Sonication pour la lyse cellulaire : Perturbation et extraction des cellules
La lyse cellulaire par ultrasons est une procédure de préparation d'échantillons dans les laboratoires de biotechnologie. L'objectif est de désagréger les parois cellulaires ou les cellules entières afin de libérer les molécules biologiques. La sonication est couramment utilisée pour la lyse cellulaire, la désintégration des cellules et l'extraction. Le principal avantage des sonicateurs pour la lyse cellulaire réside dans le contrôle précis des paramètres du processus, tels que l'intensité et la température, ce qui permet une désintégration et une extraction des cellules à la fois douces et efficaces.
Lyse cellulaire par ultrasons
La lyse cellulaire par ultrasons utilise des ondes sonores à haute fréquence pour ouvrir les cellules et en extraire le contenu. La sonication est reconnue et fiable pour la désintégration des cellules et l'extraction du matériel intracellulaire, tel que les plasmides, les tests de récepteurs, les protéines, l'ADN et l'ARN. En ajustant les paramètres du processus, l'intensité des ultrasons peut être finement réglée pour répondre aux exigences spécifiques de l'application, allant d'une sonication douce à une sonication intense. Les étapes suivant la lyse comprennent le fractionnement, l'isolement des organites, l'extraction et la purification des protéines. Le lysat obtenu doit être séparé pour d'autres recherches ou applications, telles que la recherche protéomique.
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Homogénéisateurs à ultrasons UP100H (100 watts) et UP400St (400 watts) : Sonication pour la lyse cellulaire et l'extraction.
Avantages de l'utilisation de la sonication pour la lyse cellulaire
Comparée à d'autres méthodes de lyse et d'extraction cellulaires, la lyse cellulaire par ultrasons présente plusieurs avantages :
- Vitesse : La lyse et l'extraction cellulaire par ultrasons est une méthode rapide qui permet d'ouvrir les cellules en quelques secondes. Cette méthode est beaucoup plus rapide que d'autres méthodes telles que l'homogénéisation, la congélation-décongélation ou le broyage de billes.
- Efficacité : La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons peuvent être utilisées pour traiter des échantillons de petite taille, de grande taille ou multiples en une seule fois, ce qui les rend plus efficaces que d'autres méthodes qui nécessitent le traitement individuel de petits échantillons.
- Sans produits chimiques: La lyse et l'extraction cellulaire par ultrasons est une méthode non invasive qui ne nécessite pas l'utilisation de produits chimiques ou d'enzymes agressifs. Elle est donc idéale pour les applications où l'intégrité du contenu cellulaire doit être préservée. La contamination indésirable des échantillons peut être évitée.
- Rendement élevé : La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons permettent d'extraire un grand nombre de contenus cellulaires, notamment l'ADN, l'ARN et les protéines. En effet, les ondes sonores à haute fréquence brisent les parois cellulaires et libèrent le contenu dans la solution environnante.
- Contrôle de la température : Les sonificateurs sophistiqués permettent un contrôle précis de la température de l'échantillon. Les sonicateurs numériques Hielscher sont équipés d'un capteur de température enfichable et d'un logiciel de contrôle de la température.
- Reproductible : Les protocoles de lyse cellulaire par ultrasons peuvent être facilement reproduits et même adaptés à des volumes d'échantillons différents, plus grands ou plus petits, par une simple mise à l'échelle linéaire.
- Polyvalent : La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons peuvent être utilisées pour extraire un large éventail de types de cellules, y compris les bactéries, les levures, les champignons, les plantes et les cellules de mammifères. Elles permettent également d'extraire différents types de molécules, notamment des protéines, de l'ADN, de l'ARN et des lipides.
- Préparation simultanée de nombreux échantillons : Hielscher Ultrasonics propose plusieurs solutions pour traiter confortablement de nombreux échantillons dans les mêmes conditions. L'étape de préparation des échantillons par lyse et extraction est ainsi très efficace et permet de gagner du temps.
- Facile à utiliser : L'équipement de lyse et d'extraction cellulaire par ultrasons est facile à utiliser et ne nécessite qu'une formation minimale. L'équipement est également économique puisqu'il s'agit d'un investissement unique, sans qu'il soit nécessaire d'en racheter ou d'en disposer. Il est donc intéressant pour un large éventail de chercheurs et de laboratoires.
Dans l'ensemble, la lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons est une méthode rapide, efficace, contrôlable avec précision et polyvalente pour l'extraction des contenus cellulaires. Ses avantages par rapport aux autres méthodes en font un choix intéressant pour un large éventail d'applications industrielles et de recherche.
Principe de fonctionnement de la lyse cellulaire par ultrasons
La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons utilisent des ondes sonores à haute fréquence pour désintégrer les cellules et extraire leur contenu. Les ondes sonores créent des changements de pression dans le liquide environnant, provoquant la formation et l'effondrement de petites bulles dans un processus connu sous le nom de cavitation. Ces bulles génèrent des forces mécaniques localisées très intenses qui peuvent briser les cellules et libérer leur contenu dans la solution environnante.
La lyse cellulaire à l'aide d'un appareil à ultrasons comporte généralement les étapes suivantes :
- L'échantillon est placé dans un tube ou un récipient contenant un tampon liquide.
- Une sonde ultrasonique est insérée dans l'échantillon et des ondes sonores à haute fréquence d'environ 20-30 kHz sont appliquées.
- Les ondes ultrasonores provoquent une oscillation et une cavitation dans le liquide environnant, générant des forces localisées qui ouvrent les cellules et libèrent leur contenu.
- L'échantillon est centrifugé ou filtré pour éliminer les débris cellulaires, et le contenu extrait est collecté pour une analyse en aval.
De puissantes ondes ultrasonores perturbent la matrice cellulaire des structures biologiques et libèrent les composés bioactifs. Le transfert de masse entre le matériel végétal et le solvant (par exemple, le tampon) est intensifié. (graphique : ©Vilkhu et al., 2006)
Inconvénients des méthodes de lyse courantes
Au cours de votre travail en laboratoire, vous avez peut-être déjà été confronté à la difficulté de la lyse cellulaire à l'aide des protocoles traditionnels de lyse mécanique ou chimique.
- Lyse mécanique : Les méthodes de lyse mécanique, telles que le broyage avec un mortier et un pilon ou l'homogénéisation à l'aide d'une presse française, d'un moulin à billes ou d'un système rotor-stator, manquent souvent d'options de contrôle et de réglage précis. Cela signifie que l'utilisation du broyage et de la mouture peut rapidement générer de la chaleur et des forces de cisaillement qui peuvent endommager l'échantillon et dénaturer les protéines. Ils peuvent également prendre beaucoup de temps et nécessiter de grandes quantités de matériel de départ.
- Lyse chimique : Les méthodes de lyse chimique, telles que la lyse à base de détergents, peuvent endommager l'échantillon en perturbant la bicouche lipidique et en dénaturant les protéines. Elles peuvent également nécessiter plusieurs étapes et laisser des contaminants résiduels qui interfèrent avec les applications en aval. Trouver le dosage optimal de détergent est un défi supplémentaire.
- Cycles de congélation-décongélation : Les cycles de congélation-décongélation peuvent provoquer la rupture des membranes cellulaires, mais des cycles répétés peuvent également entraîner la dénaturation et la dégradation des protéines. Cette méthode peut également nécessiter des cycles multiples, ce qui peut prendre du temps et se traduit souvent par des rendements plus faibles.
- Lyse enzymatique : Les méthodes de lyse enzymatique peuvent être spécifiques à certains types de cellules et nécessitent de multiples étapes, ce qui les rend chronophages. Elles génèrent également des déchets et nécessitent une optimisation minutieuse pour éviter la dégradation de l'échantillon. Les kits de lyse enzymatique sont souvent coûteux. Si votre procédure de lyse enzymatique actuelle donne des résultats insuffisants, la sonication peut être appliquée comme méthode synergique pour intensifier la désintégration des cellules.
Contrairement aux méthodes de lyse cellulaire mécaniques et chimiques conventionnelles, la sonication est un outil très efficace et fiable pour la désintégration des cellules, qui permet un contrôle complet des paramètres de sonication. Cela garantit une grande sélectivité dans la libération des matériaux et la pureté du produit. [cf. Balasundaram et al. 2009].
