Sonikaatioavusteinen agrobakteerivälitteinen transformaatio (SAAT) on tehokas menetelmä tartuttaa kasvisoluja vierailla geeneillä käyttämällä Agrobacteriumia kuljettajana. Ultraäänikavitaatio aiheuttaa sonoporaatiota, jota voidaan kuvata kasvikudoksen kohdennetuksi mikrohaavoittumiseksi. Näiden ultraäänellä luotujen mikrohaavojen kautta DNA- ja DNA-vektorit voidaan kuljettaa tehokkaasti solumatriisiin.

Sonoporaatio – Ultraäänellä parannettu solujen muunnos

Kun matalataajuista ultraääntä (n. 20 kHz) käytetään solususpensioihin, akustisen kavitaation vaikutukset aiheuttavat ohimenevän kalvon permeabilisaation solukudoksiin. Tämä ultraäänivaikutus tunnetaan nimellä sonoporation ja sitä käytetään geenien siirtämiseen soluihin tai kudoksiin.
Ultrasonicationin edut perustuvat sen ei-lämpömekaaniseen toimintaperiaatteeseen, mikä tekee sonikaatiosta usein monipuolisemman ja vähemmän riippuvaisen solutyypeistä. Sonoporaation monipuolinen soveltaminen avaa mahdollisuuden siirtogeenisten kasvien hyödyntämiseen, joilla on merkittävä potentiaali monimutkaisten ihmisen terapeuttisten proteiinien biotuotannossa. Tällaisia kasvipohjaisia bioreaktoreita voidaan helposti manipuloida geneettisesti, ne voivat estää mahdollisen saastumisen ihmisen taudinaiheuttajilla, ne eivät vahingoita transformaatiota välittäviä bakteereja (esim. agrobakteeria) ja ovat edullinen ja tehokas menetelmä biosynteesissä.

Ultraääniavusteinen solujen muuntaminen

Sonikaatio on tekniikka, joka soveltaa matalataajuisia ultraääniaaltoja hiukkasten sekoittamiseen liuoksessa, liuosten sekoittamiseen, mikä lisää massansiirron ja liukenemisen nopeutta. Samanaikaisesti sonikaatio voi poistaa liuenneet kaasut nesteistä. Kasvien transformaatiossa sonikaatio aiheuttaa mikrowoundien muodostumista kasvikudokseen ja parantaa alastoman DNA: n kulkeutumista kasvien protoplastiin.

Geneettisessä muuntamisessa sonikaatioavusteinen agrobakteerivälitteinen transformaatio (SAAT) on suositeltava menetelmä, ja sillä on huomattavasti suurempi hyötysuhde kuin sonikaatiolla, jota käytetään alasti DNA- ja DNA-vektoreiden siirtämiseen suoraan protoplastiin. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että sonikaatioavusteista Agrobacterium-välitteistä transformaatiota (SAAT) voidaan käyttää aiheuttamaan mekaanisia häiriöitä ja haavojen muodostumista kasvisoluissa ultraääniaaltojen ja siitä johtuvan akustisen kavitaation avulla. Lyhyt ultraäänikäsittely luo mikrohaavoja eksplanttien pinnalle. Koska haavoittuneet solut mahdollistavat Agrobacteriumin tunkeutumisen kasvikudosten syvempään osaan, mikä lisää kasvisolujen tartunnan todennäköisyyttä. Lisäksi erittyneet fenoliyhdisteet tehostavat transformaatiota. Ultraäänellä tuotetut mikrohaavat tekevät myös bakteerien eksplantin tunkeutumisesta toteuttamiskelpoisempaa. SAAT:ia käytettiin menestyksekkäästi geneettiseen transformaatioon kasvilajeissa, joita pidettiin erityisesti vastustuskykyisinä Agrobacteriumille.
Koska se on hyvin yksinkertainen ja edullinen menetelmä, samoin kuin Agrobacterium-välitteisen geenisiirron merkittävä parantaminen ovat SAAT: n tärkeimmät edut. Sen lisäksi, että SAAT: ta on käytetty menestyksekkäästi Chenopodium rubrum L. ja Beta vulgaris L.: n muuntamisessa, tätä lähestymistapaa on sovellettu myös rekombinanttien Escherichia coli wild -tyyppisten lämpölabiilien holotoksiinien ja Escherichia coli mutantti LT -rokotteen adjuvanttien valmistuksessa Nicotiana tabacumissa, jossa linnuilla havaittiin korkeimmat systeemiset LT-B-spesifiset IgG-tittelit.
(vrt. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka ja R. Baranski, 2014)

