כיצד ניתן לשלב את ה-UIP400MTP בהכנת דגימות פרוטאומיות, תוך שימוש בתהליך עבודה שפורסם בנושא שלפוחיות תאיות ממחקרי PLA2G12A/Th17 כדוגמה שנבדקה במעבדה.
שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה לשם השגת פרוטאומיקה מסוג "שוטגאן" בעלת רמת שחזור גבוהה יותר
עבור חוקרי פרוטאומיקה, הכנה חוזרת של דגימות היא גורם מכריע בהשגת נתוני LC-MS/MS באיכות גבוהה. מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP תומך בביצוע סוניקציה סטנדרטית ומקבילה בתהליכי עבודה המבוססים על פלטות ובנפחים קטנים עם תפוקה גבוהה.
זה מועיל במיוחד למעבדות העוסקות ב:
- מערכי דגימות גדולים הדורשים עיבוד אחיד בכל הבארות
- חומר עם כמות מוגבלת, שבו יש לצמצם ככל האפשר את אובדן הדגימה ואת השונות
- דגימות עשירות בשומנים, כגון שלפוחיות תאיות
- תכשירים ביולוגיים מורכבים הדורשים פירוק, מיצוי או החזרת מצב המסיסות בצורה יעילה
- פרוטאומיקה השוואתית בשיטת "שוטגאן", שבה החזרתיות בין תנאים ובין ניסויים חוזרים היא חיונית
באמצעות שילוב של טיפול באולטרסאונד במיקרו-פלטה לפני תהליך העיכול, החוקרים יכולים לשפר את מוכנות הדגימה לקראת:
- מיצוי חלבונים והחזרתם למצב מסיס
- עיכול באמצעות טריפסין/Lys-C
- איסוף נתונים בשיטת Nano-LC/MS/MS
- ניתוח פרוטאומיקה כמותי בשלב הבא
גלו כיצד שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה מסייע להפחית את השונות הנובעת מביצוע ידני, לשפר את פירוק הדגימות ולהכין דגימות ביולוגיות מורכבות לניתוח LC-MS/MS אמין.
שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה עשוי להועיל:
- מתקני הליבה בתחום הפרוטאומיקה
- מעבדות מחקר בתחום הרכב החשמלי
- מעבדות לאימונולוגיה וביולוגיה תאית
- קבוצות מחקר תרגומי
- צוותי מדעי החיים המרחיבים את פעילותם מהכנת דגימה בודדת לתהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה יותר
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
הכנת דגימות בתפוקה גבוהה לצורך ניתוח הפרוטאום של שלפוחיות תאיות
מהי פרוטאומיקה בשיטת "שוטגאן"?
פרוטאומיקה מסוג "שוטגאן" הפכה לאסטרטגיה אנליטית מרכזית לאפיון דגימות ביולוגיות מורכבות, החל מתסנינים של תאים שלמים ותמציות רקמה ועד לאורגנלות מטוהרות, שלפוחיות תאיות ודגימות קליניות בעלות כמות חומר נמוכה. עוצמתה העיקרית טמונה בשילוב בין פירוק חלבונים, כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה בשילוב עם ספקטרומטריית מסות טנדם, והסקת מסקנות חישובית של פפטידים לחלבונים. עם זאת, איכות מערך הנתונים הסופי של הפרוטאום נקבעת זמן רב לפני שהדגימה מגיעה לספקטרומטר המסות. פירוק יעיל של הדגימה, המסת חלבונים, הסרת חומרים מפריעים, עיכול אנזימטי שניתן לשחזור, ושחזור פפטידים אמין – כל אלה הם גורמים מכריעים לעומק הכיסוי ולאמינות הכמותית.
עבור חוקרי פרוטאומיקה ומעבדות במדעי החיים שעובדים עם דגימות מוגבלות או יקרות ערך, הכנת הדגימות מהווה לעתים קרובות את נקודת החסימה.
UIP400MTP מבטיח הכנת דגימות אמינה ושילוב קל עם תהליכי עבודה קיימים במעבדה
האתגר הטמון בוויסולות חוץ-תאיות בתחום הפרוטאומיקה
למשל, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מהוות סוג דגימה מאתגר במיוחד. מדובר בחלקיקים בקנה מידה ננומטרי, העטופים בקרום ועשירים בשומנים, עם תפוקת חלבונים נמוכה יחסית ופוטנציאל גבוה להעתקה של שומנים, מלחים, חומרי ניקוי, חלבוני סרום ורכיבי מטריצה אחרים. מאפיינים אלה עלולים לפגוע ביעילות העיכול, בביצועי הכרומטוגרפיה, ביציבות האלקטרוספריי ובזיהוי הפפטידים. לפיכך, תהליך ההכנה לפרוטאומיקה של EV חייב להיות חזק מספיק כדי לפרק את מבני השלפוחיות ולהמיס את תכולת החלבונים, תוך שמירה על תאימות עם שלבי העיכול האנזימטי והניתוח באמצעות LC-MS/MS.
בהקשר זה, טיפול באולטרסאונד התואם למיקרו-פלטה מציע גישה מעשית לעיבוד דגימות באופן ניתן לשחזור ובמקביל. דגמי הסוניקטור למיקרו-פלטה של Hielscher, UIP400MTP (400 וואט) ו-UIP550MTP (550 וואט), תוכננו לעיבוד קול של דגימות בצלחות רב-תאיות ובכלי קיבול בנפח קטן, ותומכים בתהליכי עבודה בעלי תפוקה גבוהה יותר מאשר סוניקטורים קונבנציונליים בעלי בדיקה אחת. עבור מעבדות פרוטאומיקה, פורמט זה אטרקטיבי מכיוון שהוא יכול להפחית את השונות הנובעת מעבודה ידנית, לשפר את הטיפול המקביל בדגימות מרובות ולהשתלב באופן טבעי יותר בתהליכי הכנת הדגימות המבוססים על צלחות.
תהליך עבודה לדוגמה
תהליך עבודה פרוטאומי חדשני של שלפוחיות תאיות בביולוגיה של תאי Th17 המונעים על ידי PLA2G12A מספק דוגמה שימושית, שנבדקה במעבדה, לאופן שבו ניתן לשלב את מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP בהכנת דגימות לפרוטאומיקה בשיטת "שוטגאן". בסדרת מחקרים זו, דגימות של שלפוחיות תאיות (EV) עברו עיבוד לצורך ניתוח פרוטאומי באמצעות טיפול במתנול, סוניקציה במכשיר UIP400MTP, צנטריפוגה, ייבוש, עיכול בטריפסין/Lys-C, ו-LC בננו-זרימה בשילוב עם MS טנדם ברזולוציה גבוהה. המחקר הביולוגי הזה דווח לראשונה כפרסום מקדים ב-bioRxiv ולאחר מכן פורסם ב-Cell Reports, שם ניתוח הפרוטאומיקה סייע לאפיין כיצד PLA2G12A משנה את חלבוני המטען של ה-EV בהקשר של תגובות פתוגניות של תאי T.
מכשיר סוניקציה UIP400MTP לצלחת עם 96 שקעים, המיועד להפקת חלבונים בקצב גבוה
סוניקטור: UIP400MTP סוניקטור microplate
קלט: שווה ערך ל-5 מיקרוגרם חלבון EV
עיכול: טריפסין/Lys-C
תצוגה: ננו-LC-MS/MS / פרוטאומיקה DIA
הוראות שלב אחר שלב: הכנת דגימות EV בעזרת UIP400MTP לצורך פרוטאומיקה בשיטת Shotgun
תהליך עבודה זה מתאר שיטת הכנת דגימות לפרוטאומיקה מסוג "שוטגאן" של שלפוחיות תאיות (EV) הדורשת משאבים מועטים, תוך שימוש במכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP. שיטה זו מבוססת על תהליך עבודה שפורסם בתחום הפרוטאומיקה של EV, שבו דגימות ה-EV עברו נורמליזציה, ייבוש, טיפול במתנול, עיבוד קולי, עיכול באמצעות טריפסין/Lys-C, החמצה וניתוח באמצעות nano-LC-MS/MS.
התהליך מיועד לחוקרי פרוטאומיקה ולמעבדות במדעי החיים המכינים חלקיקים חוץ-תאיים (EVs) או דגימות ביולוגיות אחרות בנפח קטן ועשירות בשומנים, לצורך ביצוע פרוטאומיקה מסוג "שוטגאן" בשיטת "מלמטה למעלה".
סקירה כללית של תהליך העבודה
| במה | מטרה | תוצאה עיקרית |
|---|---|---|
| הכנות לקראת ה-EV | בידוד, שטיפה וכימות של דגימות EV | קלט EV מנורמל |
| ייבוש דגימות | יש להסיר את הנוזל לפני ביצוע התהליך בסיוע ממס | חומר EV מיובש |
| טיפול במתנול | תמיכה בפירוק חומר EV עשיר בשומנים | דגימה שהושרה במתנול |
| עיבוד קולי במכשיר UIP400MTP | לקדם שיבוש, מיצוי והומוגניזציה | דגימת EV שעברה עיבוד |
| עיכול | ליצור פפטידים מחלבוני EV | עיכול פפטידי באמצעות טריפסין/Lys-C |
| ניתוח LC-MS/MS | הפרדה, זיהוי וכימות של פפטידים | מאגר נתונים פרוטאומי |
| ניתוח נתונים | זיהוי וכמות של פפטידים וחלבונים | תוצאות ברמת החלבון |
פרוטוקול שלב אחר שלב
| צעד | הוראות | פרמטרים קריטיים |
|---|---|---|
| 1 | הכינו דגימות EV מטוהרות באמצעות תהליך הבידוד המקובל במעבדה. | יש להסיר תאים, שאריות ומזהמים עיקריים לפני הכנת הדגימה לפרוטאומיקה. |
| 2 | יש לכמת את תכולת החלבון EV, למשל באמצעות בדיקת BCA. | יש לנרמל את כל הדגימות כך שתהיה להן כמות חלבון שווה בכניסה. |
| 3 | העבירו כמות השווה ל-5 מיקרוגרם של חלבון EV למבחנות PCR נקיות או למבחנות תואמות בנפח קטן. | יש להשתמש במבחנות בעלות כושר קשירה נמוך במקרים שבהם קיים חשש לאובדן הדגימה. |
| 4 | יש לייבש את דגימות ה-EV לחלוטין. | יש להימנע מהתחממות יתר; יש לוודא שלא נותרו נוזלים נראים לעין. |
| 5 | יש להוסיף 25 מיקרו-ליטר מתנול לכל דגימת EV מיובשת. | יש לוודא שהחומר היבש רטוב לחלוטין. |
| 6 | יש לבצע סוניקציה של הדגימות למשך 3 דקות באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP. | יש להשתמש באותן הגדרות סוניקציה ובאותו היגיון של פריסה בכל הדגימות. |
| 7 | יש לסובב את הדגימות שעברו טיפול קולי בצנטריפוגה ב-19,000 × g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C. | יש להימנע מלהפריע לגרגרים או לחומרים בלתי מסיסים לאחר הצנטריפוגה. |
| 8 | הוצא בזהירות 20 מיקרו-ליטר מהנוזל העליון. | יש להשתמש בטכניקת פיפוט עקבית בכל הדגימות. |
| 9 | יש לייבש את חומר הדגימה שנותר עד תום. | יש להמשיך ישירות לתהליך העיכול או לאחסן אך ורק בתנאים מאושרים. |
| 10 | הוסף 4 µL של תמיסת טריפסין/Lys-C בריכוז של 100 ng/µL בתמיסת ביקרבונט אמוניום 50 mM. | הכינו תמיסת אנזים טרייה או השתמשו במנות שנשמרו כהלכה. |
| 11 | יש לבצע אולטרסאונד למשך זמן קצר כדי להמיס את החומר החלבוני המיובש בתמיסת העיכול. | יש לאסוף את כל הנוזל שנאסף בתחתית הצינור לאחר הטיפול באולטרסאונד. |
| 12 | יש לבצע עיכול במשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C תוך ניעור במהירות של 300 סיבובים לדקה. | יש להקפיד לסגור את המכסים היטב כדי למנוע אידוי. |
| 13 | הוסף 1 µL של TFA בריכוז 1.25% כדי להחמיץ את תוצר העיכול. | החמצה עוצרת את תהליך העיכול ומכינה את הפפטידים לקראת LC-MS/MS. |
| 14 | העבירו את התוצר המעוכל לבקבוקונים או לצלחות המתאימים ל-LC-MS. | יש להימנע מהעברת פסולת בלתי מסיסה. |
| 15 | לנתח באמצעות nano-LC-MS/MS. | יש להשתמש בנפח הזרקה, בדרגת LC ובהגדרות איסוף MS קבועים. |
| 16 | יש לעבד את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנות DIA, DDA או תוכנות לפרוטאומיקה ממוקדת, לפי הצורך. | יש להחיל את מסד הנתונים המתאים, את הספציפיות האנזימטית, את הגדרות השינוי ואת ספי ה-FDR. |
סוניק צלחת רב באר UIP400MTP
מדוע להשתמש באולטרסאונד למיקרו-פלטה?
מכשיר ה-UIP400MTP מאפשר טיפול קולי מקביל ותקני של דגימות בנפח קטן. הדבר מועיל כאשר יש חשיבות לשחזור התוצאות, לכמות דגימה קטנה ולתפוקה של מספר דגימות.
השתמשו בכל מיקרו-פלטה סטנדרטית! הכנת דגימות בקצב גבוה באמצעות ה-UIP400MTP
תהליך העבודה הפרוטאומיקה של EV המוזכר כלל שימוש ב-5 מיקרוגרם של EV המקבילים לכמות חלבון, 25 מיקרוליטר מתנול, 3 דקות של טיפול באולטרסאונד במכשיר UIP400MTP, עיכול בטריפסין/Lys-C, החמצה ב-TFA וניתוח באמצעות ננו-LC-MS/MS.
שלבים מומלצים בביצוע LC-MS/MS ובניתוח הנתונים
לאחר העיכול והחמצון, ניתן לנתח את הדגימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) בננו-זרימה ובשלב הפוך, המשולבת עם ספקטרומטריית מסות טנדם ברזולוציה גבוהה. בתהליך העבודה שפורסם, הפפטידים הופרדו במערכת ננו-LC ונותחו באמצעות איסוף נתונים בלתי תלוי בספקטרומטר מסות Orbitrap.
| במה | המלצה | מטרה |
|---|---|---|
| טעינת דוגמה | יש להשתמש במלכודת C18 או במערך טעינת פפטידים מקביל. | מרכז פפטידים ומסיר מזהמים בעלי קוטביות גבוהה. |
| הפרדת פפטידים | יש להשתמש ב-LC בננו-זרימה ובשלב הפוך. | משפר את הפרדת הפפטידים ואת רגישות ה-MS. |
| רכישת MS | יש להשתמש ב-DIA, ב-DDA או ב-MS ממוקד, בהתאם לתכנון המחקר. | מייצר נתונים ספקטרליים ברמת הפפטיד. |
| חיפוש במסד הנתונים | השתמשו במאגר נתונים המתאים למין הספציפי. | תומך בזיהוי פפטידים וחלבונים. |
| בקרת FDR | יש להחיל ספי סף לשיעור הגילויים השגויים של פפטידים וחלבונים. | קובע את רמת הביטחון בזיהוי. |
| כימות | ייצא טבלאות המציגות את שכיחות הפפטידים, החומרים המקדימים והחלבונים. | מאפשר השוואה סטטיסטית בין קבוצות. |
רשימת בדיקה לבקרת איכות
- יש לוודא כי כמות החומר המקביל לחלבון EV זהה בכל הדגימות.
- יש להשתמש בתבניות עיבוד מדגם אקראיות או מאוזנות.
- יש לשמור על עקביות בנפח המתנול, משך הטיפול באולטרסאונד, משך הייבוש ונפח העיכול.
- יש לעקוב אחר תפוקת הפפטידים ומספר הזיהויים הכולל של החלבונים.
- בדקו את שיעור החיתוכים החסרים ואת התפלגות אורך הפפטידים.
- יש לבדוק את צורת הפס הכרומטוגרפי ואת השחזור של זמן השמירה.
- יש לכלול תאים ריקים כדי לעקוב אחר העברת נתונים.
- יש להשתמש בדגימות בקרת איכות מאוגדות במחקרים בהיקף נרחב יותר.
- יש להעריך את מקדם השונות של השכפולים.
- יש להשתמש ב-PCA או בשיטות דומות כדי לזהות השפעות אצווה או דגימות חריגות.
המלצות לתיעוד
בעת פרסום או תיעוד תהליך עבודה זה, יש לציין את כמות ה-EV שהוכנסה, פורמט הצלחת, נפח המתנול, המשרעת ומשך הטיפול באולטרסאונד במכשיר UIP400MTP, תנאי הצנטריפוגה, שיטת הייבוש, תמיסת העיכול, ריכוז האנזים, משך העיכול, תנאי החמצון, פלטפורמת ה-LC-MS/MS, מצב הרכישה, גרסת התוכנה, מסד הנתונים, סף ה-FDR, שיטת הנורמליזציה ותהליך העבודה הסטטיסטי.
כל מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה של Hielscher מתעדים באופן אוטומטי פרמטרים חשובים של התהליך, כגון משרעת, משך הסוניקציה והטמפרטורה, עם חותמת תאריך ושעה, כקובץ CSV על כרטיס ה-SD המובנה. תיעוד הנתונים לצורך שעתוק ובקרת איכות מעולם לא היה קל יותר!
בפרוטאומיקה של DIA, יש להשתמש בהגדרות איסוף עקביות בכל הדגימות ולכלול דגימות בקרת איכות מאוגדות במידת האפשר. יש לעקוב אחר ספירת הפרקורסורים, יציבות זמן השימור ושונות בין החזרות.
תהליך עבודה זה מהווה דוגמה שנבדקה במעבדה בתחום הפרוטאומיקה של רכבים חשמליים. עבור סוגי דגימות אחרים, יש לבצע אופטימיזציה של כמות החומר הנכנס, תנאי הממס, משך הטיפול באולטרסאונד, נפח העיכול ואסטרטגיית ההזרקה ל-LC-MS/MS לפני הרחבת המחקר להיקף מלא.
המחקר בפירוט: פרוטאומיקה של EV Shotgun במחקר על PLA2G12A
מחקר ה-PLA2G12A מספק דוגמה קונקרטית לשימוש ב-UIP400MTP בתהליך פרוטאומיקה מסוג "שוטגאן". השאלה הביולוגית הייתה כיצד הפוספוליפאז המופרש PLA2G12A משנה את השלפוחיות החוץ-תאיות שמקורן בתאי Th17, ובכך משפיע על התמיינות תאי T פתוגניים. החוקרים הראו כי PLA2G12A פועל על ממברנות ה-EV ליצירת ליזופוספוליפידים, כולל 1-אולאוייל-ליזופוספטידיאתנולאמין, וכי איתות חומצה ליזופוספטידית במורד הזרם באמצעות LPA2 תורם להתמיינות תאי Th17. מעבר לאיתות השומני, המחקרים בחנו גם את תכולת ה-EV, לרבות RNA וחלבונים, מה שהפך את הפרוטאומיקה בשיטת "שוטגאן" למרכיב חשוב באסטרטגיית האפיון.
