Erittäin puhtaiden skitsofyllaanibeetaglukaanien tuotanto ultraäänellä

Skitsofyllaani on sieniperäinen β-glukaani, jolla on immuunivastetta muuntelevia ominaisuuksia. Voimakkaiden lääkinnällisten vaikutusten saavuttamiseksi skitsofyllaanin molekyylipainon on oltava pieni, jotta sen biologinen hyötyosuus paranee. Ultraäänikäsittelyn on osoitettu pienentävän skitsofyllaanin molekyylipainoa. Luotettavana ja tehokkaana menetelmänä ultraäänikäsittelyä voidaan helposti soveltaa pienimolekyylipainoisen skitsofyllaanin tuotantoon.

Schizophyllum-sienet ja beetaglukaanien ultraääniuutto

Schizophyllum-suvun sienilajit kasvavat luonnossa lahoavilla puilla sadekausien jälkeen. Itiöemät kerätään seuraavan kuivan kauden aikana. Schizophyllum-lajit sisältävät runsaasti biokemiallisia yhdisteitä, kuten glukaaneja, ja niitä käytetään siksi erityisesti trooppisissa maissa ravintona ja lääkkeenä. Immuunivastetta muuntelevien, sienilääkkeellisten, kasvainten kasvua estävien ja viruksia torjuvien ominaisuuksiensa vuoksi Schizophyllum commune, joka tunnetaan myös nimellä halkiheltta, on herättänyt biotekniikka- ja lääkeyritysten kiinnostuksen.
Polysakkaridi skitsofyllaani, joka tunnetaan myös nimillä sizofiran, sonifilan ja sizofilan, on Schizophyllum-sienten pääasiallinen β-glukaani. Nämä sienet tarjoavat erittäin tehokasta bioaktiivista β-glukaania, skitsofyllaania.
Schizophyllum commune -sienet kasvavat luonnossa puilla, ja sienirihmastoa voidaan kasvattaa myös fermentointiliemessä. Lääkinnällisissä ja kosmeettisissa käyttökohteissa pienimolekyylipainoinen skitsofyllaani on huomattavasti tehokkaampaa kuin suurimolekyylipainoinen skitsofyllaani. Tämä johtuu siitä, että pienimolekyylipainoisella skitsofyllaanilla on merkittävästi parempi biologinen hyötyosuus ja imeytymisaste. Lisäksi suurimolekyylipainoinen skitsofyllaani on usein ongelmallista käyttökohteissa, koska sen vesiliuosten viskositeetti on suuri.
Koon pienentäminen ultraäänellä on erittäin tehokas ja luotettava tekniikka skitsofyllaanin molekyylipainon pienentämiseen ja siten β-glukaanimolekyylin laadun parantamiseen.

Pienimolekyylipainoisen skitsofyllaanin tuotantoprotokolla

Koska molekyylipainoltaan skitsofyllaanilla on huomattavasti parempi biologinen hyötyosuus ja käyttöominaisuudet, Smirnoun tutkimusryhmä tutki ultraäänikäsittelyä β-glukaanimolekyyli skitsofyllaanin pilkkomiseksi ja koon pienentämiseksi.

Skitsofyllaanin ultraäänikäsittely

β-1.3(1.6)-glukaania skitsofyllaania (SPG) tuotettiin kasvattamalla S. commune -sientä uppoviljelyssä bioreaktorissa käyttäen sakkaroosia substraattina.
Kasvatuksen päätyttyä kasvatusliemi laimennettiin demineralisoidulla vedellä skitsofyllaanipitoisuuteen 2 g/L ja käsiteltiin ultraäänellä käyttäen laitetta Ultraääniprosessori UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Saksa) kierrätystilassa seuraavilla parametreilla ja olosuhteissa: väliaineen tilavuusvirta 50 mL/s, taajuus 20 kHz, lähtöteho 2 000 W, sonotrodi tyyppiä BS2d22, amplitudinvahvistin tyyppiä B2-1.4 ja amplitudi 100 %. Kasvatusliemen lämpötila ultraäänikäsittelyn alussa oli 25 °C. Ultraäänikäsitelty kasvatusliemi (ominaissyöttöenergia 100 Ws/mL) suodatettiin Seitz HS800 -syväsuodattimen läpi paineessa 1,5 bar ja lämpötilassa 40 °C. Kemiallista karakterisointia varten ultraäänikäsitelty skitsofyllaani (uSPG) saostettiin suodoksesta kolminkertaisella määrällä isopropyylialkoholia laboratorion lämpötilassa ja kuivattiin lämpötilassa 60 °C 12 h ajan. Immunologisia tutkimuksia varten uSPG-liuokset valmistettiin seuraavasti: (1) ultraäänikäsitellyn kasvatusliemen suodos diafiltroitiin Pall Centramate T-sarjan PES-kasetin läpi (0,1 m2, erotusraja 100 kDa) paineessa 0,8 bar, ja diafiltraatiota jatkettiin, kunnes retentaatin sähkönjohtavuus oli 20 μS/cm; (2) liuos väkevöitiin diafiltraatiolla uSPG-pitoisuuteen 1 g/L ja steriloitiin autoklavoimalla olosuhteissa 120 °C/20 min. Denaturoitu uSPG valmistettiin samalla tavalla, mutta kasvatusliemen suodokseen lisättiin NaOH:ta pitoisuuteen 0,2 M ja alkalisoitua liuosta inkuboitiin 30 min laboratorion lämpötilassa ennen diafiltraatiota.

Analyysimenetelmät

Sienirihmaston saanto arvioitiin gravimetrisesti: kasvatusliemi laimennettiin vedellä suhteessa 1:4 ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 × g lämpötilassa 25 °C 20 min ajan. Sakka pestiin kolminkertaisella määrällä vettä, kuivattiin lämpötilassa 60 °C ja punnittiin. Skitsofyllaani saostettiin supernatantista kolminkertaisella määrällä isopropyylialkoholia, kuivattiin lämpötilassa 60 °C 24 h ajan, ja sen saanto määritettiin gravimetrisesti. Kasvatusliemen pO2 mitattiin optisella Hamilton-Visiferm DO 120 -anturilla (Hamilton, Sveitsi).
Kasvatusliemen dynaaminen viskositeetti mitattiin HAAKE Visco Tester 6L -laitteella käyttäen karoja 1L ja 2L lämpötilassa 4 °C ja pyörimisnopeudella 30 rpm. Suodatusnopeus laskettiin ajasta, joka kului kasvatusliemen (500 mL) suodattamiseen Seitz HS800 -syväsuodattimen (200 × 200 mm; Pall, Yhdysvallat) läpi paineessa 1,5 bar ja lämpötilassa 40 °C.
uSPG:n molekyylipaino mitattiin SEC-MALLS-menetelmällä Alliance-HPLC-järjestelmällä (Waters), jossa oli sarjaan kytketyt PL aquagel OH60- ja PL aquagel OH40 -kolonnit, ja miniDAWN TREOS -detektori (Wyatt) väkevöitiin diafiltraatiolla uSPG-pitoisuuteen 1 g/L ja steriloitiin autoklavoimalla olosuhteissa 120 °C/20 min. Denaturoitu uSPG valmistettiin samalla tavalla, mutta kasvatusliemen suodokseen lisättiin NaOH:ta pitoisuuteen 0,2 M ja alkalisoitua liuosta inkuboitiin 30 min laboratorion lämpötilassa ennen diafiltraatiota.

Tulokset:
Ultraäänikäsittelyä sovellettiin suoraan 144 h kasvatetun S. commune -sienen sienirihmastoa sisältävään kasvatusliemeen SPG:n jatkokäsittelyn helpottamiseksi.
 
Ultraäänikäsitellyn skitsofyllaanin ominaisuudet: Ultraäänikäsitelty skitsofyllaani (uSPG) saostettiin kasvatusliemen suodoksesta alkoholilla ja karakterisoitiin. SEC-MALLS-menetelmällä uSPG:n Mw-arvoksi arvioitiin noin 1 MDa. Nestemäisestä fermentoinnista saadun skitsofyllaanin keskimääräinen molekyylipaino on noin 5 MDa, kun taas kiinteän alustan viljelyssä se voi olla jopa 10 MDa. Verrattaessa ultraäänikäsitellyn skitsofyllaanin molekyylipainoa natiivin, käsittelemättömän skitsofyllaanin molekyylipainoihin voidaan havaita ultraäänikäsittelyn pienentävän molekyylipainoa 5–10-kertaisesti.
Ultraäänikäsitelty polysakkaridi uSPG sisälsi 0,7 % w/w proteiinia ja 1,0 % w/w hehkutusjäännöstä. uSPG-hydrolysaatista yli 99 % oli glukoosia. Analyysitulokset osoittavat, että ultraäänikäsittely pilkkoo β-glukaanin runkoketjua satunnaisesti ja sivuhaarat pysyvät ehjinä, jolloin skitsofyllaanin koko ja molekyylipaino pienenevät. Immunologiset tutkimukset olennaisesti proteiinittomalla ja endotoksiinittomalla uSPG:llä osoittivat, että ultraäänikäsitellyllä pienimolekyylipainoisella skitsofyllaanilla on voimakas immuunivastetta muunteleva vaikutus.

 
Pienentynyt viskositeetti: Ultraäänikäsittely pienensi kasvatusliemen viskositeettia merkittävästi. Ultraäänikäsittelyn aikana kasvatusliemen viskositeetti muuttui epälineaarisesti: viskositeetin pieneneminen oli nopeaa ultraäänikäsittelyn alussa, mutta hidastui myöhemmin. Ominaissyöttöenergia 100 Ws/mL riitti pienentämään kasvatusliemen viskositeettia lähes 7-kertaisesti.

Parantunut suodatus: Ultraäänikäsitelty kasvatusliemi virtasi suodattimen läpi nopeammin kuin käsittelemätön kasvatusliemi (ominaissyöttöenergia 0 Ws/mL), joka sisälsi suurimolekyylipainoista SPG:tä. Lisäksi ultraäänikäsittely vähensi merkittävästi tuotehävikkiä suodatuksen aikana. Suurimolekyylipainoista SPG:tä sisältävän käsittelemättömän kasvatusliemen suodos (ominaissyöttöenergia 0 Ws/mL) sisälsi SPG:tä 0,3 ± 0,07 g/L, kun taas SPG-pitoisuus ennen syväsuodatusta oli 2 g/L. Sen sijaan ominaissyöttöenergialla 100 Ws/mL ultraäänikäsitellyn kasvatusliemen suodos sisälsi SPG:tä pitoisuutena 2,2 ± 0,2 g/L, mikä vastaa lähes olematonta tuotehävikkiä.

Johtopäätös: Tutkimusryhmä toteaa johtopäätöksessään, että ultraäänikäsittely on tehokas teknologia pienimolekyylipainoisen skitsofyllaanin valmistukseen. Sitä voidaan tämän jälkeen käyttää kosmetiikassa ja lääketieteessä. Kun ultraäänikäsittelyä sovelletaan koko sienirihmastoa sisältävään kasvatusliemeen, se tuo tiettyjä etuja skitsofyllaanin tuotantoon. Se vähentää tuotehävikkiä jatkokäsittelyn aikana ja mahdollistaa erittäin puhtaan polysakkaridin tuotannon ultrasuodatuksen tehokkaan käytön ansiosta.
Lisäksi tutkijat havaitsivat, että skitsofyllaanin ultraäänikäsittely on helposti skaalattavissa. Yksi pilottilaitoksen ultraäänihajotin UIP2000hdT käsitteli 1 litran kasvatuslientä 110 s:ssa virtaustilassa. Järjestelmän tuottavuutta voidaan helposti lisätä kytkemällä lisää ultraääniyksiköitä sarjaan.

 
Lue lisää sieniuuton helposta skaalaamisesta!
 

Tehokkaat ultraäänilaitteet sieniperäisten glukaanien käsittelyyn

Polysakkaridien, kuten glukaanien, sekä muiden bioaktiivisten yhdisteiden, kuten kitiinin ja kitosaanin, pilkkominen voidaan toteuttaa luotettavasti Hielscherin tehokkailla ultraäänilaitteilla. Ultraäänilaitteemme voivat tuottaa suuria amplitudeja, mahdollistavat prosessiparametrien tarkan hallinnan ja soveltuvat 24/7-käyttöön suurella kuormituksella ja vaativissa ympäristöissä. Hielscher Ultrasonicsin laitevalikoima täyttää nämä vaatimukset luotettavasti. Erinomaisen ultraäänisuorituskyvyn lisäksi Hielscherin ultraäänilaitteilla on korkea energiatehokkuus, mikä on merkittävä taloudellinen etu – erityisesti kaupallisessa suuren mittakaavan tuotannossa.
Hielscherin ultraäänilaitteet ovat tehokkaita järjestelmiä, jotka voidaan varustaa lisävarusteilla, kuten sonotrodeilla, amplitudinvahvistimilla, reaktoreilla tai virtauskennoilla, jotta ne vastaavat optimaalisesti prosessisi tarpeita.
Digitaalinen värinäyttö, mahdollisuus esiasettaa ultraäänikäsittelyjaksot, automaattinen tietojen tallennus integroituun SD-korttiin, etäohjaus selaimella ja monet muut ominaisuudet takaavat parhaan mahdollisen prosessinhallinnan ja käyttäjäystävällisyyden. Kestävän rakenteensa ja suuren kuormituskestävyytensä ansiosta Hielscherin ultraäänijärjestelmät ovat luotettavia työjuhtia tuotannossasi.
β-glukaanien, kuten skitsofyllaanin, molekyylipainon pienentäminen edellyttää voimakasta ultraääntä, jotta saavutetaan tavoiteltu pilkkoutuminen ja saadaan korkealaatuinen skitsofyllaanilopputuote, jota voidaan käyttää lääkinnällisiin tarkoituksiin.
 
Lisätietoja beetaglukaanien ultraääniuutosta sienistä sekä vaiheittaiset ohjeet löydät täältä!
 
Alla oleva taulukko antaa suuntaa-antavan kuvan ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: