Kasvisolujen geneettinen transformaatio ultraäänen avulla

Ultraäänikäsittelyllä avustettu Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) on tehokas menetelmä kasvisolujen infektoimiseen vierailla geeneillä käyttämällä Agrobacteriumia kuljettajana. Ultraäänikavitaatio aiheuttaa sonoporaatiota, jota voidaan kuvata kasvikudoksen kohdennetuksi mikrovaurioittamiseksi. Näiden ultraäänellä muodostettujen mikrovaurioiden kautta DNA:ta ja DNA-vektoreita voidaan kuljettaa tehokkaasti solumatriisiin.

Sonoporaatio – ultraäänellä tehostettu solujen transformaatio

Kun solususpensioihin kohdistetaan matalataajuista ultraääntä (noin 20 kHz), akustisen kavitaation vaikutukset lisäävät ohimenevästi solukudosten kalvojen läpäisevyyttä. Tätä ultraäänen vaikutusta kutsutaan sonoporaatioksi, ja sitä käytetään geenien siirtämiseen soluihin tai kudoksiin.
Ultraäänikäsittelyn edut perustuvat sen ei-termiseen mekaaniseen toimintaperiaatteeseen, jonka ansiosta ultraäänikäsittely on usein monipuolisempaa ja vähemmän riippuvaista solutyypeistä. Sonoporaation monipuolinen soveltaminen avaa mahdollisuuden hyödyntää siirtogeenisiä kasveja, joilla on merkittävää potentiaalia monimutkaisten ihmisen hoitoon tarkoitettujen proteiinien biologisessa tuotannossa. Tällaisia kasvipohjaisia bioreaktoreita voidaan muokata geneettisesti helposti, ne estävät mahdollisen kontaminaation ihmisen taudinaiheuttajilla, eivät vahingoita transformaatiota välittäviä bakteereita (esim. Agrobacteriumia) ja ovat edullinen ja tehokas biosynteesimenetelmä.

Ultraäänellä avustettu solujen transformaatio

Ultraäänikäsittely on tekniikka, jossa matalataajuisilla ultraääniaalloilla liikutetaan liuoksessa olevia hiukkasia ja sekoitetaan liuoksia, jolloin aineensiirto ja liukeneminen nopeutuvat. Samanaikaisesti ultraäänikäsittely voi poistaa nesteisiin liuenneita kaasuja. Kasvien transformaatiossa ultraäänikäsittely aiheuttaa mikrovaurioiden muodostumista kasvikudokseen ja tehostaa paljaan DNA:n kulkeutumista kasvin protoplastiin.

Geneettisessä transformaatiossa ultraäänikäsittelyllä avustettu Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) on ensisijainen menetelmä, ja sen tehokkuus on huomattavasti suurempi kuin ultraäänikäsittelyn, jota käytetään paljaan DNA:n ja DNA-vektorien siirtämiseen suoraan protoplastiin. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että ultraäänikäsittelyllä avustettua Agrobacterium-välitteistä transformaatiota (SAAT) voidaan käyttää kasvisolujen mekaanisen vaurioitumisen ja vaurioiden muodostumisen aiheuttamiseen ultraääniaaltojen ja niistä syntyvän akustisen kavitaation avulla. Lyhyt ultraäänikäsittely muodostaa mikrovaurioita eksplanttien pinnalle. Vaurioituneet solut mahdollistavat Agrobacteriumin tunkeutumisen kasvikudosten syvempiin osiin, mikä lisää kasvisolujen infektoitumisen todennäköisyyttä. Lisäksi erittyvät fenoliyhdisteet tehostavat transformaatiota. Ultraäänellä muodostetut mikrovauriot helpottavat myös bakteerien tunkeutumista eksplantteihin. SAAT-menetelmää on käytetty onnistuneesti geneettiseen transformaatioon kasvilajeilla, joita pidetään erityisesti Agrobacteriumille vastustuskykyisinä.
SAAT-menetelmän tärkeimmät edut ovat sen yksinkertaisuus ja edullisuus sekä Agrobacterium-välitteisen geeninsiirron merkittävä tehostuminen. Sen lisäksi, että SAAT-menetelmää on käytetty onnistuneesti Chenopodium rubrum L.- ja Beta vulgaris L. -kasvien transformaatiossa, tätä lähestymistapaa on sovellettu myös rekombinantin Escherichia coli -bakteerin villityypin lämpölabiilin holotoksiinin ja Escherichia coli -bakteerin mutantti-LT-rokoteadjuvanttien tuotantoon Nicotiana tabacum -kasvissa, minkä yhteydessä linnuilla havaittiin korkeimmat systeemiset LT-B-spesifiset IgG-tiitterit.
(vrt. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka ja R. Baranski, 2014)

