Erittäin puhdistettujen skitsofyllaanibeetaglukaanien ultraäänituotanto

Schizophyallan on sieni-β-glukaani, jolla on immunomoduloivia ominaisuuksia. Erittäin aktiivisten lääketieteellisten vaikutusten saavuttamiseksi skitsofyllaanilla on oltava pieni molekyylipaino, jotta biologinen hyötyosuus paranee. Ultrasonicationin on osoitettu vähentävän skitsofyllaanin molekyylipainoa. Luotettavana ja tehokkaana menetelmänä sonikaatiota voidaan helposti soveltaa pienimolekyylipainoisen skitsofyllaanin tuotantoon.

Schizophyllum-sienet ja ultraäänibeetaglukaaniuutto

Schizophyllum-sienen lajit kasvavat luonnossa lahoavilla puilla sadekauden jälkeen. Hedelmäkappaleet kerätään seuraavalla kuivalla kaudella. Schizophyllum-lajeissa on runsaasti biokemiallisia yhdisteitä, kuten glukaaneja, ja siksi niitä kulutetaan erityisesti trooppisissa maissa elintarvikkeina ja lääkkeinä. Immunomoduloivien, sienilääkkeiden, antineoplastisten ja antiviraalisten ominaisuuksiensa ansiosta Schizophyllum commune, joka tunnetaan myös nimellä Splitgill-sieni, on houkutellut biotekniikka- ja lääkeyhtiöitä.
Polysakkaridiskitsofyllaani, joka tunnetaan myös nimellä sizofiraani, sonifilaani tai sizofilaani, on tärkein β-glukaani, jota löytyy Schizophyllum-sienistä, jotka tarjoavat erittäin tehokkaan bioaktiivisen β-glukaaniskitsofyllaanin.
Schizophyllum-kunnan sienet kasvavat luonnossa puissa, mycelliumia voidaan viljellä myös käymisliemessä. Farmaseuttisissa ja kosmeettisissa sovelluksissa pienimolekyylipainoinen skitsofyllaani on paljon tehokkaampi kuin suurimolekyylipainoinen skitsofyllaani. Tämä johtuu siitä, että pienimolekyylipainoisella skitsofyllaanilla on huomattavasti parempi biologinen hyötyosuus ja imeytymisnopeus. Lisäksi suurimolekyylipainoinen skitsofyllaani on usein ongelmallinen sovelluksissa, koska se johtaa sen vesiliuosten korkeaan viskositeettiin.
Ultraäänikoon pienentäminen on erittäin tehokas ja luotettava tekniikka skitsofyllaanin molekyylipainon alentamiseksi, mikä lisää β-glukaanimolekyylin laatua.

Protokolla pienimolekyylipainoisen skitsofyllaanin tuottamiseksi

Koska molekyylipainoinen skitsofyllaani osoittaa huomattavasti parempia hyöty- ja käyttöominaisuuksia, Smirnoun tutkimusryhmä tutki ultrasonicationia β-glukaanimolekyylin skitsofyllaanin pilkkomiseksi ja koon pienentämiseksi.

Schizophyllanin ultraääni

β-1.3(1.6)-glukaaniskitsofyllaani (SPG) tuotettiin viljelemällä S. commmune -sientä upotettuna bioreaktorissa käyttäen sakkaroosia substraattina.
Viljelyn päätyttyä viljelyliemi laimennettiin demineralisoidulla vedellä skitsofyllaanipitoisuuteen 2 g / l ja ultrasonicated Ultraääniprosessori UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Saksa) kierrätystilassa seuraavilla parametreilla ja olosuhteissa: keskivirtaus 50 ml / s, taajuus 20 kHz, lähtö 2000 W, sonotrode-tyyppi BS2d22, tehostintyyppi B2-1.4 ja amplitudi 100%. Viljelyliemen lämpötila sonikoinnin alussa oli 25 ° C. Ultrasonicated viljelyliemi (ominaisenergiansyöttö 100 Ws / ml) suodatettiin Seitz HS800 -syvyyssuodattimen läpi 1,5 baarin paineessa 40 ° C: ssa. Ultrasonicated skitsofyllan (uSPG) kemiallista karakterisointia varten saostettiin suodoksesta kolminkertaisella määrällä isopropyylialkoholia laboratoriolämpötilassa ja kuivattiin 60 ° C: ssa 12 tunnin uSPG-liuoksille immunologisiin tutkimuksiin valmistettiin seuraavasti: (1) ultrasonicated culture liemisuodos diafiltoidaan 0,1 m2 Pall Centramate T-sarjan PES-kasetin läpi (100 kDa: n raja-arvo) 0,8 baarissa ja diafiltraatiota jatkettiin, kunnes retentaattijohtavuus oli 20 μS / cm; (2) liuos väkevöidään diasuodattamalla uSPG-pitoisuuteen 1 g/l ja steriloidaan autoklaavissa 120 °C:ssa/20 minuutissa. Denaturoitu uSPG valmistettiin samalla tavalla, paitsi että NaOH:ta lisättiin viljelmäliemen suodokseen pitoisuutena 0,2 M ja alkalisoitua liuosta inkuboitiin 30 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa ennen diafiltraatiota.

Analyysimenetelmiä

Rihmastosato arvioitiin gravimetrisesti: viljelyliemi laimennettiin vedellä suhteessa 1:4, sentrifugoitiin 10000 g × g 25 °C:ssa 20 minuutin ajan, sakka pestiin kolminkertaisella määrällä vettä, kuivattiin 60 °C:ssa ja painotettiin. Skitsofyllaani saostettiin supernatantista kolminkertaisella määrällä isopropyylialkoholia, kuivattiin 60 °C:ssa 24 tunnin ajan ja sen saanto määritettiin gravimetrisesti. pO2 viljelyliemessä mitattiin optisella koettimella Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Sveitsi).
Viljelyliemen dynaaminen viskositeetti mitattiin HAAKE Visco Tester 6L karoilla 1L ja 2L 4 °C:ssa ja pyörimisnopeudella 30 rpm. Suodatusnopeus laskettiin 500 ml:n viljelyliemen suodatusajasta 200 × 200 mm:n Seitz HS800 (Pall, USA) -syvyyssuodattimen läpi 1,5 baarin paineessa ja 40 °C:ssa.
uSPG-molekyylipaino mitattiin SEC-MALLSilla HPLC-järjestelmällä Alliance (Waters) sarjaan kytketyillä PL-akvageeli OH60- ja PL-akvageeli OH40 -kolonneilla, ja ilmaisin miniDAWN TREOS (Wyatt) konsentroitiin diasuodattamalla uSPG-pitoisuuteen 1 g/l ja steriloitiin autoklaavissa 120 °C:ssa/20 minuutissa. Denaturoitu uSPG valmistettiin samalla tavalla, paitsi että NaOH:ta lisättiin viljelmäliemen suodokseen pitoisuutena 0,2 M ja alkalisoitua liuosta inkuboitiin 30 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa ennen diafiltraatiota.

Tulokset:
Ultrasonication-hoitoa sovellettiin suoraan S. commune 144-h -viljelyliemeen myseelin kanssa SPG: n jatkokäsittelyn helpottamiseksi.
 
Sonikoidun skitsofyllaanin ominaisuudet: Ultrasonicated schizophyllan (uSPG) saostettiin viljelyliemen suodoksesta alkoholilla ja karakterisoitiin. SEC-MALLS arvioi uSPG:n Mw:n olevan noin 1 MDa. Nestemäisestä käymisestä peräisin olevan skitsofyllaanin keskimääräinen molekyylipaino on noin 5 MDa, kun taas kiinteän tilan viljelyssä se voi nousta jopa 10 MDa: iin. Vertaamalla ultrasonicated skitsofyllanin molekyylipainoa natiivin käsittelemättömän skitsofyllaanin molekyylipainoihin, ultrasonicationin vuoksi voidaan havaita 5-10-kertainen pienentynyt molekyylipaino.
Sonikoitu polysakkaridi uSPG sisälsi 0,7% w / w proteiinia ja 1,0% w / w jäännöstä sytytyksen jälkeen. uSPG-hydrolysaatti koostui glukoosista, jossa oli yli 99%. Analyyttiset tulokset osoittavat, että sonikaatio pilkkoo β-glukaanin selkärangan satunnaisesti ja sivukonttorit pysyvät ehjinä, mikä vähentää skitsofyllaanin kokoa ja molekyylipainoa. Immunologiset tutkimukset olennaisesti proteiinittomasta ja endotoksiinittomasta uSPG: stä osoittivat, että ultraäänellä matalan Mw: n skitsofyllaanilla on voimakas immunomoduloiva aktiivisuus.

 
Alennettu viskositeetti: Ultrasonication johti viljelyliemen viskositeetin merkittävään vähenemiseen. Ultrasonicationin aikana viljelyliemen viskositeetti muuttui epälineaarisesti: viskositeetin lasku oli nopeaa ultra- sonicationin alussa, mutta myöhemmin se hidastui. Ominaisenergiansyöttö 100 Ws/ml riitti pienentämään viljelmäliemen viskositeettia lähes 7 kertaa.

Parannettu suodatus: Ultraäänellä käsitelty viljelyliemi virtasi suodattimen läpi nopeammin kuin käsittelemätön viljelyliemi (ominaisenergiansyöttö 0 Ws/ml) suurimolekyylisellä SPG:llä. Sitä paitsi, ultrasonication vähensi merkittävästi tuotehäviötä suodatuksen aikana. Käsittelemättömän viljelmäliemen, jossa oli suurimolekyylistä SPG:tä (ominaisenergiansyöttö 0 Ws/ml), suodos sisälsi 0,3 ± 0,07 g/l SPG:tä, kun taas SPG-konsentraatio ennen syvyyssuodatusta oli 2 g/l. Sitä vastoin suodos 100 Ws / ml ultraääniviljelmä sisälsi molemmat SPG: tä pitoisuutena 2,2 ± 0,2 g / l, mikä vastaa lähes nollaa tuotehäviötä.

Johtopäätös: Tutkimusryhmä jatkaa päätelmässään, että ultraäänikäsittely on tehokas tekniikka pienimolekyylipainoisen skitsofyllaanin valmistukseen, jota voidaan sitten käyttää kosmetiikassa ja lääketieteessä. Ultrasonication, kun sitä käytetään täydellisessä viljelyliemessä myseelin kanssa, tuo tiettyjä etuja skitsofyllaanin tuotantoon. Se vähentää tuotehäviöitä jatkojalostuksen aikana ja mahdollistaa erittäin puhdistetun polysakkaridin tuotannon ultrasuodatuksen tehokkaan käytön ansiosta.
Lisäksi tutkijat havaitsivat, että skitsofyllaanin ultraäänikäsittely on helposti skaalautuvaa. Yksi pilottilaitoksen ultraäänihajotuslaitteen UIP2000hdT yksikkö käsitteli 1 litraa viljelyliemiä 110 sekunnissa virtaustilassa. Järjestelmän tuottavuutta voidaan helposti lisätä ylimääräisten ultraääniyksiköiden peräkkäisellä liitännällä.

 
Lue lisää sienten uuttamisen yksinkertaisesta laajentamisesta!
 

Korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteet sieniglukaanin käsittelyyn

Polysakkaridien, kuten glukaanien, sekä muiden bioaktiivisten yhdisteiden, kuten kitiinin ja kitosaanin, pirstoutuminen voidaan käsitellä luotettavasti Hielscherin korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteilla. Ultraäänilaitteemme voivat tuottaa suuria amplitudit, tarjoavat tarkan hallittavuuden prosessiparametreihin ja niitä voidaan käyttää 24/7 raskaalla kuormituksella ja vaativissa ympäristöissä. Hielscher Ultrasonics -laitevalikoima täyttää nämä vaatimukset luotettavasti. Erinomaisen ultraäänisuorituskyvyn lisäksi Hielscher-ultraäänilaitteilla on korkea energiatehokkuus, mikä on merkittävä taloudellinen etu – varsinkin kun sitä käytetään kaupallisessa laajamittaisessa tuotannossa.
Hielscher-ultraäänilaitteet ovat korkean suorituskyvyn järjestelmiä, jotka voidaan varustaa lisävarusteilla, kuten sonotrodeilla, vahvistimilla, reaktoreilla tai virtaussoluilla, jotta ne vastaavat prosessitarpeitasi optimaalisesti. Digitaalisella värinäytöllä varmistetaan mahdollisuus esiasettaa sonikaatioajoja, automaattinen tietojen tallennus integroidulle SD-kortille, selaimen etäohjaus ja monia muita ominaisuuksia, korkein prosessinohjaus ja käyttäjäystävällisyys. Yhdessä kestävyyden ja raskaan kantavuuden kanssa Hielscherin ultraäänijärjestelmät ovat luotettava työhevonen tuotannossa. β-glukaanien, kuten skitsofyllaanin, molekyylipainon vähentäminen vaatii voimakasta ultraääntä kohdennetun pilkkomisen ja korkealaatuisen lopullisen skitsofyllaanituotteen saamiseksi, jota voidaan käyttää farmaseuttisiin sovelluksiin.
 
Löydä lisätietoja ultraäänibeetaglukaanin uuttamisesta sienistä, mukaan lukien vaiheittaiset ohjeet täältä!
 
Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: