Geneettinen transformaatio kasvisoluissa ultraäänellä

Sonikaatioavusteinen agrobakteerivälitteinen transformaatio (SAAT) on tehokas menetelmä kasvisolujen infektoimiseksi vierailla geeneillä käyttämällä Agrobacteriumia kuljettajana. Ultraäänikavitaatio aiheuttaa sonoporaatiota, jota voidaan kuvata kasvikudoksen kohdennetuksi mikrohaavaksi. Näiden kautta ultraäänellä luodaan mikrohaavoja, DNA- ja DNA-vektorit voidaan kuljettaa tehokkaasti solumatriisiin.

Sonoporaatio – Ultraäänellä parannettu solujen transformaatio

Kun matalataajuista ultraääntä (noin 20 kHz) käytetään solususpensioihin, akustisen kavitaation vaikutukset aiheuttavat ohimenevän kalvon läpäisevyyden solukudoksissa. Tämä ultraäänivaikutus tunnetaan nimellä sonoporaatio ja sitä käytetään geeninsiirtoon soluihin tai kudoksiin.
Ultrasonicationin edut perustuvat sen ei-lämpömekaaniseen toimintaperiaatteeseen, mikä tekee sonikaatiosta usein monipuolisemman ja vähemmän riippuvaisen solutyypeistä. Sonoporaation monipuolinen käyttö avaa mahdollisuuden siirtogeenisten kasvien hyödyntämiseen, joilla on merkittävä potentiaali monimutkaisten ihmisen terapeuttisten proteiinien biotuotannossa. Tällaisia kasvipohjaisia bioreaktoreita voidaan helposti manipuloida geneettisesti, ne estävät mahdollisen kontaminaation ihmisen patogeeneillä, eivät vahingoita transformaatiota välittäviä bakteereja (esim. Agrobacterium) ja ovat edullinen ja tehokas biosynteesimenetelmä.

Ultraääniavusteinen solujen transformaatio

Sonikaatio on tekniikka, joka soveltaa matalataajuisia ultraääniaaltoja sekoittamaan hiukkasia liuoksessa, sekoittamaan liuoksia, mikä lisää massansiirron ja liukenemisen nopeutta. Samanaikaisesti sonikaatio voi poistaa liuenneet kaasut nesteistä. Kasvien transformaatiossa sonikaatio aiheuttaa mikrohaavojen muodostumisen kasvikudokseen ja parantaa paljaan DNA: n toimittamista kasvien protoplastiin.

Geneettisessä transformaatiossa sonikaatioavusteinen agrobakteerivälitteinen transformaatio (SAAT) on edullinen menetelmä, ja sillä on huomattavasti suurempi tehokkuus kuin sonikaatiolla, jota käytetään paljaiden DNA- ja DNA-vektoreiden siirtämiseen suoraan protoplastiin. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että sonikaatioavusteista Agrobacterium-välitteistä transformaatiota (SAAT) voidaan käyttää aiheuttamaan mekaanisia häiriöitä ja haavojen muodostumista kasvisoluihin ultraääniaalloilla ja tuloksena olevalla akustisella kavitaatiolla. Lyhyt ultraäänikäsittely luo mikrohaavoja eksplanttien pinnalle. Koska haavoittuneet solut mahdollistavat Agrobacteriumin tunkeutumisen kasvikudosten syvempään osaan, mikä lisää kasvisolujen tartunnan todennäköisyyttä. Lisäksi erittyvät fenoliyhdisteet tehostavat transformaatiota. Ultraäänellä tuotetut mikrohaavat tekevät myös bakteerien eksplantin tunkeutumisen mahdollisemmaksi. SAA: ta käytettiin menestyksekkäästi geneettiseen transformaatioon kasvilajeissa, joita pidettiin erityisen vastustuskykyisinä Agrobacteriumille.
Hyvin yksinkertainen ja edullinen menetelmä sekä Agrobacterium-välitteisen geeninsiirron merkittävä tehostaminen ovat SAAT: n tärkeimmät edut. Sen lisäksi, että SAA:ta on käytetty onnistuneesti Chenopodium rubrum L.:n ja Beta vulgaris L.:n transformaatiossa, tätä lähestymistapaa on sovellettu myös rekombinanttien Escherichia coli villityyppisten lämpölabiilin holotoksiinin ja Escherichia coli mutantti LT -rokotteen adjuvanttien tuotantoon Nicotiana tabacumissa, jossa linnuilla havaittiin korkeimmat systeemiset LT-B-spesifiset IgG-tiitterit.
(vrt. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka ja R. Baranski, 2014)

Yleinen menettely geeninsiirrolle sonoporaation kautta kasvisoluissa

1. Perintöaineksen valmistus: Aloita valmistamalla geneettinen materiaali, jonka haluat viedä kasvisoluihin. Tämä voi olla plasmidi-DNA, RNA tai muut nukleiinihapot.
2. Kasvien solujen eristäminen: Eristä kasvisolut, joihin haluat kohdistaa. Kokeestasi riippuen nämä solut voidaan eristää kasvikudoksista tai viljelmistä.
3. Solun suspensio: Kasvisolut suspendoidaan sopivaan väliaineeseen tai puskuriin. Tämä on välttämätöntä sen varmistamiseksi, että solut ovat terveitä ja geenien imeytymistä edistävässä tilassa.
4. Määritä Sonicator: Valmistele koetintyyppinen sonikaattori sonikaatiolla esiasettamalla parametrit, kuten amplitudi, aika, energia ja lämpötila. Upota ultraäänianturi solususpensioon.
5. Ultraäänellä: Aloita sonikaatiomenettely. Anturin kärjen nopea värähtely tuottaa kavitaatiokuplia nesteeseen. Nämä kuplat laajenevat ja romahtavat ultraääniaaltojen takia, mikä luo mekaanisia voimia ja mikrovirtaa suspensiossa.
6. Sonoporaatio: Kavitaation synnyttämät mekaaniset voimat ja mikrovirtaus luovat väliaikaisesti huokosia ja reikiä kasvisolujen kalvoihin. Suspensiossa oleva geneettinen materiaali voi päästä kasvisoluihin näiden huokosten kautta.
7. Itäminen: Sonoporaatiokäsittelyn jälkeen inkuboidaan kasvisoluja, jotta ne voivat toipua ja vakauttaa kalvonsa. Tämä on ratkaiseva askel solujen eloonjäämisen ja onnistuneen geenisiirron varmistamiseksi.

Geeninsiirto agrobakteerin tai liposomien kautta

Kasvisolun muuntamiseen on kaksi yleistä muotoa. He käyttävät joko agrobakteeria, gramnegatiivisten bakteerien sukua tai liposomeja geneettisen materiaalin kantajana.

• Agrobakteerivälitteinen sonoporaatio: Agrobacterium tumefaciens on kasvigeenitekniikassa yleisesti käytetty bakteeri. Tässä menetelmässä plasmidi-DNA, joka sisältää halutun geenin, viedään Agrobacteriumiin, joka sitten sekoitetaan kasvisolujen kanssa. Solususpensio altistetaan sonoporaatiolle käyttämällä koetintyyppistä sonikaattoria. Ultraäänienergia parantaa geneettisen materiaalin siirtymistä Agrobacteriumista kasvisoluihin. Tätä menetelmää käytetään laajalti kasvien geneettiseen muuntamiseen.
• Liposomivälitteinen sonoporaatio: Liposomit ovat lipidipohjaisia vesikkeleitä, jotka voivat kuljettaa geneettistä materiaalia. Tässä menetelmässä plasmidi-DNA: lla tai muilla nukleiinihapoilla ladatut liposomit sekoitetaan kasvisolujen kanssa. Sonoporaatiota, jossa käytetään koetintyyppistä sonikaattoria, käytetään helpottamaan liposomien ottoa kasvisoluissa. Ultraääni häiritsee liposomien lipidikerroksia ja vapauttaa geneettisen materiaalin kasvisoluihin. Tämä lähestymistapa on hyödyllinen ohimenevissä geeniekspressiotutkimuksissa kasvisoluissa.

Sonikaatioavusteisen agrobakteerivälitteisen transformaation (SAAT) tieteellisesti todistetut edut

Sonikaatioavusteista agrobakteerivälitteistä transformaatiota (SAAT) on sovellettu lukuisiin kasvilajeihin. Kasvisoluviljelmien lyhyt ja suhteellisen lievä ultraäänikäsittely aiheuttaa sonoporaatiota, joka mahdollistaa myöhemmin Agrobacteriumin syvän tunkeutumisen geenikuljettajana. Alta voit lukea esimerkillisiä tutkimuksia, jotka osoittavat SAAT: n hyödylliset vaikutukset.

Ashwagandhan ultraäänellä avustettu transformaatio

W. somniferan (tunnetaan nimellä ashwagandha tai talvikirsikka) transformaatiotehokkuuden parantamiseksi Dehdashti ja kollegat (2016) tutkivat asetosyringonin (AS) ja sonikoinnin käyttöä.
Asetosyringoni (AS) lisättiin kolmessa vaiheessa: Agrobacterium-nesteviljelmä, Agrobacterium-infektio ja eksplantaasien yhteisviljely Agrobacteriumin kanssa. 75 μM AS:n lisäämisen Agrobacterium-nesteviljelmään todettiin olevan optimaalinen vir-geenien induktioon.
Sonikoinnin (SAAT) lisäkäyttö johti korkeimpaan geeniekspressioon. GusA-geenin ilmentyminen karvaisissa juurissa todettiin parhaaksi, kun lehdet ja versonkärjet sonikoitiin vastaavasti 10 ja 20 sekunnin ajan. Parannetun protokollan muunnostehokkuus kirjattiin 66,5 % lehti- ja versonkärkien eksplantaasien osalta 59,5 %. Verrattuna muihin protokolliin tämän parannetun protokollan muunnostehokkuuden havaittiin olevan 2,5 kertaa suurempi lehdillä ja 3,7 kertaa enemmän versojen kärjillä. Southern blot -analyysit vahvistivat 1–2 kopiota gusA-siirtogeenistä linjoilla W1–W4, kun taas parannetun protokollan tuottamassa linjassa W5 havaittiin 1–4 siirtogeenikopiota.

Sonikaatioavusteisen Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) keston vaikutus W. somnifera -lehden (a) ja verson kärjen (b) eksplantaattien transformaatiotaajuuteen
(tutkimus ja grafiikka: © Dehdashti et ai., 2016)

Puuvillan ultraäänellä avustettu transformaatio

(2007) osoittavat sonikaatioavusteisen puuvillan transformaation myönteiset vaikutukset. Matalataajuisen ultraäänen aiheuttama akustinen kavitaatio luo mikrohaavoja kasvikudoksen pinnalle ja sen alapuolelle (sonoporaatio) ja mahdollistaa Agrobacteriumin kulkemisen syvemmälle ja kokonaan koko kasvikudokseen. Tämä haavoittava tapa lisää todennäköisyyttä tartuttaa syvemmällä kudoksessa olevia kasvisoluja. SAAT: n transformaatiotehokkuuden arvioimiseksi mitattiin GUS-geenin ilmentyminen. GUS-reportterijärjestelmä on reportterigeenijärjestelmä, joka on erityisen hyödyllinen kasvien molekyylibiologiassa ja mikrobiologiassa. Eri SAA-parametreja säätämällä GUS:n ohimenevää ilmentymistä puuvillassa käyttäen kypsiä alkioita eksplanttina parannettiin merkittävästi. GUS havaittiin ensimmäisen kerran 24 tuntia eksplantaasien inkuboinnin jälkeen ja 48 tunnin kuluttua GUS:n ilmentyminen oli erittäin voimakasta, mikä toimi hyödyllisenä indikaattorina puuvillan eksplantaatin onnistuneesta transformaatiosta sonikaatioavusteisen Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) jälkeen. Eri muunnostekniikoiden (nimittäin biolistinen, Agro, BAAT, SAAT), sonikaatioavusteisen Agrobacterium-välitteisen transformaation (SAAT) vertailu osoitti ylivoimaisesti parhaat transformaation tulokset.

Muunnosmenetelmän valinta GUS:n ohimenevän ilmentymisen perusteella. Sonikaatioavusteinen Agrobacterium-välitteinen transformaatio (SAAT) osoittaa huomattavasti suurempaa ohimenevää ilmentymistä.
(tutkimus ja grafiikka: © Hussain et al., 2007)

Korkean suorituskyvyn ultraääniratkaisut sonopporaatioon ja SAA: han

Hielscher Ultrasonics on pitkäaikainen kokemus korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteiden kehittämisestä ja valmistuksesta laboratorioihin, tutkimuslaitoksiin sekä teolliseen tuotantoon, jolla on erittäin suuri läpäisykyky. Mikrobiologian ja biotieteiden osalta Hielscher tarjoaa erilaisia ratkaisuja, jotka vastaavat tiettyjä kudoksia ja niiden hoitoja koskevia erilaisia vaatimuksia. Lukuisten näytteiden samanaikaiseen ultrasonicationiin Hielscher tarjoaa UIP400MTP multiwell-levyille, VialTweeterille jopa 10 injektiopullon (esim. Eppendorf-putket) tai ultraääni CupHorn. Koetintyyppisiä ultraäänilaitteita on saatavana 50 - 400 wattia laboratoriohomogenisaattoreina, kun taas teollisuusjärjestelmät kattavat tehoalueen 500 wattia - 16 kW.
Ota meihin yhteyttä ja kerro meille hakemus- ja prosessivaatimuksistasi. Kokenut henkilökuntamme suosittelee mielellään sopivinta ultraäänilaitetta biologiseen prosessiisi.
Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: