Ultrasonication on erittäin tehokas menetelmä kitiinin ja kitosaanin vapauttamiseksi sienilähteistä, kuten sienistä. Kitiini ja kitosaani on depolymeroitava ja deasetyylisoitava jatkokäsittelyssä korkealaatuisen biopolymeerin saamiseksi. Ultraäänellä avustettu depolymerointi ja deasetyyliaatio on erittäin tehokas, yksinkertainen ja nopea tekniikka, joka johtaa korkealaatuisiin kitosaaneihin, joilla on suuri molekyylipaino ja erinomainen biologinen hyötyosuus.

Sieniperäinen kitiini ja kitosaani ultrasonicationin kautta

Ruokana ja bioaktiivisten yhdisteiden uuttamiseen käytetään laajalti syötäviä ja lääkesieniä, kuten Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi tai reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (nappisienet), Hericium erinaceus (leijonanharja), Cordyceps sinensis (toukkasieni), Grifola frondosa (puun kana), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, kalkkunanhäntä) ja monia muita sienilajeja. Näitä sieniä sekä käsittelyjäännöksiä (sienijätettä) voidaan käyttää kitosaanin valmistukseen. Ultrasonication ei ainoastaan edistä kitiinin vapautumista sienisoluseinän rakenteesta, vaan myös ajaa kitiinin muuttumista arvokkaaksi kitosaaniksi ultraäänellä avustetun depolymeroinnin ja deasetyylioinnin kautta.

 

Intensiivinen ultrasonication, jossa käytetään koetintyyppistä ultraäänijärjestelmää, on tekniikka, jota käytetään kitiinin depolymeroinnin ja deasetyylioinnin edistämiseen, mikä johtaa kitosaanin muodostumiseen. Kitiini on luonnossa esiintyvä polysakkaridi, jota esiintyy äyriäisten, hyönteisten eksoskeletoneissa ja tiettyjen sienten soluseinissä. Kitosaani johdetaan kitiinistä poistamalla asetyyliryhmät kitiinimolekyylistä.

Ultraäänimenettely sieni-kitiinin muuntamiseksi kitosaaniksi

Kun kitiinin kitosaanin tuotantoon käytetään voimakasta ultrasonicationia, kitiinisuspensio sonikoidaan korkean intensiteetin matalataajuisilla ultraääniaalloilla, tyypillisesti alueella 20 kHz - 30 kHz. Prosessi tuottaa voimakasta akustista kavitaatiota, joka viittaa mikroskooppisten tyhjiökuplien muodostumiseen, kasvuun ja romahtamiseen nesteessä. Kavitaatio tuottaa paikallisia äärimmäisen suuria leikkausvoimia, korkeita lämpötiloja (jopa useita tuhansia celsiusasteita) ja paineita (jopa useita satoja ilmakehää) kavitaatiokuplia ympäröivässä nesteessä. Nämä äärimmäiset olosuhteet edistävät kitiinipolymeerin hajoamista ja sitä seuraavaa deasetyyliaatiota.
 

 

Kitiinin ultraäänidepolymerointi

Kitiinin depolymerointi tapahtuu mekaanisten voimien, kuten mikrostreamingin ja nestesuihkutuksen, yhteisvaikutusten sekä ultraäänellä aloitettujen kemiallisten reaktioiden avulla, joita aiheuttavat vapaat radikaalit ja muut kavitaation aikana muodostuneet reaktiiviset lajit. Kavitaation aikana syntyvät korkeapaineaallot aiheuttavat kitiiniketjujen leikkausjännityksen, mikä johtaa polymeerin leikkaamiseen pienemmiksi palasiksi.

Kitiinin ultraääni deasetyyliaatio

Depolymeroinnin lisäksi voimakas ultrasonication edistää myös kitiinin deasetyyliaatiota. Deasetyyliaatioon kuuluu asetyyliryhmien poistaminen kitiinimolekyylistä, mikä johtaa kitosaanin muodostumiseen. Voimakas ultraäänienergia, erityisesti kavitaation aikana syntyvät korkeat lämpötilat ja paineet, nopeuttavat deasetyyliaatioreaktiota. Kavitaation luomat reaktiiviset olosuhteet auttavat rikkomaan kitiinin asetyylisidokset, mikä johtaa etikkahapon vapautumiseen ja kitiinin muuttumiseen kitosaaniksi.
Kaiken kaikkiaan voimakas ultrasonication parantaa sekä depolymerointi- että deasetyyliointiprosesseja tarjoamalla tarvittavan mekaanisen ja kemiallisen energian kitiinipolymeerin hajottamiseksi ja kitosaaniksi muuntamisen helpottamiseksi. Tämä tekniikka tarjoaa nopean ja tehokkaan menetelmän kitosaanin valmistamiseksi kitiinistä, ja sillä on lukuisia sovelluksia eri teollisuudenaloilla, mukaan lukien lääkkeet, maatalous ja biolääketieteellinen tekniikka.

Teollinen kitosaanituotanto sienestä tehoultraäänellä

Kaupallinen kitiinin ja kitosaanin tuotanto perustuu pääasiassa meriteollisuuden jätteeseen (eli kalastukseen, simpukkakorjuuseen jne.). Eri raaka-ainelähteet johtavat erilaisiin kitiini- ja kitosaanilaatuihin, jotka johtuvat tuotannosta ja laadun vaihteluista, jotka johtuvat kausiluonteisista kalastusvaihteluista. Lisäksi sienilähteistä peräisin oleva kitosaani tarjoaa tiettävästi parempia ominaisuuksia, kuten homogeenisen polymeerin pituuden ja suuremman liukoisuuden verrattuna merilähteistä peräisin oleviin kitosaaneihin. (vrt. Ghormade et ai., 2017) Yhtenäisen kitosaanin toimittamiseksi kitiinin uuttamisesta sienilajeista on tullut vakaa vaihtoehtoinen tuotanto. Kitiinin ja citosaanin tuotanto sienistä voidaan helposti ja luotettavasti saavuttaa ultraääniuutto- ja deasetyyliointitekniikalla. Voimakas sonikaatio häiritsee solurakenteita kitiinin vapauttamiseksi ja edistää massansiirtoa vesiliuottimia erinomaisen kitiinin saannon ja uuttamistehokkuuden saavuttamiseksi. Seuraava ultraäänideasetyyliaatio muuntaa kitiinin arvokkaaksi kitosaaniksi. Molemmat ultraääni kitiiniuutto ja deasetyyliointi kitosaaniksi voidaan skaalata lineaarisesti mihin tahansa kaupalliseen tuotantotasoon.

Ultraäänikitiinin ja kitosaanin deasetyylioinnin tutkimustulokset

Zhu et al. (2018) päättelee tutkimuksessaan, että ultraäänideasetyyliaatio on osoittautunut ratkaisevaksi läpimurroksi, muuntamalla β-kitiini kitosaaniksi 83–94% deasetyyliaatiolla alennetuissa reaktiolämpötiloihin. Kuvassa vasemmalla on SEM-kuva ultraäänellä deasetyylistä kitosaanista (90 W, 15 min, 20 w / v% NaOH, 1:15 (g: ml) (kuva ja tutkimus: © Zhu et ai., 2018)
Heidän protokollassaan NaOH-liuos (20 w/v%) valmistettiin liuottamalla NaOH-hiutaleita DI-veteen. Alkaliliuos lisättiin sitten GLSP-sedimenttiin (0,5 g) kiinteän aineen ja nesteen suhteessa suhteessa 1:20 (g: ml) sentrifugiputkeen. Kitosaania lisättiin NaCl:aan (40 ml, 0,2 M) ja etikkahappoon (0,1 M) liuoksen tilavuussuhteessa 1:1. Sitten suspensio altistettiin ultraäänelle lievässä lämpötilassa 25 ° C 60 minuutin ajan anturityyppisellä ultraäänilaitteella (250W, 20 kHz). (vrt. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) havaitsi, että kitosaaniliuosten hajoamisnvauhtiin vaikuttavat harvoin polymeerin liuottamiseen käytetyn hapon pitoisuudet ja riippuvat suurelta osin ultraääniaaltojen lämpötilasta, voimakkuudesta ja polymeerin liuottamiseen käytetyn väliaineen ionisesta lujuudesta. (vrt. Pandit et ai., 2021)
 
(2019) käytti Ganoderma lucidum -itiöjauheita sieniraaka-aineena ja tutki ultraäänellä avustettua deasetyyliaatiota ja käsittelyparametrien, kuten sonikaatioajan, kiinteän ja nesteen suhteen, NaOH-pitoisuuden ja säteilytystehon, vaikutuksia kitosaanin deasetyyliaatioasteeseen (DD). Suurin DD-arvo saatiin seuraavilla ultraääniparametreilla: 20 minuutin sonikaatio 80 W: lla, 10% (g: ml) NaOH, 1:25 (g: ml). Ultraäänellä saadun kitosaanin pinnan morfologiaa, kemiallisia ryhmiä, lämpöstabiilisuutta ja kiteisyyttä tutkittiin käyttämällä SEM: ää, FTIR: ää, TG: tä ja XRD: tä. Tutkimusryhmä raportoi ultraäänellä tuotetun kitosaanin deasetyyliaatioasteen (DD), dynaamisen viskositeetin ([η]) ja molekyylipainon (Mv ̄) merkittävästä paranemisesta. Tulokset korostivat sienten ultraäänideasetyyliaatiotekniikkaa, joka on erittäin tehokas kitosaanin tuotantomenetelmä, joka soveltuu biolääketieteellisiin sovelluksiin. (vrt. Zhu et al., 2019)

Erinomainen kitosaanin laatu ultraäänidepolymeroinnilla ja deasetyyliaatiolla

Ultraäänellä vedettävät kitiinin / kitosaanin uuttamisen ja depolymeroinnin prosessit ovat tarkasti hallittavissa ja ultraääniprosessiparametrit voidaan säätää raaka-aineisiin ja kohdennettuun lopputuotteen laatuun (esim. molekyylipaino, deasetyyliointiaste). Tämä mahdollistaa ultraääniprosessin mukauttamisen ulkoisiin tekijöihin ja optimaalisten parametrien asettamisen ylivoimaiselle tulokselle ja tehokkuudelle.
Ultraäänellä deasetyylisoitu kitosaani osoittaa erinomaista biologista hyötyosuutta ja biologista yhteensopivuutta. Kun ultraäänellä valmistettuja kitosaanibiopolymeeriä verrataan biolääketieteellisiä ominaisuuksia koskevaan termisesti johdettuun kitosaaniin, ultraäänellä tuotetun kitosaanin fibroblastin (L929-solu) elinkelpoisuus ja lisääntynyt antibakteerinen aktiivisuus sekä Escherichia coli (E. coli) että Staphylococcus aureus (S. aureus) ovat parantuneet merkittävästi.
(vrt. Zhu et ai., 2018)
 

Korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteet kitiinin ja kitosaanin käsittelyyn

Kitiinin pirstoutuminen ja kitiinin detylaatio kitosaaniksi vaatii tehokkaita ja luotettavia ultraäänilaitteita, jotka voivat tuottaa suuria amplitudit, tarjoavat tarkan hallittavuuden prosessiparametreihin ja joita voidaan käyttää 24/7 raskaalla kuormituksella ja vaativissa ympäristöissä. Hielscher Ultrasonics -tuotevalikoima täyttää nämä vaatimukset luotettavasti. Erinomaisen ultraäänisuorituskyvyn lisäksi Hielscher-ultraäänilaitteilla on korkea energiatehokkuus, mikä on merkittävä taloudellinen etu – erityisesti kaupallisessa laajamittaisessa tuotannossa.
Hielscher-ultraääniastiat ovat korkean suorituskyvyn järjestelmiä, jotka voidaan varustaa lisävarusteilla, kuten sonotrodeilla, vahvistimilla, reaktoreilla tai virtaussoluilla, jotta ne vastaavat prosessitarpeitasi optimaalisesti. Digitaalisella värinäytöllä, mahdollisuudella esiasettaa sonikaatioajoja, automaattinen tietojen tallennus integroidulle SD-kortille, selaimen etäohjaus ja monia muita ominaisuuksia, Hielscher-ultraäänilaitteet takaavat korkeimman prosessinhallinnan ja käyttäjäystävällisyyden. Yhdessä kestävyyden ja raskaan kantavuuden kanssa Hielscherin ultraäänijärjestelmät ovat luotettava työhevonen tuotannossa. 
Kitiinin pirstoutuminen ja deasetyyliaatio vaativat voimakasta ultraääntä kohdennetun muunnoksen ja korkealaatuisen lopullisen kitosaanituotteen saamiseksi. Erityisesti kitiinihiutaleiden pirstoutumisessa ja depolymerointi- / deasetyyliaatiovaiheissa suuret amplitudit ja kohonneet paineet ovat ratkaisevia. Hielscher Ultrasonics teolliset ultraääniprosessorit tuottavat helposti erittäin korkeat amplitudit. Jopa 200 μm: n amplitudit voidaan ajaa jatkuvasti 24/7 toiminnassa. Vielä suuremmille amplitudille on saatavana räätälöityjä ultraäänisonotrodeja. Hielscherin ultraäänijärjestelmien tehokapasiteetti mahdollistaa tehokkaan ja nopean depolymeroinnin ja deasetyylioinnin turvallisessa ja käyttäjäystävällisessä prosessissa.
 

Seuraavassa taulukossa on merkintä ultrasonicatorien likimääräisestä käsittelykapasiteetista:

---

---

Synergistinen kitiinihoito parani ultraäänellä

Perinteisen kemiallisen ja entsymaattisen kitiininpoiston haittojen (eli alhaisen hyötysuhteen, korkeiden energiakustannusten, pitkän käsittelyajan, myrkyllisten liuottimien) voittamiseksi kitiinin ja kitosaanin käsittelyyn on integroitu korkean intensiteetin ultraääni. Korkean intensiteetin sonikaatio ja siitä johtuvat akustisen kavitaation vaikutukset johtavat polymeeriketjujen nopeaan leikkaamiseen ja vähentävät polydispersiyttä, mikä edistää kitosaanin synteesiä. Lisäksi ultraäänileikkausvoimat tehostavat massansiirtoa liuoksessa siten, että kemiallinen, hydrolyyttinen tai entsymaattinen reaktio paranee. Ultraäänikitiinihoito voidaan yhdistää jo olemassa oleviin kitiinin käsittelytekniikoihin, kuten kemiallisiin menetelmiin, hydrolyysiin tai entsymaattisiin menetelmiin.

Ultraäänellä avustettu kemiallinen deasetyyliaatio ja depolymerointi

Koska kitiini on ei-reaktiivinen ja liukenematon biopolymeeri, sille on suoritettava demineralisaatio-, deproteinisointi- ja depolymerointi- / deasetylaatiovaiheet liukoisen ja bioasisevan kitosaanin saamiseksi. Näihin prosessivaiheisiin kuuluu hoitoja vahvoilla hapoilla, kuten HCl: llä, ja vahvoilla emäksillä, kuten NaOH ja KOH. Koska nämä tavanomaiset prosessivaiheet ovat tehottomia, hitaita ja vaativat suuria energioita, prosessien tehostaminen sonikaatiolla parantaa kitosaanin tuotantoa merkittävästi. Teho-ultraäänen käyttö lisää kitosaanin saantoja ja laatua, vähentää prosessia päivistä muutamaan tuntiin, mahdollistaa lievemmät liuottimet ja tekee koko prosessista energiatehokkaamman.