Yleinen menetelmä geeninsiirtoon kasvisoluihin sonoporaation avulla

1. Geneettisen materiaalin valmistelu: Aloita valmistelemalla geneettinen materiaali, jonka haluat viedä kasvisoluihin. Se voi olla plasmidi-DNA:ta, RNA:ta tai muita nukleiinihappoja.
2. Kasvisolujen eristäminen: Eristä kasvisolut, joihin haluat kohdistaa käsittelyn. Kokeestasi riippuen nämä solut voidaan eristää kasvikudoksista tai viljelmistä.
3. Solususpensio: Suspendoi kasvisolut sopivaan väliaineeseen tai puskuriin. Tämä on välttämätöntä sen varmistamiseksi, että solut ovat terveitä ja geenien vastaanottamiselle suotuisassa tilassa.
4. Ultraäänilaitteen valmistelu: Valmistele anturityyppinen ultraäänilaitteesi määrittämällä etukäteen ultraäänikäsittelyn parametrit, kuten amplitudi, aika, energia ja lämpötila. Upota ultraäänianturi solususpensioon.
5. Ultraäänikäsittely: Aloita ultraäänikäsittely. Anturin kärjen nopea värähtely muodostaa nesteeseen kavitaatiokuplia. Nämä kuplat laajenevat ja romahtavat ultraääniaaltojen vaikutuksesta, jolloin suspensioon syntyy mekaanisia voimia ja mikrovirtauksia.
6. Sonoporaatio: Kavitaation synnyttämät mekaaniset voimat ja mikrovirtaukset muodostavat kasvisolujen kalvoihin tilapäisiä huokosia ja reikiä. Suspensiossa oleva geneettinen materiaali voi päästä kasvisoluihin näiden huokosten kautta.
7. Inkubointi: Inkuboi kasvisoluja sonoporaatiokäsittelyn jälkeen, jotta ne voivat toipua ja vakauttaa kalvonsa. Tämä on ratkaiseva vaihe solujen eloonjäämisen ja onnistuneen geeninsiirron varmistamiseksi.

Geeninsiirto Agrobacteriumin tai liposomien avulla

Kasvisolujen transfektioon on kaksi yleistä tapaa. Niissä käytetään geneettisen materiaalin kuljettajana joko gramnegatiivisten bakteerien sukuun kuuluvaa Agrobacteriumia tai liposomeja.

• Agrobacterium-välitteinen sonoporaatio: Agrobacterium tumefaciens on bakteeri, jota käytetään yleisesti kasvien geenitekniikassa. Tässä menetelmässä halutun geenin sisältävä plasmidi-DNA viedään Agrobacteriumiin, joka sekoitetaan sen jälkeen kasvisolujen kanssa. Solususpensio käsitellään sonoporaatiolla anturityyppistä ultraäänilaitetta käyttäen. Ultraäänienergia tehostaa geneettisen materiaalin siirtymistä Agrobacteriumista kasvisoluihin. Tätä menetelmää käytetään laajalti kasvien geneettiseen muokkaamiseen.
• Liposomivälitteinen sonoporaatio: Liposomit ovat lipidipohjaisia rakkuloita, jotka voivat kuljettaa geneettistä materiaalia. Tässä menetelmässä plasmidi-DNA:lla tai muilla nukleiinihapoilla ladatut liposomit sekoitetaan kasvisolujen kanssa. Anturityyppisellä ultraäänilaitteella toteutettua sonoporaatiota käytetään helpottamaan liposomien siirtymistä kasvisoluihin. Ultraääni hajottaa liposomien lipidikaksoiskerrokset ja vapauttaa geneettisen materiaalin kasvisoluihin. Tämä lähestymistapa on hyödyllinen tutkittaessa geenien ohimenevää ilmentymistä kasvisoluissa.

Ultraäänikäsittelyllä avustetun Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) tieteellisesti osoitetut hyödyt

Ultraäänikäsittelyllä avustettua Agrobacterium-välitteistä transformaatiota (SAAT) on sovellettu lukuisiin kasvilajeihin. Kasvisoluviljelmien lyhyt ja suhteellisen hellävarainen ultraäänikäsittely aiheuttaa sonoporaatiota, joka mahdollistaa sen jälkeen geeninkuljettajana toimivan Agrobacteriumin tunkeutumisen syvälle. Alla voit lukea esimerkkitutkimuksista, jotka osoittavat SAAT-menetelmän hyödylliset vaikutukset.

Ashwagandhan ultraäänellä avustettu transformaatio

Parantaakseen W. somnifera -kasvin (tunnetaan nimillä ashwagandha ja talvikirsikka) transformaatiotehokkuutta Dehdashti ja kollegat (2016) tutkivat asetosyringonin (AS) ja ultraäänikäsittelyn käyttöä.
Asetosyringonia (AS) lisättiin kolmessa vaiheessa: Agrobacteriumin nesteviljelmään, Agrobacterium-infektioon sekä eksplanttien ja Agrobacteriumin yhteisviljelmään. AS:n lisäämisen 75 μM:n pitoisuutena Agrobacteriumin nesteviljelmään todettiin olevan optimaalista vir-geenien induktion kannalta.
Ultraäänikäsittelyn (SAAT) käyttö lisätoimenpiteenä johti korkeimpaan geenien ilmentymiseen. gusA-geenin ilmentymisen karvajuurissa todettiin olevan parhaimmillaan, kun lehtiä ja versonkärkiä ultraäänikäsiteltiin vastaavasti 10 ja 20 s. Parannetun protokollan transformaatiotehokkuudeksi kirjattiin lehtieksplanteilla 66,5 ja versonkärkieksplanteilla 59,5 %. Muihin protokolliin verrattuna tämän parannetun protokollan transformaatiotehokkuuden todettiin olevan lehdillä 2,5-kertaisesti ja versonkärjillä 3,7-kertaisesti suurempi. Southern blot -analyysit vahvistivat 1–2 gusA-siirtogeenin kopiota linjoissa W1-W4, kun taas parannetulla protokollalla tuotetussa linjassa W5 havaittiin 1–4 siirtogeenin kopiota.

Ultraäänikäsittelyllä avustetun Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) keston vaikutus W. somnifera -kasvin lehti- (a) ja versonkärkieksplanttien (b) transformaation yleisyyteen
(tutkimus ja kuva: © Dehdashti et al., 2016)

Puuvillan ultraäänellä avustettu transformaatio

Hussain et al. (2007) osoittavat ultraäänikäsittelyllä avustetun puuvillan transformaation hyödylliset vaikutukset. Matalataajuisen ultraäänen aiheuttama akustinen kavitaatio muodostaa mikrovaurioita kasvikudoksen pinnalle ja sen alle (sonoporaatio) ja mahdollistaa Agrobacteriumin kulkeutumisen syvemmälle ja kauttaaltaan koko kasvikudokseen. Tämä vaurioittamistapa lisää syvemmällä kudoksessa sijaitsevien kasvisolujen infektoitumisen todennäköisyyttä. SAAT-menetelmän transformaatiotehokkuuden arvioimiseksi mitattiin GUS-geenin ilmentymistä. GUS-reportterijärjestelmä on reportterigeenijärjestelmä, joka on erityisen hyödyllinen kasvien molekyylibiologiassa ja mikrobiologiassa. Säätämällä erilaisia SAAT-parametreja tehostettiin merkittävästi GUS-geenin ohimenevää ilmentymistä puuvillassa, kun eksplantteina käytettiin kypsiä alkioita. GUS havaittiin ensimmäisen kerran 24 h eksplanttien inkuboinnin jälkeen, ja 48 h:n kohdalla GUS-geenin ilmentyminen oli erittäin voimakasta. Tämä toimi hyödyllisenä osoituksena puuvillaeksplantin onnistuneesta transformaatiosta ultraäänikäsittelyllä avustetun Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) jälkeen. Eri transformaatiotekniikoiden (biolistinen, Agro, BAAT, SAAT) vertailussa ultraäänikäsittelyllä avustettu Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) tuotti selvästi parhaat transformaatiotulokset.

Transformaatiomenetelmän valinta GUS-geenin ohimenevän ilmentymisen perusteella. Ultraäänikäsittelyllä avustettu Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) osoittaa merkittävästi suurempaa ohimenevää ilmentymistä.
(tutkimus ja kuva: © Hussain et al., 2007)

Suorituskykyiset ultraääniratkaisut sonoporaatioon ja SAAT-menetelmään

Hielscher Ultrasonics on kehittänyt ja valmistanut pitkään suorituskykyisiä ultraäänilaitteita laboratorioihin, tutkimuslaitoksiin sekä teolliseen tuotantoon, jossa käsittelymäärät ovat erittäin suuria. Mikrobiologiaan ja biotieteisiin Hielscher tarjoaa erilaisia ratkaisuja, jotka vastaavat tiettyjen kudosten ja niiden käsittelyjen erilaisiin vaatimuksiin. Lukuisten näytteiden samanaikaiseen ultraäänikäsittelyyn Hielscher tarjoaa monikuoppalevyille tarkoitetun laitteen UIP400MTP, enintään 10 näytepullon (esim. Eppendorf-putkien) ultraäänikäsittelyyn tarkoitetun laitteen VialTweeter tai ultraäänilaitteen CupHorn. Anturityyppisten ultraäänilaitteiden tehoalue ulottuu laboratoriohomogenisaattoreissa 50 watista 400 wattiin ja teollisissa järjestelmissä 500 watista 16 kW:iin.
Ota meihin yhteyttä ja kerro sovelluksestasi ja prosessisi vaatimuksista. Kokenut henkilökuntamme suosittelee mielellään biologiseen prosessiisi parhaiten sopivaa ultraäänilaitetta.
Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: