Sonication pour la lyse : Perturbation et extraction des cellules

La désintégration ou la lyse cellulaire fait partie de la préparation quotidienne des échantillons dans les laboratoires de biotechnologie. L'objectif de la lyse est de désagréger des parties de la paroi cellulaire ou la cellule entière afin de libérer des molécules biologiques. Les homogénéisateurs à ultrasons sont largement utilisés pour réussir la lyse cellulaire. Le principal avantage des homogénéisateurs à ultrasons sophistiqués est le contrôle précis des paramètres du processus, tels que l'intensité et la température, qui permet une désintégration et une extraction cellulaires douces, mais très efficaces.

Lyse cellulaire par ultrasons

La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons est une méthode utilisée pour briser les cellules et en extraire le contenu à l'aide d'ondes sonores à haute fréquence, c'est-à-dire des ultrasons. La sonication est une technique de lyse largement utilisée comme méthode établie et fiable de désintégration des cellules et d'extraction du matériel intracellulaire. La lyse ultrasonique est une technique fiable pour préparer des lysats contenant par exemple des plasmides, des tests de récepteurs, des protéines, de l'ADN, de l'ARN, etc. Comme l'intensité des ultrasons peut être nivelée en ajustant les paramètres du processus, l'intensité optimale de la sonication, de très douce à intense, peut être réglée individuellement pour chaque substance et chaque milieu afin de répondre aux exigences spécifiques de l'application. Les étapes suivantes de la lyse sont le fractionnement, l'isolement des organites et/ou l'extraction et la purification des protéines. Le matériel extrait (= lysat) doit être séparé et fait l'objet d'études ou d'applications ultérieures, par exemple pour la recherche protéomique.

Comparée à d'autres méthodes de lyse et d'extraction cellulaires, la lyse cellulaire par ultrasons présente plusieurs avantages :

1. Vitesse : La lyse et l'extraction cellulaire par ultrasons est une méthode rapide qui permet d'ouvrir les cellules en quelques secondes. Cette méthode est beaucoup plus rapide que d'autres méthodes telles que l'homogénéisation, la congélation-décongélation ou le broyage de billes.
2. Efficacité: La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons peuvent être utilisées pour traiter des échantillons de petite taille, de grande taille ou multiples en une seule fois, ce qui les rend plus efficaces que d'autres méthodes qui nécessitent le traitement individuel de petits échantillons.
3. Sans produits chimiques: La lyse et l'extraction cellulaire par ultrasons est une méthode non invasive qui ne nécessite pas l'utilisation de produits chimiques ou d'enzymes agressifs. Elle est donc idéale pour les applications où l'intégrité du contenu cellulaire doit être préservée. La contamination indésirable des échantillons peut être évitée.
4. Rendement élevé : La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons permettent d'extraire un grand nombre de contenus cellulaires, notamment l'ADN, l'ARN et les protéines. En effet, les ondes sonores à haute fréquence brisent les parois cellulaires et libèrent le contenu dans la solution environnante.
5. Contrôle de la température: Les ultrasons sophistiqués permettent un contrôle précis de la température de l'échantillon. Les appareils numériques à ultrasons Hielscher sont équipés d'un capteur de température enfichable et d'un logiciel de contrôle de la température.
6. Reproductible : Les protocoles de lyse cellulaire par ultrasons peuvent être facilement reproduits et même adaptés à des volumes d'échantillons différents, plus grands ou plus petits, par une simple mise à l'échelle linéaire.
7. Polyvalent : La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons peuvent être utilisées pour extraire un large éventail de types de cellules, y compris les bactéries, les levures, les champignons, les plantes et les cellules de mammifères. Elles permettent également d'extraire différents types de molécules, notamment des protéines, de l'ADN, de l'ARN et des lipides.
8. Préparation simultanée de nombreux échantillons : Hielscher Ultrasonics propose plusieurs solutions pour traiter confortablement de nombreux échantillons dans les mêmes conditions. L'étape de préparation des échantillons par lyse et extraction est ainsi très efficace et permet de gagner du temps.
9. Facile à utiliser : L'équipement de lyse et d'extraction cellulaire par ultrasons est facile à utiliser et ne nécessite qu'une formation minimale. L'équipement est également économique puisqu'il s'agit d'un investissement unique, sans qu'il soit nécessaire d'en racheter ou d'en disposer. Il est donc intéressant pour un large éventail de chercheurs et de laboratoires.

Dans l'ensemble, la lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons est une méthode rapide, efficace, contrôlable avec précision et polyvalente pour l'extraction des contenus cellulaires. Ses avantages par rapport aux autres méthodes en font un choix intéressant pour un large éventail d'applications industrielles et de recherche.

Principe de fonctionnement de la lyse cellulaire ultrasonique

La lyse et l'extraction cellulaires par ultrasons utilisent des ondes sonores à haute fréquence pour désintégrer les cellules et extraire leur contenu. Les ondes sonores créent des changements de pression dans le liquide environnant, provoquant la formation et l'effondrement de petites bulles dans un processus connu sous le nom de cavitation. Ces bulles génèrent des forces mécaniques localisées très intenses qui peuvent briser les cellules et libérer leur contenu dans la solution environnante.

La lyse cellulaire à l'aide d'un appareil à ultrasons comporte généralement les étapes suivantes :

• L'échantillon est placé dans un tube ou un récipient contenant un tampon liquide.
• Une sonde ultrasonique est insérée dans l'échantillon et des ondes sonores à haute fréquence d'environ 20-30 kHz sont appliquées.
• Les ondes ultrasonores provoquent une oscillation et une cavitation dans le liquide environnant, générant des forces localisées qui ouvrent les cellules et libèrent leur contenu.
• L'échantillon est centrifugé ou filtré pour éliminer les débris cellulaires, et le contenu extrait est collecté pour une analyse en aval.

De puissantes ondes ultrasonores perturbent la matrice cellulaire des structures biologiques et libèrent les composés bioactifs. Le transfert de masse entre le matériel végétal et le solvant (par exemple, le tampon) est intensifié. (graphique : ©Vilkhu et al., 2006)

Inconvénients des méthodes de lyse courantes

Au cours de votre travail en laboratoire, vous avez peut-être déjà été confronté à la difficulté de la lyse cellulaire à l'aide des protocoles traditionnels de lyse mécanique ou chimique.

• Lyse mécanique : Les méthodes de lyse mécanique, telles que le broyage avec un mortier et un pilon ou l'homogénéisation à l'aide d'une presse française, d'un moulin à billes ou d'un système rotor-stator, manquent souvent d'options de contrôle et de réglage précis. Cela signifie que l'utilisation du broyage et de la mouture peut rapidement générer de la chaleur et des forces de cisaillement qui peuvent endommager l'échantillon et dénaturer les protéines. Ils peuvent également prendre beaucoup de temps et nécessiter de grandes quantités de matériel de départ.
• Lyse chimique : Les méthodes de lyse chimique, telles que la lyse à base de détergents, peuvent endommager l'échantillon en perturbant la bicouche lipidique et en dénaturant les protéines. Elles peuvent également nécessiter plusieurs étapes et laisser des contaminants résiduels qui interfèrent avec les applications en aval. Trouver le dosage optimal de détergent est un défi supplémentaire.
• Cycles de congélation-décongélation : Les cycles de congélation-décongélation peuvent provoquer la rupture des membranes cellulaires, mais des cycles répétés peuvent également entraîner la dénaturation et la dégradation des protéines. Cette méthode peut également nécessiter des cycles multiples, ce qui peut prendre du temps et se traduit souvent par des rendements plus faibles.
• Lyse enzymatique : Les méthodes de lyse enzymatique peuvent être spécifiques à certains types de cellules et nécessitent plusieurs étapes, ce qui les rend chronophages. Elles génèrent également des déchets et nécessitent une optimisation minutieuse pour éviter la dégradation de l'échantillon. Les kits de lyse enzymatique sont souvent coûteux. Si votre procédure de lyse enzymatique actuelle donne des résultats insuffisants, la sonication peut être appliquée comme méthode synergique pour intensifier la désintégration des cellules.

Contrairement aux méthodes de lyse cellulaire mécaniques et chimiques conventionnelles, la sonication est un outil très efficace et fiable pour la désintégration des cellules, qui permet un contrôle complet des paramètres de sonication. Cela garantit une grande sélectivité dans la libération des matériaux et la pureté du produit. [cf. Balasundaram et al. 2009].
Il convient à tous les types de cellules et est facilement applicable à petite et grande échelle. – toujours dans des conditions contrôlées. Les homogénéisateurs à ultrasons sont faciles à nettoyer. Un homogénéisateur à ultrasons est toujours doté d'une fonction de nettoyage en place (CIP) et de stérilisation en place (SIP). La sonotrode consiste en une corne massive en titane qui peut être nettoyée ou rincée à l'eau ou au solvant (en fonction du milieu de travail). Grâce à leur robustesse, l'entretien des appareils à ultrasons est pratiquement négligeable.

Lyse ultrasonique et perturbation cellulaire

Généralement, la lyse des échantillons en laboratoire prendra entre 15 secondes et 2 minutes. Comme l'intensité de la sonication est très facile à régler en réglant l'amplitude du temps de sonication et en choisissant le bon équipement, il est possible de perturber très doucement ou très brusquement les membranes cellulaires en fonction de la structure cellulaire et du but de la lyse ( par exemple, l'extraction de l'ADN nécessite une sonication plus douce, l'extraction complète des protéines de bactéries nécessite un traitement par ultrasons plus intense). La température pendant le processus peut être surveillée par un capteur de température intégré et peut être facilement contrôlée par refroidissement (bain de glace ou cellules de circulation avec des chemises de refroidissement) ou par sonication en mode pulsé. Au cours de la sonication en mode impulsionnel, des cycles d'éclatement courts de sonication d'une durée de 1 à 15 secondes permettent la dissipation de la chaleur et le refroidissement pendant les périodes intermittentes plus longues.
Tous les processus pilotés par ultrasons sont totalement reproductible et linéaire évolutive.

Homogénéisateurs ultrasoniques pour la lyse et l'extraction cellulaires

Différents types d'appareils à ultrasons permettent de répondre à l'objectif de préparation des échantillons et d'assurer la convivialité et le confort d'utilisation. Les appareils à ultrasons de type sonde sont les plus courants dans les laboratoires. Ils conviennent le mieux à la préparation d'échantillons de petite et moyenne taille avec des volumes allant de 0,1 ml à 1 000 ml. Différentes puissances et sonotrodes permettent d'adapter l'ultrasoniseur au volume de l'échantillon et au récipient pour obtenir les résultats de sonification les plus efficaces et les plus performants. L'appareil à sonde ultrasonique est le meilleur choix lorsque des échantillons individuels doivent être préparés.

Si davantage d'échantillons doivent être préparés, par exemple 8 à 10 flacons de solution cellulaire, une sonication indirecte intense avec des systèmes à ultrasons tels que le VialTweeter ou un cuphorn à ultrasons est la méthode d'homogénéisation la plus appropriée pour une lyse efficace. Plusieurs flacons sont sonifiés en même temps, à la même intensité. Cela permet non seulement de gagner du temps, mais aussi de traiter tous les échantillons de la même manière, ce qui rend les résultats fiables et comparables d'un échantillon à l'autre. En outre, lors de la sonication indirecte, la contamination croisée par immersion de la sonotrode ultrasonique (également connue sous le nom de sonde ultrasonique, cornet, pointe ou doigt) est évitée. L'utilisation de flacons adaptés à la taille de l'échantillon permet d'éviter les nettoyages fastidieux et les pertes d'échantillons dues au transvasement des flacons. Pour la sonication uniforme des plaques multipuits ou microtitres, Hielscher propose l'UIP400MTP.
Pour des volumes plus élevés, par exemple pour la production commerciale d'extraits cellulaires, des systèmes à ultrasons en continu avec un réacteur à cuve à circulation sont les plus appropriés. Le flux continu et uniforme de la matière traitée assure une sonication même. Tous les paramètres du processus de désintégration par ultrasons peuvent être optimisés et adaptés aux besoins de l'application et le matériau cellulaire spécifique.
 
 
exemple de procédure lytique par ultrasons des cellules bactériennes:

• Préparation de la suspension de cellules: des pastilles cellulaires doivent être complètement mises en suspension dans une solution tampon en homogénéisant (choisir une solution tampon compatible avec l'analyse ci-après, par exemple la méthode de chromatographie en particulier). Ajouter lysozyme et / ou d'autres additifs, en cas de besoin (ils doivent aussi être compatibles avec des moyens de séparation / purification). Mélanger / homogénéiser la solution doucement sous sonication douce jusqu'à ce que la suspension complète est obtenue.
• lyse par ultrasons: Placer l'échantillon dans un bain de glace. Pour la rupture des cellules, sonication la suspension à 60-90 secondes rafales (en utilisant le mode d'impulsion de votre appareil à ultrasons).
• (. Par exemple 10 min à 10 000 x g, à 4degC): Séparation Centrifuger le lysat. Séparer le surnageant du culot cellulaire soigneusement. Le surnageant est le lysat cellulaire total. Après filtration du surnageant, on obtient un fluide clarifié de la protéine cellulaire soluble.

 
 
Les applications les plus courantes pour ultrasonicators en biologie et la biotechnologie sont:

• préparation d'extrait cellulaire
• Perturbation des levures, des bactéries, des cellules végétales, des tissus cellulaires mous ou durs, du matériel nucléique.
• L'extraction des protéines
• Préparation et isolement d'enzymes
• La production d'antigènes
• l'extraction d'ADN et / ou fragmentation ciblée
• préparation de liposomes