Sonication pour la lyse cellulaire : désintégration cellulaire et extraction
La lyse cellulaire par ultrasons est une technique de préparation des échantillons largement utilisée dans les laboratoires modernes de biotechnologie. Son objectif principal est de désintégrer les membranes cellulaires ou les cellules entières afin de libérer les composants intracellulaires tels que les protéines, les acides nucléiques ou les organites. Dans le travail quotidien au laboratoire, la sonication constitue donc une méthode standard pour la désintégration contrôlée des cellules et l’extraction efficace des biomolécules. Le principal avantage des sonicateurs réside dans leur capacité à moduler précisément les paramètres critiques du procédé, notamment l’intensité des ultrasons, les impulsions et le contrôle de la température. Cette maîtrise permet aux chercheurs d’obtenir une lyse fiable tout en minimisant les dommages thermiques ou mécaniques aux biomolécules sensibles, ce qui se traduit par un procédé d’extraction doux mais très efficace.
Lyse cellulaire à l’aide de sonicateurs
La lyse cellulaire par ultrasons utilise la cavitation acoustique pour désintégrer les membranes cellulaires et libérer les molécules intracellulaires. Hielscher Ultrasonics propose le sonicateur classique à sonde ainsi que des sonicateurs pour plusieurs échantillons permettant un traitement stérile : le VialTweeter pour plusieurs tubes et flacons et le sonicateur pour plaques à 96 puits UIP400MTP pour les microplaques standard.
Hielscher Ultrasonics fournit des sonicateurs sans contact puissants pour la préparation des échantillons et l’analyse clinique. Le sonicateur pour plaques multipuits UIP400MTP, le VialTweeter, le CupHorn et le sonicateur en flux GDmini2 traitent les échantillons dans des conditions stériles.
Homogénéisateurs à ultrasons UP100H (100 watts) et UP400St (400 watts) : sonication pour la lyse cellulaire et l’extraction.
Homogénéisateurs à ultrasons pour la lyse cellulaire et l’extraction
| Type d’appareil à ultrasons | Application principale | Volume d’échantillon | Cas d’utilisation typique | Avantages | Exemples de modèles |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonicateurs à sonde | Sonication d’un seul échantillon | 0,1 mL à ~1000 mL | Lyse cellulaire, extraction de protéines, fragmentation de l’ADN/ARN | Contrôle précis de l’énergie ; diverses sonotrodes ; optimal pour les échantillons de petit à moyen volume | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Traitement en parallèle de plusieurs flacons fermés hermétiquement | 8–10 flacons (~1–20 mL chacun) | Lyse standardisée de plusieurs suspensions cellulaires | Sonication uniforme ; évite la contamination croisée ; résultats reproductibles | VialTweeter, CupHorn |
| Sonicateur pour plaques à 96 puits | Sonication de plaques multipuits et de plaques de microtitration | Format microplaque | Criblage à haut débit, protéomique, essais cellulaires | Sonication simultanée et uniforme dans tous les puits ; idéal pour les procédures portant sur plusieurs échantillons | UIP400MTP |
| Réacteurs à cellule à circulation | Sonication continue pour des volumes plus importants | >1 L, adaptable à différentes échelles | Désintégration cellulaire à l’échelle industrielle, production d’extraits | Traitement continu ; adaptable à différentes échelles ; contrôle complet du procédé (amplitude, pression, température) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + cellule à circulation |
| Systèmes de sonication stérile / indirecte | Traitement des échantillons sans contamination | Dépend du flacon, du tube ou de la microplaque | Échantillons sensibles, environnements stériles, contextes réglementés | Aucun contact avec la sonde ; évite le transfert de résidus ; nettoyage minimal | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Avantages de la sonication pour la lyse cellulaire
Par rapport aux autres méthodes de lyse cellulaire et d’extraction, la lyse cellulaire par ultrasons présente plusieurs avantages :
- Rapidité : La lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons constituent une méthode rapide qui permet de rompre les cellules en quelques secondes. Cette méthode est beaucoup plus rapide que d’autres méthodes telles que l’homogénéisation, la congélation-décongélation ou le broyage à billes.
- Efficacité : La lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons permettent de traiter des échantillons de petit ou de grand volume, ou plusieurs échantillons à la fois, ce qui les rend plus efficaces que d’autres méthodes nécessitant le traitement individuel de petits échantillons.
- Sans produits chimiques : La lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons constituent une méthode non invasive qui ne nécessite pas l’utilisation de produits chimiques agressifs ni d’enzymes. Elle est donc idéale pour les applications où l’intégrité du contenu cellulaire doit être préservée. La contamination indésirable des échantillons peut être évitée.
- Rendement élevé : La lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons permettent d’extraire le contenu cellulaire avec un rendement élevé, notamment l’ADN, l’ARN et les protéines. En effet, les ondes sonores à haute fréquence rompent les parois cellulaires et libèrent le contenu dans la solution environnante.
- Contrôle de la température : Les sonicateurs perfectionnés permettent un contrôle précis de la température de l’échantillon. Les sonicateurs numériques Hielscher sont équipés d’un capteur de température enfichable et d’un logiciel de surveillance de la température.
- Reproductibilité : Les protocoles de lyse cellulaire par ultrasons peuvent être facilement reproduits et même adaptés à différents volumes d’échantillons, plus grands ou plus petits, par un simple changement d’échelle linéaire.
- Polyvalence : La lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons permettent d’extraire le contenu d’une grande variété de types cellulaires, notamment les bactéries, les levures, les champignons, les cellules végétales et les cellules de mammifères. Elles permettent également d’extraire différents types de molécules, notamment les protéines, l’ADN, l’ARN et les lipides.
- Préparation simultanée de nombreux échantillons : Hielscher Ultrasonics propose plusieurs solutions pour traiter facilement de nombreux échantillons dans des conditions de procédé exactement identiques. Cela rend l’étape de préparation des échantillons par lyse et extraction très efficace et permet de gagner du temps.
- Facilité d’utilisation : Les équipements de lyse cellulaire et d’extraction par ultrasons sont faciles à utiliser et nécessitent une formation minimale. Ils sont également économiques, car ils représentent un investissement unique sans nécessité de racheter des consommables jetables. Ils sont donc intéressants pour un large éventail de chercheurs et de laboratoires.
Dans l’ensemble, la lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons constituent une méthode rapide, efficace, précisément contrôlable et polyvalente pour extraire le contenu cellulaire. Leurs avantages par rapport aux autres méthodes en font un choix intéressant pour un large éventail d’applications de recherche et industrielles.
Principe de fonctionnement de la lyse cellulaire par ultrasons
La lyse cellulaire et l’extraction par ultrasons utilisent des ondes sonores à haute fréquence pour désintégrer les cellules et extraire leur contenu. Les ondes sonores créent des variations de pression dans le liquide environnant, entraînant la formation et l’effondrement de petites bulles au cours d’un processus appelé cavitation. Ces bulles génèrent des forces mécaniques localisées très intenses qui peuvent rompre les cellules et libérer leur contenu dans la solution environnante.
La lyse cellulaire à l’aide d’un sonicateur comporte généralement les étapes suivantes :
- L’échantillon est placé dans un tube ou un récipient contenant une solution tampon.
- Une sonde à ultrasons est introduite dans l’échantillon et des ondes sonores à haute fréquence d’environ 20–30 kHz sont appliquées.
- Les ondes ultrasonores provoquent des oscillations et une cavitation dans le liquide environnant, générant des forces localisées qui rompent les cellules et libèrent leur contenu.
- L’échantillon est centrifugé ou filtré pour éliminer les débris cellulaires, et le contenu extrait est recueilli pour les analyses ultérieures.
Inconvénients des méthodes de lyse courantes
Dans votre travail au laboratoire, vous avez peut-être déjà rencontré les difficultés liées à la lyse cellulaire au moyen de protocoles traditionnels de lyse mécanique ou chimique.
- Lyse mécanique : Les méthodes de lyse mécanique, telles que le broyage au mortier et au pilon ou l’homogénéisation à l’aide d’une presse de French, d’un broyeur à billes ou d’un système rotor-stator, offrent souvent peu de possibilités de contrôle et de réglage précis. Ainsi, le broyage peut rapidement générer de la chaleur et des forces de cisaillement susceptibles d’endommager l’échantillon et de dénaturer les protéines. Ces méthodes peuvent également prendre beaucoup de temps et nécessiter de grandes quantités de matière de départ.
- Lyse chimique : Les méthodes de lyse chimique, telles que la lyse à base de détergents, peuvent endommager l’échantillon en désorganisant la bicouche lipidique et en dénaturant les protéines. Elles peuvent également nécessiter plusieurs étapes et laisser des contaminants résiduels qui interfèrent avec les applications ultérieures. Trouver la dose optimale de détergent constitue une difficulté supplémentaire.
- Cycles de congélation-décongélation : Les cycles de congélation-décongélation peuvent provoquer la rupture des membranes cellulaires, mais leur répétition peut également entraîner la dénaturation et la dégradation des protéines. Cette méthode peut aussi nécessiter plusieurs cycles, ce qui peut prendre beaucoup de temps et se traduit souvent par des rendements plus faibles.
- Lyse enzymatique : Les méthodes de lyse enzymatique peuvent être spécifiques à certains types cellulaires et nécessiter plusieurs étapes, ce qui les rend chronophages. Elles génèrent également des déchets et nécessitent une optimisation rigoureuse pour éviter la dégradation de l’échantillon. Les kits de lyse enzymatique sont souvent coûteux. Si votre procédure actuelle de lyse enzymatique donne des résultats insuffisants, la sonication peut être utilisée comme méthode synergique pour intensifier la désintégration cellulaire.
Contrairement aux méthodes conventionnelles de lyse cellulaire mécanique et chimique, la sonication est un outil très efficace et fiable de désintégration cellulaire qui permet un contrôle complet des paramètres de sonication. Cela garantit une grande sélectivité de la libération des substances et une grande pureté du produit. [cf. Balasundaram et al., 2009]
Elle convient à tous les types cellulaires et s’applique facilement à petite comme à grande échelle – toujours dans des conditions contrôlées. Les sonicateurs sont faciles à nettoyer. Un homogénéisateur à ultrasons dispose toujours de fonctions de nettoyage en place (CIP) et de stérilisation en place (SIP). La sonotrode est constituée d’un cornet en titane massif qui peut être essuyé ou rincé à l’eau ou avec un solvant (selon le milieu de travail). Grâce à leur robustesse, les sonicateurs ne nécessitent pratiquement aucun entretien.
Lyse par ultrasons et désintégration cellulaire
En général, la lyse des échantillons au laboratoire prend entre 15 secondes et 2 minutes. Comme l’intensité de la sonication est très facile à ajuster par le réglage de l’amplitude et de la durée de sonication ainsi que par le choix de l’équipement approprié, il est possible de désintégrer les membranes cellulaires très doucement ou très brutalement, selon la structure cellulaire et l’objectif de la lyse (par exemple, l’extraction d’ADN nécessite une sonication plus douce, tandis que l’extraction complète des protéines de bactéries nécessite un traitement par ultrasons plus intense). La température pendant le procédé peut être surveillée par un capteur de température intégré et facilement contrôlée par refroidissement (bain de glace ou cellules à circulation avec enveloppes de refroidissement) ou par sonication en mode pulsé. Lors de la sonication en mode pulsé, de courtes séquences de sonication d’une durée de 1–15 secondes permettent la dissipation de la chaleur et le refroidissement pendant les intervalles plus longs entre les séquences.
Tous les procédés utilisant les ultrasons sont entièrement reproductibles et peuvent être adaptés à différentes échelles de manière linéaire.
Le VialTweeter est un homogénéisateur à ultrasons permettant la préparation stérile, simultanée, uniforme et rapide de nombreux échantillons.
- Préparation de la suspension cellulaire : les culots cellulaires doivent être entièrement remis en suspension dans une solution tampon par homogénéisation (choisissez une solution tampon compatible avec l’analyse ultérieure, par exemple une méthode chromatographique spécifique). Ajoutez des lysozymes et/ou d’autres additifs, si nécessaire (ils doivent également être compatibles avec les méthodes de séparation/purification). Mélangez/homogénéisez délicatement la solution sous sonication douce jusqu’à obtenir une suspension complète.
En savoir plus sur les synergies des lysozymes associés à la sonication ! - Lyse par ultrasons : placez l’échantillon dans un bain de glace. Pour la désintégration cellulaire, soniquez la suspension par séquences de 60–90 secondes (en utilisant le mode pulsé de votre sonicateur).
- Séparation : centrifugez le lysat (par exemple, 10 min. à 10 000 x g ; à 4degC). Séparez soigneusement le surnageant du culot cellulaire. Le surnageant constitue le lysat cellulaire total. Après filtration du surnageant, vous obtenez un liquide clarifié contenant les protéines cellulaires solubles.
Les applications les plus courantes des sonicateurs en biologie et en biotechnologie sont :
- Préparation d’extraits cellulaires
- Désintégration de levures, de bactéries, de cellules végétales, de tissus cellulaires mous ou durs, de matériel nucléique
- Extraction de protéines
- Préparation et isolement d’enzymes
- Production d’antigènes
- Extraction d’ADN et/ou fragmentation ciblée
- Préparation de liposomes
La désintégration cellulaire à l’aide d’un sonicateur à sonde est une méthode efficace de préparation des échantillons.
Les multiples applications des ultrasons s’étendent aux secteurs de la biotechnologie, de la bio-ingénierie, de la microbiologie, de la biologie moléculaire, de la biochimie, de l’immunologie, de la bactériologie, de la virologie, de la protéomique, de la génétique, de la physiologie, de la biologie cellulaire, de l’hématologie et de la botanique.
Lyse : rupture des structures cellulaires
Les cellules sont protégées par une membrane plasmique semi-perméable constituée d’une bicouche phospholipidique (également une bicouche protéino-lipidique ; formée de lipides hydrophobes et de molécules de phosphore hydrophiles, avec des molécules protéiques intégrées) qui crée une barrière entre l’intérieur de la cellule (cytoplasme) et le milieu extracellulaire. Les cellules végétales et les cellules procaryotes sont entourées d’une paroi cellulaire. En raison de leur épaisse paroi cellulaire constituée de plusieurs couches de cellulose, les cellules végétales sont plus difficiles à lyser que les cellules animales. L’intérieur de la cellule, notamment les organites, le noyau et les mitochondries, est stabilisé par le cytosquelette.
La lyse des cellules vise à extraire et à séparer les organites, les protéines, l’ADN, l’ARNm ou d’autres biomolécules.
Méthodes conventionnelles de lyse cellulaire et leurs inconvénients
Il existe plusieurs méthodes pour lyser les cellules, que l’on peut répartir en méthodes mécaniques et chimiques. Elles comprennent l’utilisation de détergents ou de solvants, l’application d’une pression élevée ou l’utilisation d’un broyeur à billes ou d’une presse de French. L’inconvénient le plus problématique de ces méthodes est la difficulté à contrôler et à ajuster les paramètres du procédé et, par conséquent, leurs effets.
Le tableau ci-dessous présente les principaux inconvénients des méthodes de lyse courantes :
Tableau : les méthodes conventionnelles de lyse cellulaire présentent des inconvénients majeurs
Procédure de lyse
La lyse est un procédé délicat. Pendant la lyse, la protection assurée par la membrane cellulaire est détruite ; toutefois, il faut empêcher l’inactivation, la dénaturation et la dégradation des protéines extraites dans un environnement non physiologique (écart par rapport à la valeur du pH). C’est pourquoi la lyse est généralement réalisée dans une solution tampon. La plupart des difficultés proviennent d’une désintégration cellulaire non contrôlée entraînant une libération non ciblée de tout le matériel intracellulaire et/ou la dénaturation du produit cible.
Questions fréquentes sur la sonication et la lyse cellulaire
- Peut-on lyser des cellules par sonication ? Oui, la sonication lyse efficacement les cellules au moyen d’ondes ultrasonores à haute fréquence qui induisent la cavitation, un phénomène au cours duquel de minuscules bulles de vapeur se forment et s’effondrent violemment dans la suspension cellulaire. Les forces mécaniques qui en résultent désintègrent les membranes cellulaires et facilitent la libération des composants intracellulaires dans le liquide.
- Comment utiliser un sonicateur pour la lyse cellulaire ? L’utilisation d’un sonicateur pour la lyse cellulaire consiste à immerger la sonde du sonicateur dans une suspension cellulaire et à ajuster des paramètres tels que l’amplitude et la durée des impulsions. Le procédé doit être étroitement surveillé afin d’optimiser la désintégration cellulaire tout en minimisant la dénaturation des protéines et l’inactivation des enzymes.
- Quel est le principe de la sonication pour la lyse cellulaire ? La sonication repose sur le principe de la cavitation acoustique. L’énergie ultrasonore est transmise au milieu liquide, provoquant des fluctuations rapides de pression qui entraînent la formation et l’implosion de microbulles. Ces implosions génèrent des forces de cisaillement intenses et des températures élevées localisées, désintégrant les structures cellulaires et améliorant l’homogénéité du lysat.
- Combien de temps dure la sonication pour la lyse cellulaire ? La durée de la sonication pour la lyse cellulaire peut varier considérablement selon des facteurs tels que le type de cellules, la densité cellulaire, la puissance du sonicateur et le protocole spécifique utilisé. Les procédures typiques peuvent durer de quelques secondes à quelques minutes et sont souvent réalisées par cycles pour maîtriser la production de chaleur et assurer une désintégration cellulaire uniforme.
- Quel est le rôle de la sonication dans l’extraction de protéines ? Dans l’extraction de protéines, la sonication sert à rompre efficacement les membranes cellulaires et à solubiliser les protéines. Cette méthode est particulièrement utile pour libérer les protéines contenues dans les compartiments cellulaires, ce qui la rend essentielle pour préparer les lysats à partir desquels les protéines seront purifiées ou analysées.
- Pourquoi utilise-t-on la sonication pour l’extraction ? La sonication est privilégiée pour l’extraction en raison de son action rapide et de sa capacité à appliquer une énergie ciblée, désintégrant les structures cellulaires pour libérer des molécules bioactives sans recourir à des traitements chimiques agressifs, ce qui préserve l’intégrité fonctionnelle des composés extraits.
- La sonication perturbe-t-elle les interactions protéine-protéine ? Bien que la sonication puisse désintégrer efficacement les membranes cellulaires, elle peut également perturber les interactions protéine-protéine. Le degré de perturbation dépend de l’intensité de la sonication et de la durée d’exposition et peut entraîner la dénaturation ou la dissociation des complexes protéiques, ce qui pourrait affecter les études analytiques ou fonctionnelles ultérieures.
- Peut-on utiliser la sonication pour lyser E. coli ? Les sonicateurs Hielscher sont particulièrement efficaces pour lyser les cellules bactériennes telles qu’E. coli, qui possèdent des parois cellulaires robustes. Cette technique constitue une méthode physique de cisaillement de la paroi et de la membrane cellulaires, ce qui en fait une méthode privilégiée pour préparer des lysats bactériens dans les laboratoires de biologie moléculaire et de biochimie.
- Quels procédés suivent l’étape de sonication ?
Les étapes en aval de la lyse par ultrasons comprennent généralement le fractionnement du lysat, l’isolement ciblé des organites et une extraction ou une purification supplémentaire des protéines.
Le lysat traité est ensuite séparé et préparé pour des applications analytiques ou fonctionnelles, telles que la protéomique à haute résolution, la transcriptomique ou les études de liaison aux récepteurs.
Bibliographie/Références
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
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- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.