Il convient à tous les types de cellules et est facilement applicable à petite et grande échelle. – toujours dans des conditions contrôlées. Les homogénéisateurs à ultrasons sont faciles à nettoyer. Un homogénéisateur à ultrasons est toujours doté d'une fonction de nettoyage en place (CIP) et de stérilisation en place (SIP). La sonotrode consiste en une corne massive en titane qui peut être nettoyée ou rincée à l'eau ou au solvant (en fonction du milieu de travail). Grâce à leur robustesse, l'entretien des appareils à ultrasons est pratiquement négligeable.
Lyse et perturbation cellulaire par ultrasons
En général, la lyse des échantillons en laboratoire prend entre 15 secondes et 2 minutes. L'intensité de la sonication étant très facile à ajuster par le réglage de l'amplitude et de la durée de sonication ainsi que par le choix de l'équipement approprié, il est possible de perturber les membranes cellulaires très doucement ou très brusquement, en fonction de la structure cellulaire et de l'objectif de la lyse (par exemple, l'extraction de l'ADN nécessite une sonication plus douce, l'extraction complète des protéines des bactéries exige un traitement par ultrasons plus intense). La température pendant le processus peut être surveillée par un capteur de température intégré et peut être facilement contrôlée par refroidissement (bain de glace ou cellules d'écoulement avec chemises de refroidissement) ou par sonication en mode pulsé. Lors de la sonication en mode pulsé, de courts cycles de sonication d'une durée de 1 à 15 secondes permettent la dissipation de la chaleur et le refroidissement pendant les périodes intermittentes plus longues.
Tous les processus basés sur les ultrasons sont entièrement reproductibles et linéairement extensibles.
Le VialTweeter est un homogénéisateur à ultrasons pour la préparation stérile simultanée, uniforme et rapide de nombreux échantillons.
Homogénéisateurs ultrasoniques pour la lyse et l'extraction cellulaires
Différents types d'appareils à ultrasons permettent de répondre à l'objectif de préparation des échantillons et d'assurer la convivialité et le confort d'utilisation. Les appareils à ultrasons de type sonde sont les plus courants dans les laboratoires. Ils conviennent le mieux à la préparation d'échantillons de petite et moyenne taille avec des volumes allant de 0,1 ml à 1 000 ml. Différentes puissances et sonotrodes permettent d'adapter l'ultrasoniseur au volume de l'échantillon et au récipient pour obtenir les résultats de sonification les plus efficaces et les plus performants. L'appareil à sonde ultrasonique est le meilleur choix lorsque des échantillons individuels doivent être préparés.
Si davantage d'échantillons doivent être préparés, par exemple 8 à 10 flacons de solution cellulaire, une sonication indirecte intense avec des systèmes à ultrasons tels que le VialTweeter ou un cuphorn à ultrasons est la méthode d'homogénéisation la plus appropriée pour une lyse efficace. Plusieurs flacons sont sonifiés en même temps, à la même intensité. Cela permet non seulement de gagner du temps, mais aussi de traiter tous les échantillons de la même manière, ce qui rend les résultats fiables et comparables d'un échantillon à l'autre. En outre, lors de la sonication indirecte, la contamination croisée par immersion de la sonotrode ultrasonique (également connue sous le nom de sonde ultrasonique, cornet, pointe ou doigt) est évitée. L'utilisation de flacons adaptés à la taille de l'échantillon permet d'éviter les nettoyages fastidieux et les pertes d'échantillons dues au transvasement des flacons. Pour la sonication uniforme des plaques multipuits ou microtitres, Hielscher propose l'UIP400MTP.
Pour les volumes plus importants, par exemple pour la production commerciale d'extraits cellulaires, les systèmes ultrasoniques continus équipés d'un réacteur à flux cellulaire sont les mieux adaptés. Le flux continu et régulier de la matière traitée garantit une sonication homogène. Tous les paramètres du processus de désintégration par ultrasons peuvent être optimisés et adaptés aux exigences de l'application et du matériau cellulaire spécifique.
Procédure exemplaire de lyse ultrasonique de cellules bactériennes :
- Préparation de la suspension cellulaire : Les culots cellulaires doivent être complètement suspendus dans une solution tampon par homogénéisation (choisir une solution tampon compatible avec l'analyse suivante, par exemple une méthode de chromatographie spécifique). Ajouter les lysozymes et/ou d'autres additifs, si nécessaire (ils doivent également être compatibles avec les moyens de séparation/ purification). Mélanger/ homogénéiser la solution doucement sous sonication douce jusqu'à obtention d'une suspension complète.
- Lyse ultrasonique : Placer l'échantillon dans un bain de glace. Pour désagréger les cellules, soniquer la suspension par salves de 60 à 90 secondes (en utilisant le mode pulsé de votre sonicateur).
- Séparation : Centrifuger le lysat (par exemple, 10 minutes à 10 000 x g ; à 4°C). Séparer soigneusement le surnageant du culot cellulaire. Le surnageant est le lysat cellulaire total. Après filtration du surnageant, on obtient un liquide clarifié de la protéine cellulaire soluble.
Les applications les plus courantes des ultrasons en biologie et en biotechnologie sont les suivantes :
- Préparation de l'extrait cellulaire
- Perturbation des levures, des bactéries, des cellules végétales, des tissus cellulaires mous ou durs, du matériel nucléique
- Extraction des protéines
- Préparation et isolement des enzymes
- Production d'antigènes
- Extraction d'ADN et/ou fragmentation ciblée
- Préparation de liposomes
La désintégration des cellules à l'aide d'un appareil à ultrasons de type sonde est une méthode efficace de préparation des échantillons.
Le tableau ci-dessous vous donne un aperçu de nos homogénéisateurs à ultrasons pour la désintégration et l'extraction de cellules. Cliquez sur le type d'appareil pour obtenir plus d'informations sur chaque homogénéisateur à ultrasons. Notre personnel technique bien formé et expérimenté se fera un plaisir de vous aider à choisir l'appareil à ultrasons le mieux adapté à vos échantillons !
| Volume du lot | Débit | Dispositifs recommandés |
|---|---|---|
| jusqu'à 10 flacons ou tubes | n.d. | VialTweeter |
| plaques multi-puits / microtitres | n.d. | UIP400MTP |
| tubes / récipients multiples | n.d. | CupHorn |
| 1 à 500mL | 10 à 200mL/min | UP100H |
| 10 à 1000mL | 20 à 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 à 2000mL | 20 à 400mL/min | UP400St |
Les multiples applications des ultrasons s'étendent aux secteurs de la biotechnologie, de la bio-ingénierie, de la microbiologie, de la biologie moléculaire, de la biochimie, de l'immunologie, de la bactériologie, de la virologie, de la protéomique, de la génétique, de la physiologie, de la biologie cellulaire, de l'hématologie et de la botanique.
La lyse : Rupture des structures cellulaires
Les cellules sont protégées par une membrane plasmique semi-perméable qui consiste en une bicouche phospho-lipidique (ou bicouche protéino-lipidique ; formée de lipides hydrophobes et de molécules de phosphore hydrophiles avec des molécules de protéines intégrées) et qui crée une barrière entre l'intérieur de la cellule (cytoplasme) et l'environnement extracellulaire. Les cellules végétales et les cellules procaryotes sont entourées d'une paroi cellulaire. En raison des multiples couches épaisses de cellulose de la paroi cellulaire, les cellules végétales sont plus difficiles à lyser que les cellules animales. L'intérieur de la cellule, comme les organites, le noyau, la mitochondrie, est stabilisé par le cytosquelette.
En lysant les cellules, on cherche à extraire et à séparer les organites, les protéines, l'ADN, l'ARNm ou d'autres biomolécules.
Méthodes conventionnelles de lyse cellulaire et leurs inconvénients
Il existe plusieurs méthodes pour lyser les cellules, qui peuvent être divisées en méthodes mécaniques et chimiques, qui comprennent l'utilisation de détergents ou de solvants, l'application d'une pression élevée, ou l'utilisation d'un moulin à billes ou d'une presse française. L'inconvénient le plus problématique de ces méthodes est la difficulté de contrôler et d'ajuster les paramètres du processus et donc l'impact.
Le tableau ci-dessous présente les principaux inconvénients des méthodes de lyse les plus courantes :
Tableau : Les méthodes conventionnelles de lyse cellulaire présentent des inconvénients majeurs
Procédure de lyse
La lyse est un processus délicat. Pendant la lyse, la protection de la membrane cellulaire est détruite, mais il faut éviter l'inactivation, la dénaturation et la dégradation des protéines extraites dans un environnement non physiologique (écart par rapport à la valeur du pH). C'est pourquoi, en général, la lyse est effectuée dans une solution tampon. La plupart des difficultés proviennent d'une perturbation cellulaire incontrôlée entraînant une libération non ciblée de tout le matériel intracellulaire et/ou la dénaturation du produit cible.
Questions fréquemment posées sur la sonication et la lyse cellulaire
- Peut-on lyser les cellules par sonication ? Oui, la sonication permet de lyser efficacement les cellules en utilisant des ondes ultrasoniques à haute fréquence qui induisent la cavitation, un phénomène au cours duquel de minuscules bulles de vapeur se forment et s'effondrent violemment à l'intérieur de la suspension cellulaire. Les forces mécaniques qui en résultent perturbent les membranes cellulaires et facilitent la libération des composants intracellulaires dans le liquide.
- Comment utiliser un sonicateur pour la lyse cellulaire ? L'utilisation d'un sonicateur pour la lyse cellulaire implique l'immersion de la sonde du sonicateur dans une suspension cellulaire et le réglage de paramètres tels que l'amplitude et la durée de l'impulsion. Le processus doit être étroitement surveillé afin d'optimiser la désintégration des cellules tout en minimisant la dénaturation des protéines et l'inactivation des enzymes.
- Quel est le principe de la sonication pour la lyse cellulaire ? La sonication fonctionne sur le principe de la cavitation acoustique. L'énergie ultrasonique est transmise au milieu liquide, provoquant des fluctuations rapides de pression qui entraînent la formation et l'implosion de microbulles. Ces implosions génèrent des forces de cisaillement intenses et des températures élevées localisées, perturbant les structures cellulaires et améliorant l'homogénéité du lysat.
- Combien de temps dure la sonication pour la lyse cellulaire ? La durée de la sonication pour la lyse cellulaire peut varier considérablement en fonction de facteurs tels que le type de cellule, la densité cellulaire, la puissance du sonicateur et le protocole spécifique utilisé. Les procédures typiques peuvent durer de quelques secondes à quelques minutes, et sont souvent effectuées en cycles pour gérer la production de chaleur et assurer une désintégration uniforme des cellules.
- Quel est l'objectif de la sonication dans l'extraction des protéines ? Dans l'extraction des protéines, la sonication permet de rompre efficacement les membranes cellulaires et de solubiliser les protéines. Cette méthode est particulièrement utile pour libérer les protéines des compartiments cellulaires, ce qui la rend essentielle pour préparer les lysats à partir desquels les protéines doivent être purifiées ou analysées.
- Pourquoi la sonication est-elle utilisée pour l'extraction ? La sonication est privilégiée pour l'extraction en raison de son action rapide et de sa capacité à appliquer une énergie ciblée, décomposant les structures cellulaires pour libérer les molécules bioactives sans recourir à des traitements chimiques agressifs, préservant ainsi l'intégrité fonctionnelle des composés extraits.
- La sonication perturbe-t-elle les interactions protéine-protéine ? Si la sonication peut perturber efficacement les membranes cellulaires, elle peut également perturber les interactions protéine-protéine. Le niveau de perturbation dépend de l'intensité de la sonication et de la durée d'exposition, ce qui peut conduire à la dénaturation ou à la dissociation des complexes protéiques, ce qui peut affecter les études analytiques ou fonctionnelles ultérieures.
- La sonication peut-elle être utilisée pour lyser E. coli ? Les sonicateurs Hielscher sont particulièrement efficaces pour lyser les cellules bactériennes telles que E. coli, dont les parois cellulaires sont robustes. La technique fournit une méthode physique pour cisailler la paroi cellulaire et la membrane, ce qui en fait une méthode privilégiée pour préparer les lysats bactériens dans les laboratoires de biologie moléculaire et de biochimie.
Littérature/références
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.