בתהליך הכנת ה-EV, תאי Th17 גודלו במדיום המכיל סרום עגלי בקר שנוקה מאקסוזומים. תחליב התרבית עבר תחילה צנטריפוגה להסרת התאים, סונן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר, רוכז באמצעות אולטרה-סינון/אולטרה-צנטריפוגה, נשטף, הושעה מחדש ב-PBS, וכמותו נמדדה באמצעות בדיקת חלבון BCA. הכנה מוקדמת זו של ה-EV הבטיחה שניתן יהיה להעביר כמות מוגדרת של חומר EV, המקבילה לכמות החלבון, לתהליך הפרוטאומיקה.
לצורך ניתוח פרוטאומי בשיטת "שוטגאן", השתמשו החוקרים בדגימות EV המקבילות ל-5 µg של חלבון. דגימות אלו יובשו במבחנות PCR, והוספו אליהן 25 µL מתנול. לאחר מכן, הדגימות עברו טיפול קולי למשך 3 דקות באמצעות מכשיר הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP. לאחר הטיפול באולטרסאונד, הדגימות עברו צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C למשך 20 דקות ב-19,000 × g. לאחר הסרת 20 µL של הנוזל העליון, הדגימות עברו צנטריפוגה עד לייבוש מוחלט. לאחר מכן, החלבונים הומסו באמצעות סוניקציה ב-4 µL של תמיסת טריפסין/Lys-C בריכוז של 100 ng/µL ב-50 mM ביקרבונט אמוניום. העיכול בוצע במשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C תוך ניעור במהירות של 300 סיבובים לדקה. תוצר העיכול חומצן באמצעות 1 µL של חומצה טריפלואורואצטית בריכוז של 1.25% והועבר לניתוח באמצעות LC בננו-זרימה בשילוב עם ספקטרומטריית מסות טנדם ברזולוציה גבוהה.
תהליך עבודה זה מדגיש מספר עקרונות שימושיים לפרוטאומיקה של EV עם כמות חומר גלם מועטה. ראשית, כמות חומר הגלם נורמלה לפי שווי ערך חלבוני, דבר החשוב בעת השוואת EV מגנוטיפים או טיפולים שונים. שנית, נעשה שימוש במתנול לפני הטיפול באולטרסאונד, דבר התומך בפירוק ובמיצוי תוך הימנעות ממערכות דטרגנטים העלולות לסבך את ה-LC-MS/MS. שלישית, שלב הטיפול באולטרסאונד היה קצר וסטנדרטי, דבר התואם לעיבוד מקביל של דגימות. רביעית, העיכול בטריפסין/Lys-C בוצע בנפח קטן מאוד, דבר שהפחית את הדילול ותמך בהשבת פפטידים מכמות קטנה של חומר גלם. לבסוף, המעבר הישיר מהעיכול לחומצה ול-LC-MS/MS צמצם למינימום את שלבי הטיפול המיותרים.
בשיטת ה-LC-MS/MS במורד הזרם נעשה שימוש בהפרדה בננו-זרימה בשלב הפוך, בשילוב עם ספקטרומטר מסה מסוג Q-Exactive HF Orbitrap. הדגימות נלכדו על עמודת קדם C18, ולאחר מכן הופרדו בעמודת ניתוח בקוטר פנימי של 50 מיקרומטר בקצב של 200 ננו-ליטר לדקה ובטמפרטורה של 40°C. הגרדיאנט נע מממס אורגני נמוך ל-35% ממס B במשך 60 דקות, ולאחר מכן בוצעו שטיפה בממס אורגני גבוה ואיזון מחדש. איסוף ה-MS בוצע במצב יונים חיוביים באמצעות איסוף בלתי תלוי בנתונים עם פירוק התנגשותי באנרגיה גבוהה. קובצי הגלם של DIA נותחו באמצעות תוכנת DIA-NN 1.8 עם ספריית ספקטרומים שחוזתה in silico.
מיצוי חלבונים בקצב גבוה עם סוניקטור צלחת 96 בארות UIP400MTP
שאלות נפוצות
מי נהנה ביותר משימוש באולטרסאונד למיקרו-פלטה בתחום הפרוטאומיקה בשיטת "שוטגאן"?
שימוש באולטרסאונד למיקרו-פלטה מועיל במיוחד למעבדות פרוטאומיקה המעבדות דגימות רבות במקביל, לרבות מתקנים מרכזיים, קבוצות מחקר בתחום הפרוטאומיקה, מעבדות אימונולוגיה, צוותי מחקר תרגומי ומעבדות מדעי החיים העוברות לתהליכי עבודה של LC-MS/MS בעלי תפוקה גבוהה יותר. הדבר רלוונטי במיוחד כאשר השחזור בין דגימה לדגימה הוא קריטי.
מדוע להשתמש ב-UIP400MTP במקום במכשיר סוניקציה עם בדיקה קונבנציונלית?
מכשיר סוניקציה עם בדיקה קונבנציונלית מעבד בדרך כלל דגימות אחת אחת, ודורש ניקוי קפדני בין דגימה לדגימה כדי לצמצם את העברת החומרים. דגמי מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה UIP400MTP ו-UIP550MTP תומכים בסוניקציה מקבילה במתכונת מבוססת-פלטה או בנפח קטן, מה שמסייע להפחית את הטיפול הידני, לשפר את העקביות ולייעל את הכנת הדגימות המרובות. הם מאפשרים גם שילוב קל בתהליכי עבודה אוטומטיים.
היכן משתלב הטיפול באולטרסאונד בתהליך העבודה של פרוטאומיקה בשיטת "שוטגאן"?
בדרך כלל נעשה שימוש באולטרסאונד בשלב הכנת הדגימה שלפני העיכול. הוא יכול לסייע בפירוק, במיצוי, בהומוגניזציה ובהחזרת המסיסות לפני העיכול האנזימטי באמצעות טריפסין, Lys-C או תערובת של טריפסין ו-Lys-C.
בנוסף, ניתן להשתמש באולטרסאונד גם במהלך תהליך העיכול כדי להאיץ באופן משמעותי את פירוק החלבונים האנזימטי. גלו את הפוטנציאל הטמון בעיכול חלבונים בקצב גבוה באמצעות סוניקציה, לטובת תהליך עבודה פרוטאומי מהיר!
האם שימוש באולטרסאונד על מיקרו-פלטה מועיל לפרוטאומיקה של שלפוחיות חוץ-תאיות?
כן. שלפוחיות חוץ-תאיות הן חלקיקים עשירים בשומנים ומוקפים בקרום, שעיבודם באופן ניתן לשחזור עלול להוות אתגר. במחקרים המוזכרים בנושא PLA2G12A, דגימות ה-EV עברו טיפול במתנול, עברו סוניקציה באמצעות מכשיר ה-UIP400MTP, יובשו, עברו עיכול באמצעות טריפסין/Lys-C, ונותחו באמצעות nano-LC/MS/MS.
אילו סוגי דגימות יכולים להפיק תועלת משימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה?
שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה עשוי להיות שימושי עבור תמציות תאים, שברים של אברונים, תוצרי אימונו-פרציפיטציה, אגרגטים חלבוניים, דגימות עשירות בקרומים, שלפוחיות חוץ-תאיות ותכשירים ביולוגיים אחרים בנפח נמוך. יש לבצע אופטימיזציה של כל סוג דגימה מבחינת עוצמת האולטרסאונד ומשך הזמן, תנאי הממס, כמות החומר הנכנס ואסטרטגיית העיכול.
האם עיבוד באולטרסאונד מחליף את העיכול האנזימטי?
לא. השימוש באולטרסאונד מסייע בהכנת הדגימה לעיכול על ידי שיפור תהליך הפירוק, החילוץ או החזרת המסיסות. עדיין נדרש עיכול פרוטאוליטי כדי לייצר פפטידים לצורך פרוטאומיקה מסוג "שוטגן" (bottom-up).
קראו עוד על פירוק חלבונים המואץ באמצעות אולטרסאונד בתהליכי עבודה פרוטאומיים!
האם ה-UIP400MTP תואם לפרוטאומיקה עם כמות נמוכה של חומר גלם?
כן, פורמט המיקרו-פלטה מתאים היטב לתהליכי עבודה בנפחים קטנים, שבהם יש חשיבות לשמירה על הדגימות ולעיבוד עקבי. בתהליך העבודה שפורסם בנושא EV, הכנת הדגימה לפרוטאומיקה בוצעה עם כמות EV שוות ערך ל-5 מיקרוגרם חלבון.
האם שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה יכול לשפר את השחזור?
מכשירים סוניקטוריים של Hielscher תורמים לשחזור התוצאות באמצעות יישום תנאי סוניקציה אחידים על פני דגימות רבות. עם זאת, גורמים נוספים כגון בידוד תאים או חלקיקים אקסו-תאיים (EV), נורמליזציה של הקלט, יעילות העיכול, יציבות ה-LC-MS/MS, עיבוד הנתונים וניתוח סטטיסטי תורמים אף הם לשחזור התוצאות הכולל בתחום הפרוטאומיקה.
האם שימוש באולטרסאונד במיקרו-פלטה משפר את עומק זיהוי החלבונים?
דבר זה עשוי לתרום לשיפור עומק הזיהוי כאשר פירוק הדגימה או החזרתה למצב מסיס מהווים גורם מגביל. ההשפעה תלויה בסוג הדגימה, בהרכב הכימי של החלבונים, באסטרטגיית הטיהור, בתנאי העיכול ובביצועי שיטת ה-LC-MS/MS.
מה יש לייעל לפני שמשתמשים בתהליך העבודה באופן שגרתי?
הפרמטרים העיקריים כוללים: הזנת הדגימה, הרכב המאגר או הממס, פורמט הצלחת, משרעת האולטרה-סאונד ומשך הפעולה, תנאי הייבוש, נפח העיכול, ריכוז האנזים, זמן הדגירה וכמות ההזרקה ל-LC-MS/MS. מומלץ לבצע בדיקות פיילוט לפני יישום תהליך העבודה על סדרת ניסויים מלאה.
האם ניתן להשתמש בתהליך עבודה זה במסגרת פרוטאומיקה של DIA?
כן. תהליך העבודה של EV המוזכר השתמש בשיטת איסוף נתונים בלתי תלויה בנתונים (DIA), ולאחר מכן בניתוח DIA-NN. טיפול באולטרסאונד של מיקרו-פלטה הוא חלק מתהליך הכנת הדגימה המוקדם, וניתן לשלב אותו עם שיטות DIA, DDA או שיטות פרוטאומיקה ממוקדת.
אילו מדדי בקרת איכות יש לעקוב אחריהם?
מדדי בקרת איכות מומלצים כוללים: תפוקת פפטידים, מספר הפפטידים וקבוצות החלבונים שזוהו, שיעור החיתוכים החסרים, התפלגות אורך הפפטידים, צורת הפס הכרומטוגרפי, יציבות זמן השמירה, מקדם השונות בין חזרות, העברה בין דגימות, והפרדת קבוצות ביולוגיות באמצעות ניתוח מרכיבים עיקריים (PCA) או שיטות דומות.
מהו היתרון העיקרי של שילוב דגמי הסוניקטור למיקרו-פלטה UIP400MTP או UIP550MTP בתהליך הכנת הדגימות לפרוטאומיקה?
היתרון העיקרי הוא עיבוד מקביל ותקני של דגימות בנפח קטן. הדבר מסייע למעבדות לצמצם את השונות הנובעת מעבודה ידנית ולהכין דגימות ביולוגיות מורכבות באופן עקבי יותר לקראת העיכול, איסוף הנתונים ב-LC-MS/MS וניתוח פרוטאומיקה כמותית.
ניתן לשלב את מכשירי הסוניקציה למיקרו-פלטה של Hielscher בצורה חלקה בתהליכי עבודה אוטומטיים.
ספרות / מקורות
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics מייצרת הומוגנייזרים קוליים בעלי ביצועים גבוהים מ המעבדה ל גודל תעשייתי.