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Lyse Ultrasonique: Désintegration Cellulaire & Extraction

La désintégration ou lyse cellulaire est une partie courante de la préparation quotidienne des échantillons dans les laboratoires de biotechnologie. Le but de la lyse est de perturber des parties de la paroi cellulaire ou la cellule entière pour libérer des molécules biologiques. Le lysat peut être constitué par exemple de plasmide, de tests de récepteurs, de protéines, d'ADN, d'ARN, etc. Les étapes suivantes de la lyse sont le fractionnement, l'isolement des organelles et/ou l'extraction et la purification des protéines. Le matériau extrait (= lysat) doit être séparé et fait l'objet de recherches ou d'applications complémentaires, par exemple pour la recherche protéomique. Les homogénéisateurs ultrasoniques sont un outil courant pour une lyse cellulaire réussie. Comme l'intensité ultrasonore peut être nivelée en ajustant les paramètres du procédé, l'intensité de sonication optimale, de très douce à très dure, peut être réglée individuellement pour chaque substance et chaque milieu afin de répondre aux besoins spécifiques de l'application.

Structure cellulaire

Les cellules sont protégées par une membrane plasmique semi-perméable qui consiste en une bicouche phospho-lipidique (également bicouche protéine-lipidique ; formée par des lipides hydrophobes et des molécules de phosphore hydrophiles avec des molécules de protéines intégrées) et crée une barrière entre l'intérieur des cellules (cytoplasme) et le milieu extracellulaire. Les cellules végétales et procaryotes sont entourées d'une paroi cellulaire. Les cellules végétales sont plus difficiles à lyser que les cellules animales en raison de l'épaisseur de la paroi cellulaire de la cellulose et de ses multiples couches. L'intérieur des cellules, comme les organites, le noyau, la mitochondrie, est stabilisé par le cytosquelette.
En lysant les cellules, il vise à extraire et à séparer les organites, protéines, ADN, ARNm ou autres biomolécules.

Les ultrasons sont un outil couramment utilisé pour la préparation des échantillons de matière cellulaire.

Fig. 1 : Extraction ultrasonore de cellules : la coupe transversale microscopique (TS) de la tige apicale de menthe (Mentha piperita) montre le mécanisme d'action lors de l'extraction ultrasonore de cellules (grossissement 2000x)[ressource : Vilkhu et al. 2011].

Méthodes

Il existe plusieurs méthodes pour lyser les cellules, qui peuvent être divisées en méthodes mécaniques et chimiques, qui comprennent l'utilisation de détergents ou de solvants, l'application de haute pression, ou l'utilisation d'un moulin à billes ou d'une presse française. L'inconvénient le plus problématique de ces méthodes est la difficulté de contrôler et d'ajuster les paramètres du procédé et donc l'impact.
Les principaux inconvénients des méthodes de lyse courantes :

Différentes techniques de lyse

Table : Les méthodes classiques de lyse cellulaire présentent des inconvénients majeurs

Au contraire, la sonication est un outil très efficace et fiable pour la désintégration cellulaire qui permet un contrôle complet des paramètres de sonication. Ceci assure une grande sélectivité sur la libération des matériaux et la pureté du produit. Balasundaram et al. 2009] Il convient à tous les types de cellules et est facilement applicable à petite et grande échelle. Les ultrasons sont faciles à nettoyer. Un homogénéisateur ultrasonique dispose toujours d'une fonction de nettoyage sur place (CIP) et de stérilisation en place (SIP). La sonotrode consiste en une corne massive en titane qui peut être essuyée ou rincée à l'eau ou au solvant (selon le milieu de travail). La maintenance des ultrasons est due à leur robustesse presque négligeable.

lyse

La lyse est un processus sensible. Pendant la lyse, la protection de la membrane cellulaire est détruite, mais l'inactivation, la dénaturation et la dégradation des protéines extraites par un environnement non physiologique (déviation du pH) doivent être évitées. C'est pourquoi, en général, la lyse est effectuée dans une solution tampon. La plupart des difficultés proviennent d'une perturbation cellulaire incontrôlée entraînant une libération non ciblée de tout le matériel intracellulaire ou/et la dénaturation du produit cible.

La lyse cellulaire par ultrasons peut être utilisée pour la préparation des échantillons en laboratoire et pour la production de grands volumes. Cliquez pour agrandir !

Fig. 1 : Puissant homogénéisateur ultrasonique de 200 watts UP200Ht avec commande numérique et enregistrement automatique des données pour une lyse cellulaire fiable et reproductible.

Lyse ultrasonique

En général, la lyse des échantillons en laboratoire dure entre 15 secondes et 2 minutes. Comme l'intensité de la sonication est très facile à régler en réglant l'amplitude du temps de sonication ainsi qu'en choisissant le bon équipement, il est possible de perturber les membranes cellulaires très doucement ou très brusquement, selon la structure cellulaire et le but de la lyse (par exemple, l'extraction d'ADN nécessite une sonication plus douce, une extraction complète des protéines des bactéries nécessite un traitement plus intense par ultrason). La température pendant le processus peut être surveillée par un capteur de température intégré et peut être facilement contrôlée par refroidissement (bain de glace ou cellules à circulation avec chemises de refroidissement) ou par sonication en mode pulsé. Pendant la sonication en mode pulsé, de courts cycles de salves de sonication d'une durée de 1 à 15 secondes permettent la dissipation de la chaleur et le refroidissement pendant les périodes intermittentes les plus longues.
Tous les processus pilotés par ultrasons sont entièrement reproductibles et linéaires.

Homogénéisateur ultrasonique VialTweeter pour la préparation simultanée d'échantillons jusqu'à 10 tubes à essai. (Cliquez pour agrandir !)

L'appareil à ultrasons VialTweeter permet de préparer simultanément jusqu'à 10 flacons dans les mêmes conditions de process.

homogénéisateurs ultrasoniques

Différents types de dispositif à ultrasons permettent d'atteindre l'objectif de préparation de l'échantillon et d'assurer la convivialité et le confort d'utilisation. Les ultrasoniseurs à sonde sont les appareils les plus répandus dans le laboratoire. Ils sont particulièrement adaptés à la préparation d'échantillons de petite et moyenne taille avec des volumes de 0,1mL à 1000mL. Différentes puissances et sonotrodes permettent d'adapter l'ultrasoniseur au volume de l'échantillon et à la cuve pour des résultats de sonication plus efficaces et plus efficients. La sonde à ultrasons est le meilleur choix lorsque des échantillons individuels doivent être préparés.

S'il faut préparer plus d'échantillons, par exemple 8 flacons de solution cellulaire, des appareils tels que le VialTweeter ou un cuphorn ultrasonique sont les homogénéisateurs les plus appropriés pour la lyse. Plusieurs flacons sont soniqués en même temps, à la même intensité. Cela permet non seulement de gagner du temps, mais aussi d'assurer le même traitement de tous les échantillons, ce qui rend les résultats fiables et comparables entre les échantillons. De plus, la contamination croisée par immersion de la sonotrode ultrasonore (également connue sous le nom de sonde ultrasonore, cornet, pointe ou doigt) est évitée. L'utilisation de flacons permet d'éviter le nettoyage fastidieux et la perte d'échantillons due à la décantation des récipients.
Pour des volumes plus importants, par exemple pour la production commerciale d'extraits de cellules, les systèmes à ultrasons continus avec un réacteur à cellules à écoulement sont les plus appropriés. Le flux continu et régulier du matériau traité assure une sonication uniforme. Tous les paramètres du processus de désintégration par ultrasons peuvent être optimisés et adaptés aux exigences de l'application et du matériau cellulaire spécifique.

Procédure exemplaire pour la lyse ultrasonique de cellules bactériennes :

  1. Préparation de la suspension cellulaire : Les pastilles cellulaires doivent être complètement mises en suspension dans une solution tampon par homogénéisation (choisissez votre solution tampon compatible avec l'analyse suivante, par exemple, une méthode de chromatographie spécifique). Ajouter des lysozymes et/ou d'autres additifs si nécessaire (ils doivent également être compatibles avec les moyens de séparation/épuration). Mélanger/ homogénéiser la solution doucement sous sonication légère jusqu'à l'obtention d'une suspension complète.
  2. Lyse ultrasonique : Placer l'échantillon dans un bain glacé. Pour perturber les cellules, soniquez la suspension à des salves de 60 à 90 secondes (à l'aide du mode pulsé de votre ultrasonateur).
  3. Séparation : Centrifuger le lysat (p. ex. 10 min à 10 000 x g ; à 4degC). Séparer soigneusement le surnageant du culot cellulaire. Le surnageant est le lysat cellulaire total. Après filtration du surnageant, on obtient un liquide clarifié de la protéine cellulaire soluble.



Les applications les plus courantes des ultrasons en biologie et biotechnologie sont :

  • Préparation d'extraits cellulaires
  • Perturbation de levure, de bactéries, de cellules végétales, de cellules molles & tissu cellulaire dur, matière nucléique
  • Extraction de protéines
  • Préparation et isolement d'enzymes
  • Production d'antigènes
  • Extraction d'ADN et/ou fragmentation ciblée
  • préparation de liposomes
Les homogénéisateurs à ultrasons de haute puissance comme l'UIP1000hd sont utilisés pour la désagrégation et l'extraction des cellules en mode batch ou en continu. (Cliquez pour agrandir !)

Les systèmes de paillasse à ultrasons tels que le UIP1000hd (1 kW) peut traiter des volumes plus importants de matériel biologique.

Les multiples applications de l'échographie s'étendent aux secteurs de la biotechnologie, de la bio-ingénierie, de la microbiologie, de la biologie moléculaire, de la biochimie, de l'immunologie, de la bactériologie, de la virologie, de la protéomique, de la génétique, de la physiologie, de la biologie cellulaire, de l'hématologie, de la botanique.

Pour l'évaluation et l'optimisation des applications de ses clients, Hielscher Ultrasonics propose une gamme complète d'équipements Laboratoire de traitement par ultrasons. N'hésitez pas à nous contacter pour plus d'informations !

Littérature/Références

  • Balasundaram, B. ; Harrison, S. ; Bracewell, D. G. (2009) : Progrès dans les stratégies de mise en circulation des produits et impact sur la conception des bioprocédés. Tendances en biotechnologie 27/8, 2009. pp. 477-485.
  • Vilkhu, K. ; Manasseh, R. ; Mawson, R. ; Ashokkkumar, M. (2011) : Récupération et modification par ultrasons des ingrédients alimentaires. In : Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011) : Technologies ultrasonores pour l'alimentation et la biotransformation. New York : Springer, 2011. pp. 345-368.

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