Beeta-glukaanien uuttaminen sienistä ultraäänikäsittelyllä
Materiaalit ja laitteet
- Sieniä (esim. 100g pilkottuja tai viipaloituja sieniä)
- Kylmää tislattua vettä (esim. 500mL)
- Tehosekoitin tai mylly
- Lasisia dekantterilaseja tai pulloja
- Suodatinpaperia tai tyhjiösuodatuslaitteisto
- Sentrifugi (valinnainen)
- Alkoholia (esim. etanolia) saostamiseen
- Jääkaappi
- Kuivausuuni
Beeta-glukaanien uutto-ohje
- Jauha tai murskaa sienet (esim. pakurikääpä tai siiliorakas) karkeiksi, noin 1–3 millimetrin kokoisiksi hiukkasiksi. Käytä esimerkiksi 100g kuivattuja sienihiukkasia.
- Lisää sitten sienihiukkaset dekantterilasiin tai lasipulloon.
- Lisää seuraavaksi 500mL tislattua vettä dekantterilasiin, jossa uutettavat sienihiukkaset ovat. Veden ja sienten suhde voi vaihdella sienityypin ja hiukkaskoon mukaan.
- Kun olet sekoittanut lietteen, käsittele seos ultraäänellä käyttäen laboratorion ultraäänihomogenisaattoria (esim. UP400St, jossa on 22mm:n sonotrodi ja jonka amplitudi on 100%, tai UP200Ht, jossa on 14mm:n sonotrodi ja jonka amplitudi on 100%) ja pidä lämpötila alle 90°C:ssa. Matalammat lämpötilat auttavat säilyttämään lämpöherkät yhdisteet, kuten beeta-glukaanit, uuton aikana. Käsittele ultraäänellä noin 5–10 minuuttia käyttäessäsi laitetta UP400St ja 10–… minuuttia käyttäessäsi laitetta UP200Ht. Huomaa, että lämpötila ja uuttoaika voivat vaihdella käytetyn ultraäänitehon mukaan. Suuremmat tilavuudet vaativat luonnollisesti pidempiä ultraäänikäsittelyaikoja.
- Suodata ultraäänikäsitelty seos suodatinpaperin läpi tai käytä tyhjiösuodatuslaitteistoa erottaaksesi nesteen (joka sisältää uutetut beeta-glukaanit) kiinteästä sienijäännöksestä.
- Saosta sitten beeta-glukaanit nesteestä lisäämällä alkoholia (esim. etanolia). Saostamiseen voidaan yleensä käyttää alkoholia 2–3 kertaa nesteen tilavuuden verran.
- Säilytä sen jälkeen seosta jääkaapissa useita tunteja, jotta beeta-glukaanit saostuvat.
- Saostamisen jälkeen voit dekantoida nesteen varovasti ja kerätä beeta-glukaanisakan.
- Kuivaa lopuksi beeta-glukaanit uunissa matalassa lämpötilassa (esim. 40–50°C), kunnes kaikki alkoholi on poistunut ja jäljellä on kuivaa jauhetta.
Sienten ominaisuudet vaihtelevat. Siksi beeta-glukaanien uuttoprosessi voi vaihdella esimerkiksi sienilajin, sienten tilan (kuivattuja tai tuoreita), hiukkaskoon ja uuttolämpötilan mukaan. Uuttomenetelmän optimoimiseksi kannattaa kokeilla erilaisia parametreja, kuten kiinteän aineen ja nesteen suhteen vaihtelua, lämpötilan säätämistä, erilaisia liuottimia sekä erilaisia ultraäänikäsittelyn kestoja ja amplitudiasetuksia.
Beeta-glukaanin ultraääniavusteinen entsymaattinen uutto
Ultraääniavusteinen entsymaattinen uutto on menetelmä, jolla beeta-glukaaneja uutetaan sienistä entsyymien ja ultraääniaaltojen yhdistelmän avulla. Prosessi tehostaa uuttoa hajottamalla sienten soluseinämiä ja helpottamalla beeta-glukaanien vapautumista.