Ultraäänellä parannettu kitiinin deproteinisointi

(2021) havaitsivat kitiinin proteiininpoistoa koskevassa tutkimuksessaan, että “Ultraäänen käyttö biopolymeerien valmistukseen vähensi kitiinin proteiinipitoisuutta ja hiukkaskokoa. Kitosaania, jolla oli korkea deasetyyliaatioaste ja keskimolekyylipaino, tuotettiin ultraääniavustuksella.”

Ultraäänihydrolyysi kitiinin depolymerointiin

Kemiallisessa hydrolyysissä käytetään joko happoja tai emäksiä kitiinin deasettyylaattiin, mutta alkalideasetyyliaatiota (esim. natriumhydroksidi NaOH) käytetään laajemmin. Happohydrolyysi on alternativ-menetelmä perinteiseen kemialliseen deasetyyliaatioon, jossa orgaanisia happoliuoksia käytetään kitiinin ja kitosaanin depolymerointiin. Happohydrolyysimenetelmää käytetään enimmäkseen silloin, kun kitiinin ja kitosaanin molekyylipainon on oltava homogeeninen. Tätä tavanomaista hydrolyysiprosessia kutsutaan hitaaksi ja energia- ja kustannusintensiiviseksi. Vahvojen happojen, korkeiden lämpötilojen ja paineiden vaatimus ovat tekijöitä, jotka muuttavat hydrolyyttisen kitosaaniprosessin erittäin kalliiksi ja aikaa vieväksi toimenpiteeksi. Käytetyt hapot vaativat jatkokäsittelyprosesseja, kuten neutralointia ja dealtointia.
Kun suuritehoinen ultraääni integroidaan hydrolyysiprosessiin, kitiinin ja kitosaanin hydrolyyttisen pilkkomisen lämpötila- ja painevaatimuksia voidaan alentaa merkittävästi. Lisäksi sonikaatio mahdollistaa pienemmät happopitoisuudet tai lievempien happojen käytön. Tämä tekee prosessista kestävämmän, tehokkaamman, kustannustehokkaamman ja ympäristöystävällisemmän.

Ultraäänellä avustettu kemiallinen deasetylaatio

Kitiinin ja kitosaanin kemiallinen hajoaminen ja deaktyyliaatio saavutetaan pääasiassa käsittelemällä kitiiniä tai kitosaania mineraalihapoilla (esim. suolahappo HCl), natriumnitriitillä (NaNO₂) tai vetyperoksidi (H₂O₂). Ultraääni parantaa deasetyyliaationopeutta, mikä lyhentää reaktioaikaa, joka tarvitaan kohdennetun deasetyylisen asteen saavuttamiseksi. Tämä tarkoittaa, että sonikaatio vähentää vaaditun käsittelyajan 12-24 tuntia muutamaan tuntiin. Lisäksi sonikaatio mahdollistaa huomattavasti pienemmät kemialliset pitoisuudet, esimerkiksi 40% (w / w) natriumhydroksidia sonikaatiolla, kun taas 65% (w / w) tarvitaan ilman ultraääniä.

Ultraääni-entsymaattinen deasetyyliaatio

Vaikka entsymaattinen deasetyyliointi on lievä, ympäristön kannalta hyvänlaatuinen käsittelymuoto, sen tehokkuus ja kustannukset ovat epätaloudellisia. Entsyymien monimutkaisen, työvoimavaltaisen ja kalliin loppupään eristämisen ja lopputuotteesta puhdistamisen vuoksi entsymaattista kitiinin deasetyyliaatiota ei toteuteta kaupallisessa tuotannossa, vaan sitä käytetään vain tieteellisessä tutkimuslaboratoriossa.
Ultraääni esikäsittely ennen entsymaattista deasetlytaatiofragmentteja kitiinimolekyylejä, mikä laajentaa pinta-alaa ja tuo enemmän pintaa entsyymien saataville. Korkean suorituskyvyn sonikaatio auttaa parantamaan entsymaattista deasetyyliaatiota ja tekee prosessista taloudellisemman.