Yleinen menettely geeninsiirrolle sonoporaation kautta kasvisoluissa

1. Perintöaineksen valmistus: Aloita valmistamalla geneettinen materiaali, jonka haluat viedä kasvisoluihin. Tämä voi olla plasmidi-DNA, RNA tai muut nukleiinihapot.
2. Kasvien solujen eristäminen: Eristä kasvisolut, joihin haluat kohdistaa. Kokeestasi riippuen nämä solut voidaan eristää kasvikudoksista tai viljelmistä.
3. Solun suspensio: Kasvisolut suspendoidaan sopivaan väliaineeseen tai puskuriin. Tämä on välttämätöntä sen varmistamiseksi, että solut ovat terveitä ja geenien imeytymistä edistävässä tilassa.
4. Määritä Sonicator: Valmistele koetintyyppinen sonikaattori sonikaatiolla esiasettamalla parametrit, kuten amplitudi, aika, energia ja lämpötila. Upota ultraäänianturi solususpensioon.
5. sonication: Aloita sonikaatiomenettely. Anturin kärjen nopea värähtely tuottaa kavitaatiokuplia nesteessä. Nämä kuplat laajenevat ja romahtavat ultraääniaaltojen takia, mikä luo mekaanisia voimia ja mikrovirtaa suspensiossa.
6. Sonoporaatio: Kavitaation synnyttämät mekaaniset voimat ja mikrovirtaus luovat väliaikaisesti huokosia ja reikiä kasvisolujen kalvoihin. Suspensiossa oleva geneettinen materiaali voi päästä kasvisoluihin näiden huokosten kautta.
7. Itäminen: Sonoporaatiokäsittelyn jälkeen inkuboidaan kasvisoluja, jotta ne voivat toipua ja vakauttaa kalvonsa. Tämä on ratkaiseva askel solujen eloonjäämisen ja onnistuneen geenisiirron varmistamiseksi.

Geeninsiirto agrobakteerin tai liposomien kautta

Kasvisolun muuntamiseen on kaksi yleistä muotoa. He käyttävät joko agrobakteeria, gramnegatiivisten bakteerien sukua tai liposomeja geneettisen materiaalin kantajana.

• Agrobakteerivälitteinen sonoporaatio: Agrobacterium tumefaciens on kasvigeenitekniikassa yleisesti käytetty bakteeri. Tässä menetelmässä plasmidi-DNA, joka sisältää halutun geenin, viedään Agrobacteriumiin, joka sitten sekoitetaan kasvisolujen kanssa. Solususpensio altistetaan sonoporaatiolle koetintyyppisellä sonikaattorilla. Ultraäänienergia parantaa geneettisen materiaalin siirtymistä Agrobacteriumista kasvisoluihin. Tätä menetelmää käytetään laajalti kasvien geneettiseen muuntamiseen.
• Liposomivälitteinen sonoporaatio: Liposomit ovat lipidipohjaisia vesikkeleitä, jotka voivat kuljettaa geneettistä materiaalia. Tässä menetelmässä plasmidi-DNA: lla tai muilla nukleiinihapoilla ladatut liposomit sekoitetaan kasvisolujen kanssa. Sonoporaatiota, jossa käytetään koetintyyppistä sonikaattoria, käytetään helpottamaan liposomien ottoa kasvisoluissa. Ultraääni häiritsee liposomien lipidikerroksia vapauttamalla geneettisen materiaalin kasvisoluihin. Tämä lähestymistapa on hyödyllinen ohimenevissä geeniekspressiotutkimuksissa kasvisoluissa.

Tieteellisesti todistetut sonikaatioavusteisen agrobakteerivälitteisen transformaation (SAAT) edut

Sonikaatioavusteista agrobakteerivälitteistä transformaatiota (SAAT) on sovellettu lukuisiin kasvilajeihin. Kasvisoluviljelmien lyhyt ja suhteellisen lievä ultraäänikäsittely aiheuttaa sonoporaatiota, joka myöhemmin mahdollistaa Agrobacteriumin syvän tunkeutumisen geeninkuljettajana. Alla voit lukea esimerkillisiä tutkimuksia, jotka osoittavat SAAT: n hyödylliset vaikutukset.

Ashwagandhan ultraäänellä avustettu muutos

Parantaakseen W. somniferan (tunnetaan nimellä ashwagandha tai talvikirsikka) muunnostehokkuutta Dehdashti ja hänen kollegansa (2016) tutkivat asetasyringonin (AS) ja sonikoinnin käyttöä.
Asetasyringonia (AS) lisättiin kolmessa vaiheessa: Agrobacterium liquid culture, Agrobacterium-infektio ja eksplanttien rinnakkaisviljely Agrobacteriumilla. 75 μM AS: n lisääminen Agrobacterium-nesteviljelmään havaittiin optimaaliseksi vir-geenien induktiolle.
Sonikoinnin (SAAT) lisäkäyttö johti korkeimpaan geeniekspressioon. GusA-geenin ilmentyminen karvaisissa juurissa todettiin parhaaksi, kun lehdet ja versojen kärjet sonikoitiin 10 ja 20 sekunnin ajan. Parannetun protokollan muunnostehokkuus kirjattiin 66,5 ja 59,5% lehti- ja versokärki-eksplanttien tapauksessa. Verrattuna muihin protokolliin tämän parannetun protokollan muunnostehokkuuden havaittiin olevan 2.5 kertaa suurempi lehdille ja 3.7-kertainen enemmän versojen kärjissä. Eteläiset blot-analyysit vahvistivat 1–2 kopiota gusA-siirtogeenistä linjoilla W1-W4, kun taas parannetun protokollan tuottamalla rivillä W5 havaittiin 1–4 siirtogeenikopiota.

Sonikaatioavusteisen Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) keston vaikutus W. somnifera -lehtien (a) ja verson kärjen (b) eksplanttien transformaatiotiheyteen
(tutkimus ja grafiikka: © Dehdashti et al., 2016)

Puuvillan ultraäänellä avustettu muunnos

(2007) osoittavat sonikaatioavusteisen puuvillan muuntamisen myönteiset vaikutukset. Matalataajuisen ultraäänen aiheuttama akustinen kavitaatio luo mikrohaavoja kasvikudoksen pinnalle ja sen alapuolelle (sonoporaatio) ja antaa Agrobacteriumin kulkea syvemmälle ja kokonaan koko kasvikudokseen. Tämä haavoittava tapa lisää todennäköisyyttä tartuttaa kasvisoluja, jotka sijaitsevat syvemmällä kudoksessa. SAAT:n muunnostehokkuuden arvioimiseksi mitattiin GUS-geeniekspressio. GUS-toimittajajärjestelmä on toimittajan geenijärjestelmä, joka on erityisen hyödyllinen kasvien molekyylibiologiassa ja mikrobiologiassa. Erilaisten SAAT-parametrien säätäminen, GUS-ohimenevä ilmentyminen puuvillassa käyttäen kypsiä alkioita eksplanttina parani merkittävästi. GUS havaittiin ensimmäisen kerran 24 tuntia eksplanttien inkuboinnin jälkeen ja 48 tunnin kuluttua GUS-ilmentyminen oli erittäin voimakasta, mikä toimi hyödyllisenä indikaattorina puuvillan eksplantin onnistuneesta transformaatiosta sonikaatioavusteisen Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) jälkeen. Erilaisten muunnostekniikoiden (nimittäin biolististen, Agro, BAAT, SAAT) vertailu, sonikaatioavusteinen Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) osoitti ylivoimaisesti parhaat tulokset muutoksesta.

Muunnosmenettelyn valinta GUS: n ohimenevän ilmentymisen perusteella. Sonikaatioavusteinen Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) osoittaa huomattavasti suurempaa ohimenevää ilmentymistä.
(tutkimus ja grafiikka: © Hussain et al., 2007)

Korkean suorituskyvyn ultraääniratkaisut sonoporaatioon ja SAAT: iin

Hielscher Ultrasonics on pitkään kokenut korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteiden kehittämisestä ja valmistuksesta laboratorioille, tutkimuslaitoksille sekä teolliselle tuotannolle, jolla on erittäin suuri läpäisykyky. Mikrobiologiaan ja biotieteeseen Hielscher tarjoaa erilaisia ratkaisuja, jotka täyttävät erilaiset vaatimukset, joita tarvitaan tietyille kudoksille ja niiden hoidoille. Lukuisten näytteiden samanaikaiseen ultrasonicationiin Hielscher tarjoaa UIP400MTP: n monikerroksisille levyille, VialTweeter jopa 10 injektiopullon (esim. Eppendorf-putket) tai ultraääni-CupHornin sonikaatioon. Probe-tyyppisiä ultraäänilaitteita on saatavana 50 - 400 wattia laboratoriohomogenisaattoreina, kun taas teollisuusjärjestelmät kattavat tehoalueen 500 watista 16 kW: iin.
Ota meihin yhteyttä ja kerro meille hakemuksesi ja prosessisi vaatimuksista. Hyvin kokenut henkilökuntamme suosittelee mielellään sopivinta ultraäänilaitetta biologiseen prosessiin.
Seuraavassa taulukossa on merkintä ultrasonicatorien likimääräisestä käsittelykapasiteetista: