Niosomien formulointi ultraäänellä
Niosomit ovat nanokokoisia vesikkeleitä, joita voidaan käyttää lääkkeiden (esim. syöpälääkkeiden) ja muiden bioaktiivisten aineiden kantajina. Ultraääniemulgointi on yksinkertainen ja nopea menetelmä pienten, suuren lääkeainemäärän sisältävien niosomien formulointiin.
Niosomivesikkelit vaikuttavien aineiden nanokantajina
Niosomi on ionittomaan pinta-aktiiviseen aineeseen perustuva vesikkeli, joka muodostetaan yleensä ionittomasta pinta-aktiivisesta aineesta ja apuaineena lisättävästä kolesterolista. Niosomit kestävät kemiallista hajoamista tai hapettumista paremmin ja säilyvät pitkään liposomeihin verrattuna. Niosomien valmistuksessa käytettävien pinta-aktiivisten aineiden ansiosta ne ovat biohajoavia, bioyhteensopivia ja ei-immunogeenisia. Niosomit ovat osmoottisesti aktiivisia ja kemiallisesti stabiileja, ja niiden säilytysaika on pidempi kuin liposomien. Koosta ja lamellaarisuudesta riippuen käytettävissä on erilaisia valmistusmenetelmiä, kuten ultraäänikäsittely, käänteisfaasihaihdutus, ohutkalvon hydratointi tai kalvon läpäisevään pH-gradienttiin perustuva lääkeaineen sisäänottoprosessi. Niosomien valmistus ultraäänellä on ensisijainen menetelmä pienten ja tasakokoisten unilamellaaristen vesikkelien tuottamiseen.
Niosomien formulointi ultraäänellä
Niosomien formulointia varten on valmistettava öljy-vedessä-emulsio (o/w) pinta-aktiivisen aineen ja kolesterolin orgaanisesta liuoksesta sekä bioaktiivista yhdistettä eli lääkeainetta sisältävästä vesiliuoksesta. Ultraääniemulgointi on paras menetelmä toisiinsa sekoittumattomien nesteiden, kuten öljyn ja veden, sekoittamiseen. Nanoemulsio saadaan kohdistamalla molempien faasien pisaroihin leikkausvoimia ja hajottamalla ne nanokokoisiksi. Tämän jälkeen orgaaninen liuotin haihdutetaan, jolloin muodostuu terapeuttisilla aineilla ladattuja niosomeja, jotka ovat dispergoituneina vesifaasiin. Mekaaniseen sekoittamiseen verrattuna ultraääneen perustuva niosomien formulointimenetelmä on erinomainen, sillä se muodostaa nopeasti niosomeja, joiden keskimääräinen koko ja polydispersiteetti-indeksi ovat pienempiä. Pienempien vesikkelien käyttöä pidetään yleensä suositeltavana, sillä ne välttävät yleensä elimistön poistomekanismeja paremmin kuin suuremmat hiukkaset ja pysyvät verenkierrossa pidempään. (vrt. Bragagni et al. 2014)
Lue lisää ultraäänikäsittelystä niosomiformulaatioiden parantamiseksi!
- unilamellaariset, pienet ja tasakokoiset vesikkelit
- yksinkertainen ja nopea prosessi
- toistettava
- tarkasti hallittavissa
- turvallinen
- helposti skaalattavissa
Niosomien ultraäänivalmistuksen protokollat
Niosomien formulointia ultraäänikäsittelyllä on tutkittu laajasti, joten niosomien ultraäänivalmistukseen on saatavilla lukuisia tieteellisesti validoituja protokollia.
Alla on lyhyt katsaus muutamiin formulointiprotokolliin, joissa niosomit valmistetaan ja ladataan ultraäänikäsittelyllä.
Withania somnifera -uutteilla ladatut niosomit
Chinembiri ym. (2017) formuloivat Withania somnifera -raakauutetta paikalliseen käyttöön tarkoitettuihin niosomeihin. Bioaktiiviset yhdisteet kapseloitiin liuotininjektiolla. Tätä varten orgaanista faasia ja vesifaasia sekoitettiin jatkuvasti magneettisekoittimella, ja lämpötila pidettiin arvossa 60 °C ± 2 °C, kunnes orgaaninen liuotin oli poistunut. Saatu formulaatio jäähdytettiin ja ultraäänikäsiteltiin jäällä Hielscher UP200ST -ultraäänilaitteella. Niosomien keskimääräinen koko oli noin 165,9 ± 9,4, ja withanolidi A:n kapselointitehokkuus (EE%) oli suuri.
Doksorubisiinilla ladatut niosomit
Syöpälääke doksorubisiinilla ladatut N-palmitoyyliglukosamiininiosomit (Glu) valmistettiin ravistamalla NPG:n (16 mg), Span 60:n (65 mg), kolesterolin (58 mg) ja Solulan C24:n (54 mg) seosta doksorubisiiniliuoksessa (1,5 mg/ml, 2 ml, valmistettu PBS:ään) 90 °C:ssa 1 h ajan, minkä jälkeen suoritettiin 10 min ultraäänikäsittely ultraäänisondilla (75 % enimmäisarvosta).
Palmitoyyliglykolikitosaanivesikkelit (GCP) valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (11) ultraäänikäsittelemällä glykolikitosaania (10 mg) ja kolesterolia (4 mg) doksorubisiiniliuoksessa (1,5 mg/ml) ultraäänisondilla. (Dufes et al. 2004)
UP400St – 400 W:n ultraäänilaite nanokantajien, kuten niosomien, formulointiin
Vaihtoehtoiset niosomien valmistusmenetelmät
Vaihtoehtoisissa niosomien formulointimenetelmissä, kuten käänteisfaasihaihdutuksessa tai kalvon läpäisevään pH-gradienttiin perustuvassa lääkeaineen sisäänottoprosessissa, käytetään ultraäänienergiaa. Molempia menetelmiä käytetään pääasiassa multilamellaaristen vesikkelien (MLV) formulointiin. Alla on lyhyt kuvaus molemmista menetelmistä ja niihin sisältyvästä ultraäänikäsittelyvaiheesta.
Ultraäänikäsittely niosomien valmistuksessa käänteisfaasihaihdutuksella
Käänteisfaasihaihdutusmenetelmässä (REV) niosomiformulaation komponentit liuotetaan eetterin ja kloroformin seokseen ja lisätään lääkeainetta sisältävään vesifaasiin. Ultraääniemulgoinnilla seos muutetaan hienopisaroiseksi emulsioksi. Tämän jälkeen orgaaninen faasi haihdutetaan. Orgaanisen liuottimen haihdutuksessa saadut niosomit ovat suurikokoisia unilamellaarisia vesikkeleitä.
Kalvon läpäisevään pH-gradienttiin perustuva lääkeaineen sisäänottoprosessi
Kalvon läpäisevään pH-gradienttiin (hapan sisäpuoli) perustuvassa lääkeaineen sisäänottoprosessissa (etälatauksella) pinta-aktiivinen aine ja kolesteroli liuotetaan kloroformiin. Liuotin haihdutetaan sitten alipaineessa, jolloin pyöröpohjakolvin seinämälle muodostuu ohut kalvo. Kalvo hydratoidaan 300 mM:n sitruunahapolla (pH 4,0) sekoittamalla suspensiota vorteksisekoittimella. Multilamellaariset vesikkelit jäädytetään ja sulatetaan kolme kertaa ja ultraäänikäsitellään sitten sondityyppisellä ultraäänilaitteella. Tähän niosomisuspensioon lisätään vesiliuos, joka sisältää 10 mg/ml lääkeainetta, ja sekoitetaan vorteksisekoittimella. Näytteen pH nostetaan sitten arvoon 7,0–7,2 käyttämällä 1 M:n dinatriumfosfaattia. Tämän jälkeen seos kuumennetaan 60 °C:seen 10 minuutiksi. Tällä menetelmällä saadaan multilamellaarisia vesikkeleitä. (vrt. Kazi et al. 2010)
Niosomien koon pienentäminen ultraäänellä
Niosomien koko on yleensä välillä 10 nm – 1 000 nm. Valmistusmenetelmästä riippuen niosomit ovat usein suhteellisen suuria ja pyrkivät muodostamaan aggregaatteja. Niosomien tietty koko on kuitenkin tärkeä tekijä tavoitellun kuljetusjärjestelmätyypin kannalta. Esimerkiksi hyvin pieni, nanometriluokan niosomikoko soveltuu parhaiten systeemiseen lääkeaineen kuljetukseen, jossa lääkeaine on kuljetettava solukalvojen läpi solussa sijaitsevaan kohteeseen. Suurempia niosomeja puolestaan suositellaan lihaksensisäiseen ja ontelonsisäiseen lääkeaineen kuljetukseen tai silmäsovelluksiin. Niosomien koon pienentäminen ultraäänellä on tavallinen vaihe erittäin tehokkaiden niosomien valmistuksessa. Ultraäänen leikkausvoimat hajottavat niosomien agglomeraatteja ja dispergoivat niosomit monodispersseiksi nanoniosomeiksi.
Protokolla – LipoNiosomes-vesikkelien koon pienentäminen ultraäänellä
Naderinezhad ym. (2017) formuloivat bioyhteensopivia LipoNiosomes-vesikkeleitä (niosomin ja liposomin yhdistelmä), jotka sisälsivät Tween 60:tä, kolesterolia ja DPPC:tä (suhteessa 55 : 30 : 15 : 3) sekä 3 % DSPE-mPEG:tä. Valmistettujen LipoNiosomes-vesikkelien koon pienentämiseksi he ultraäänikäsittelivät suspensiota hydratoinnin jälkeen 45 min ajan (15 sekuntia päällä ja 10 sekuntia pois, amplitudi 70 % ja teho 100 wattia) hiukkasten aggregaation minimoimiseksi ultraäänihomogenisaattorilla UP200St (Hielscher Ultrasonics GmbH, Saksa). pH-gradienttimenetelmässä CUR:n, pinta-aktiivisten aineiden ja lipidien kuivatut kalvot hydratoitiin 1 300 mL:lla ammoniumsulfaattia (pH 1⁄4 4) lämpötilassa 63 C 47 min ajan. Tämän jälkeen nanohiukkasia ultraäänikäsiteltiin jäähauteen päällä pienten vesikkelien tuottamiseksi.
Ultraäänilaitteet niosomien valmistukseen
Hielscher Ultrasonicilla on pitkä kokemus suorituskykyisten ultraäänihomogenisaattorien suunnittelusta, valmistuksesta, jakelusta ja huollosta lääke-, elintarvike- ja kosmetiikkateollisuudelle.
Korkealaatuisten niosomien, liposomien, kiinteiden lipidinanohiukkasten, polymeerinanohiukkasten, syklodekstriinikompleksien ja muiden nanorakenteisten lääkeainekantajien valmistus on prosessi, jossa Hielscherin ultraäänilaitteet ovat erinomaisia suuren luotettavuutensa, tasaisen tehontuottonsa ja tarkan hallittavuutensa ansiosta. Hielscherin ultraäänilaitteilla kaikkia prosessiparametreja, kuten amplitudia, lämpötilaa, painetta ja ultraäänikäsittelyn energiaa, voidaan hallita tarkasti. Älykäs ohjelmisto tallentaa automaattisesti kaikki ultraäänikäsittelyn parametrit (aika, päivämäärä, amplitudi, nettoenergia, kokonaisenergia, lämpötila, paine) sisäänrakennetulle SD-kortille.
Hielscherin ultraäänilaitteiden kestävyys mahdollistaa 24/7-käytön suurilla kuormituksilla ja vaativissa ympäristöissä.
Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista:
| Erätilavuus | Tilavuusvirta | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| 1–500 mL | 10–200 mL/min | UP100H |
| 10–2 000 mL | 20–400 mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20 L | 0,2–4 L/min | UIP2000hdT |
| 10–100 L | 2–10 L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10–100 L/min | UIP16000 |
| n.a. | suurempi | laiteryhmä, joka koostuu laitteista UIP16000 |
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Suuritehoiset ultraäänihomogenisaattorit laboratoriomittakaavasta aina pilottimittakaavaan ja teolliseen mittakaavaan asti.
Kirjallisuus/Lähteet
- Chinembiri T.N., Gerber M., du Plessis L.H., du Preez J.L., Hamman J.H., du Plessis J. (2017): Topical Delivery of Withania somnifera Crude Extracts in Niosomes and Solid Lipid Nanoparticles. Pharmacognosy Magazine 2017 Oct;13 (Suppl 3):S663-S671.
- Nowroozi F., Almasi A., Javidi J., Haeri A., Dadashzadeh S. (2018): Effect of Surfactant Type, Cholesterol Content and Various Downsizing Methods on the Particle Size of Niosomes. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2018;17 (Suppl.2): 1-11.
- Ashraf Alemi, Javad Zavar Reza, Fateme Haghiralsadat, Hossein Zarei Jaliani, Mojtaba Haghi Karamallah, Seyed Ahmad Hosseini, Somayeh Haghi Karamallah (2018): Paclitaxel and curcumin coadministration in novel cationic PEGylated niosomal formulations exhibit enhanced synergistic antitumor efficacy. J Nanobiotechnol (2018) 16:28.
- Samira Naderinezhad, Ghasem Amoabediny, Fateme Haghiralsadat (2017): Co-delivery of hydrophilic and hydrophobic anticancer drugs using biocompatible pH-sensitive lipid-based nano-carriers for multidrug-resistant cancers. RSC Adv., 2017, 7, 30008–30019.
Hyödyllistä tietoa
Niosomit ja liposomit vertailussa
Liposomit ja niosomit ovat mikroskooppisia vesikkeleitä, jotka voidaan ladata bioaktiivisilla yhdisteillä lääkeaineen kuljetusta varten. Niosomit muistuttavat liposomeja, mutta niiden kaksoiskerroksen koostumus on erilainen. Liposomeilla on fosfolipidikaksoiskerros, kun taas niosomien kaksoiskerros muodostuu ionittomista pinta-aktiivisista aineista, minkä vuoksi rakenneyksiköiden välillä on kemiallinen ero. Tämä rakenteellinen ero antaa niosomeille paremman kemiallisen stabiiliuden, paremman kyvyn läpäistä iho ja vähemmän epäpuhtauksia.
Niosomit jaetaan koon perusteella kolmeen pääryhmään: pienten unilamellaaristen vesikkelien (SUV) keskimääräinen halkaisija on 10–100 nm, suurten unilamellaaristen vesikkelien (LUV) keskimääräinen koko on 100–3 000 nm, ja multilamellaarisille vesikkeleille (MLV) on ominaista useampi kuin yksi kaksoiskerros.
”Niosomit käyttäytyvät in vivo liposomien tavoin: ne pidentävät kapseloidun lääkeaineen kiertoaikaa ja muuttavat sen jakautumista elimiin sekä metabolista stabiiliutta. Liposomien tavoin niosomien ominaisuudet riippuvat kaksoiskerroksen koostumuksesta ja niiden valmistusmenetelmästä. On raportoitu, että kolesterolin sijoittuminen kaksoiskerroksiin pienentää kapselointitilavuutta formuloinnin aikana ja siten kapselointitehokkuutta.” (Kazi et al. 2010)
Niosomeja voidaan valmistaa erilaisilla menetelmillä, kuten ohutkalvon hydratoinnilla, ultraäänikäsittelyllä, käänteisfaasihaihdutuksella, jäädytys-sulatusmenetelmällä, mikrofluidisoinnilla tai dehydratointi-rehydratointimenetelmällä. Valitsemalla sopiva valmistusmenetelmä, pinta-aktiivinen aine, kolesterolipitoisuus, pintavaraukseen vaikuttavat lisäaineet ja suspension pitoisuus voidaan niosomien koostumus, lamellaarisuus, stabiilius ja pintavaraus määrittää vastaamaan lääkeainekantajalle asetettuja erityisvaatimuksia.
Jotta voidaan tuottaa erittäin bioyhteensopivia niosomeja, joiden sytotoksisuus on hyvin pieni, niosomien valmistuksessa käytettävien pinta-aktiivisten aineiden tulisi olla biohajoavia, bioyhteensopivia ja ei-immunogeenisia.