Sienten beeta-glukaaniuuton skaalaaminen suurempaan mittakaavaan
Kun olet määrittänyt vaatimuksiasi vastaavan beeta-glukaanien uutto-ohjeen, uuttoprosessin skaalaaminen suurempaan mittakaavaan voi olla suoraviivaista.
Eräuuton skaalaaminen suurempaan mittakaavaan
Jos aiot skaalata prosessin suurempaan mittakaavaan eräuuttomenetelmällä, suosittelemme kasvattamaan erätilavuutta ja pitämään samalla kiinteän aineen ja nesteen suhteet sekä kaikki muut parametrit vakioina. Jos jatkat saman ultraäänihomogenisaattorin käyttöä, pidennä ultraäänikäsittelyaikaa samassa suhteessa. Yli 1 litran erissä voit harkita hitaasti pyörivän sekoittimen käyttöä hiukkasten pitämiseksi suspensiossa ja uuton tasaisuuden parantamiseksi. Alla olevassa kuvassa on 8 litran eräuuttolaitteisto, jossa ultraäänihomogenisaattoria UP400St käytetään yhdessä laboratoriosekoittimen kanssa.
8L:n sienten eräuuttolaitteisto, jossa käytetään ultraäänilaitetta UP400St
Beeta-glukaani uutteen tyhjiösuodatus ultraäänikäsittelyn jälkeen
Sienten jatkuvatoiminen uutto
Hielscher Ultrasonics tarjoaa kasviperäisten materiaalien uuttoon suunniteltuja virtauskennoreaktoreita niille, jotka haluavat uuttaa jatkuvatoimisesti suurempia määriä beeta-glukaaneja sienistä. Jos tämä koskee sinua, ota meihin suoraan yhteyttä saadaksesi lisätietoja. Tekninen tiimimme auttaa mielellään määrittämään juuri sinun tarpeisiisi sopivimman laitteiston. Aiemmin kuvatun laboratoriomittakaavan kokeen tekeminen omalla sienilajillasi voi kuitenkin olla korvaamattoman arvokasta prosessin tarkkojen vaatimusten ymmärtämiseksi. Alla olevassa kuvassa on suuri virtauskennoreaktori, jossa käytetään ultraäänihomogenisaattoria UIP4000hdT beeta-glukaanien uuttamiseen noin 50–200 litrasta sieni-liuotinlietettä tunnissa.
Sienilajien kokeellisesti määritetty beeta-glukaanipitoisuus
Alla on luettelo eri sienilajeista uutettujen beeta-glukaanien kokeellisesti määritetyistä pitoisuuksista.
| Mushroom Species | Total 1,3-1,6-β-D-glucan (g/100g dry mass) |
|---|---|
| Boletus pinophilus | 9,8% |
| Suillus granulatus | 13,3% |
| Craterellus cornucopioides | 4,5% |
| Suillus variegatus | 13,7% |
| Hydnum repandum | 4,1% |
| Gyroporus cyanescens | 14,3% |
| Tricholomopsis rutilans | 10,2% |
| Agaricus bisporus (portobello) | 4% |
| Agaricus bisporus (cremini) | 4% |
| Auricularia auricular-judae | 16,8% |
1,3-1,6-β-D-glucan content in the analyzed wild-growing and cultivated mushrooms, Source:Mirończuk-Chodakowska et al. (2017): Quantitative Evaluation of 1,3-1,6-Β-D-Glucan Contents in Wild–Growing Species of Edible Polish Mushrooms. Rocz Panstw Zakl Hig 2017;68(3):281-290.
SonoStation: siirrettävä avaimet käteen -järjestelmä ultraäänikäsittelyyn – koostuu ultraäänidispergaattoreista, pumpusta, sekoittimesta ja säiliöstä
Ultraäänihomogenisaattori UIP4000hdT noin 50–200 litran sieni-liuotinlietemäärän käsittelyyn tunnissa
Sienistä saadun beeta-glukaani uutteen pitoisuuden määritys
Beeta-glukaanipitoisuus voidaan määrittää uuton jälkeen eri menetelmillä beeta-glukaanin tyypin ja analyysin erityisvaatimusten mukaan. Alla on lueteltu yleisiä menetelmiä beeta-glukaanipitoisuuden määrittämiseen. Menetelmän valinta riippuu luonnollisesti esimerkiksi vaaditusta tarkkuudesta ja käytettävissä olevista laitteista.
-
Gravimetrinen menetelmä
- Periaate: Menetelmä perustuu beeta-glukaanien saostamiseen etanolilla sekä sakan kuivaamiseen ja punnitsemiseen.
- Menettely: Näyte liuotetaan veteen ja käsitellään etanolilla beeta-glukaanien saostamiseksi, minkä jälkeen sakka kerätään, kuivataan ja punnitaan.
- Edut: Yksinkertainen ja laajalti käytetty.
- Rajoitukset: Epätarkempi kuin muut menetelmät.
-
Kolorimetriset menetelmät
- Periaate: Näissä menetelmissä käytetään tiettyjen reagenssien kanssa tapahtuvia värireaktioita, jotka tuottavat beeta-glukaanipitoisuuteen verrannollisen värinmuutoksen.
-
Esimerkkejä:
- Fenoli-rikkihappomenetelmä: Tässä menetelmässä näytettä käsitellään väkevällä rikkihapolla ja fenolilla, jolloin liuos muuttuu oranssiksi. Värin voimakkuus on verrannollinen beeta-glukaanipitoisuuteen.
- Antronimenetelmä: Antronireagenssi reagoi beeta-glukaanien kanssa tuottaen sinivihreän värin, jonka voimakkuus mitataan.
- Edut: Herkkiä ja soveltuvat suurten näytemäärien analysointiin.
- Rajoitukset: Muiden yhdisteiden aiheuttamat häiriöt ja tiettyjen reagenssien tarve.
-
Entsymaattiset määritykset
- Periaate: Entsymaattisissa määrityksissä käytetään entsyymejä, kuten β-glukanaasia, hajottamaan beeta-glukaanit yksinkertaisemmiksi sokereiksi, ja vapautuneiden sokerien määrät mitataan.
- Edut: Erittäin spesifisiä ja tarkkoja.
- Rajoitukset: Vaativat erikoislaitteita ja -reagensseja.
-
Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC)
- Periaate: HPLC erottaa yhdisteet ja määrittää niiden määrät kromatografisen kolonnin kanssa tapahtuvien vuorovaikutusten perusteella.
- Menettely: Beeta-glukaanit hydrolysoidaan monosakkarideiksi, ja syntyneet sokerit erotetaan ja niiden määrät määritetään HPLC:llä.
- Edut: Erittäin tarkka ja soveltuu monimutkaisille näytteille.
- Rajoitukset: Vaatii erikoislaitteita ja asiantuntemusta.
-
Spesifiset immunomääritykset
- Periaate: Immunomäärityksissä käytetään beeta-glukaaneille spesifisiä vasta-aineita niiden pitoisuuden määrittämiseen.
-
Esimerkkejä:
- ELISA (entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys): Tässä menetelmässä entsyymiin liitetty vasta-aine tuottaa värinmuutoksen sitoutuessaan beeta-glukaaneihin.
- Lateraalivirtausmääritykset: Nämä ovat pikatestejä, jotka tuottavat testiliuskalle näkyvän tuloksen.
- Edut: Suuri spesifisyys ja herkkyys.
- Rajoitukset: Vaativat spesifisiä vasta-aineita ja voivat olla kalliimpia.