Kitiinin ja kitosaanin tuotanto sienistä

Ultraäänikäsittely on erittäin tehokas menetelmä kitiinin ja kitosaanin vapauttamiseen sieniperäisistä lähteistä, kuten sienistä. Kitiini ja kitosaani on depolymeroitava ja deasetyloitava jatkokäsittelyssä korkealaatuisen biopolymeerin saamiseksi. Ultraääniavusteinen depolymerointi ja deasetylaatio on erittäin tehokas, yksinkertainen ja nopea tekniikka, jolla saadaan korkealaatuisia kitosaaneja, joilla on suuri molekyylipaino ja erinomainen biologinen hyötyosuus.

Sieniperäinen kitiini ja kitosaani ultraäänikäsittelyn avulla

Ruoka- ja lääkinnällisiä sieniä, kuten Lentinus edodes (siitake), Ganoderma lucidum (lingzhi eli reishi), Inonotus obliquus (pakurikääpä), Agaricus bisporus (herkkusieni), Hericium erinaceus (siiliorakas), Cordyceps sinensis (kiinanloisikka), Grifola frondosa (koppelokääpä), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, silkkivyökääpä) ja monia muita sienilajeja, käytetään laajalti ravinnoksi ja bioaktiivisten yhdisteiden uuttamiseen. Näitä sieniä sekä käsittelyjäännöksiä (sienijätettä) voidaan käyttää kitosaanin tuottamiseen. Ultraäänikäsittely edistää kitiinin vapautumista sienten soluseinärakenteesta ja myös muuntaa kitiiniä arvokkaaksi kitosaaniksi ultraääniavusteisen depolymeroinnin ja deasetylaation avulla.

Ultraäänikäsittely edistää kitiinin depolymerointia ja deasetylaatiota kitosaaniksi

Voimakas ultraäänikäsittely anturityyppisellä ultraäänijärjestelmällä on tekniikka, jolla edistetään kitiinin depolymerointia ja deasetylaatiota, mikä johtaa kitosaanin muodostumiseen. Kitiini on luonnossa esiintyvä polysakkaridi, jota on äyriäisten ja hyönteisten ulkoisissa tukirangoissa sekä tiettyjen sienten soluseinissä. Kitosaania saadaan kitiinistä poistamalla kitiinimolekyylistä asetyyliryhmät.

Ultraäänimenetelmä sieniperäisen kitiinin muuntamiseen kitosaaniksi

Kun kitosaanin tuotantoon kitiinistä käytetään voimakasta ultraäänikäsittelyä, kitiinisuspensiota käsitellään voimakkailla, matalataajuisilla ultraääniaalloilla, joiden taajuus on tyypillisesti 20 kHz–30 kHz. Prosessi synnyttää voimakasta akustista kavitaatiota, jolla tarkoitetaan mikroskooppisten tyhjiökuplien muodostumista, kasvua ja luhistumista nesteessä. Kavitaatio synnyttää paikallisesti äärimmäisen suuria leikkausvoimia, korkeita lämpötiloja (jopa useita tuhansia celsiusasteita) ja paineita (jopa useita satoja ilmakehiä) kavitaatiokuplia ympäröivässä nesteessä. Nämä äärimmäiset olosuhteet edistävät kitiinipolymeerin hajoamista ja sitä seuraavaa deasetylaatiota.
 

SEM-kuvia kahdesta sienilajista saaduista kitiineistä ja kitos aaneista: a) L. vellereus -lajista saatu kitiini; b) P. ribis -lajista saatu kitiini; c) L.vellereus-lajista saatu kitosaani; d) P. ribis -lajista saatu kitosaani.
kuva ja tutkimus: © Erdoğan et al., 2017

Kitiinin depolymerointi ultraäänellä

Kitiinin depolymerointi tapahtuu mekaanisten voimien, kuten mikrovirtausten ja nestesuihkujen, yhteisvaikutuksesta sekä ultraäänen käynnistämien kemiallisten reaktioiden avulla. Näitä reaktioita aiheuttavat kavitaation aikana muodostuvat vapaat radikaalit ja muut reaktiiviset lajit. Kavitaation aikana syntyvät korkeapaineaallot kohdistavat kitiiniketjuihin leikkausjännitystä, jolloin polymeeri katkeaa pienemmiksi fragmenteiksi.

Kitiinin deasetylaatio ultraäänellä

Depolymeroinnin lisäksi voimakas ultraäänikäsittely edistää myös kitiinin deasetylaatiota. Deasetylaatiossa kitiinimolekyylistä poistetaan asetyyliryhmät, mikä johtaa kitosaanin muodostumiseen. Voimakas ultraäänienergia, erityisesti kavitaation aikana syntyvät korkeat lämpötilat ja paineet, nopeuttaa deasetylaatioreaktiota. Kavitaation luomat reaktiiviset olosuhteet auttavat katkaisemaan kitiinin asetyylisidoksia, jolloin etikkahappoa vapautuu ja kitiini muuttuu kitosaaniksi.
Kaiken kaikkiaan voimakas ultraäänikäsittely tehostaa sekä depolymerointi- että deasetylaatioprosesseja tuottamalla tarvittavan mekaanisen ja kemiallisen energian kitiinipolymeerin hajottamiseen ja kitosaaniksi muuntamisen helpottamiseen. Tämä tekniikka tarjoaa nopean ja tehokkaan menetelmän kitosaanin tuottamiseen kitiinistä. Sillä on lukuisia sovelluksia eri aloilla, kuten lääketeollisuudessa, maataloudessa ja biolääketieteellisessä tekniikassa.

Kitosaanin teollinen tuotanto sienistä teho-ultraäänellä

Kitiinin ja kitosaanin kaupallinen tuotanto perustuu pääasiassa merielinkeinojen jätteisiin (eli kalastuksen, äyriäisten ja simpukoiden pyynnin jne. jätteisiin). Erilaiset raaka-ainelähteet tuottavat laadultaan erilaista kitiiniä ja kitosaania, mikä johtaa tuotannon ja laadun vaihteluihin kalastuksen kausivaihtelujen vuoksi. Lisäksi sieniperäisistä lähteistä saadulla kitosaanilla on raportoidusti parempia ominaisuuksia, kuten tasainen polymeeriketjujen pituus ja parempi liukoisuus, verrattuna meriperäisistä lähteistä saatuun kitosaaniin. (vrt. Ghormade et al., 2017) Tasalaatuisen kitosaanin toimittamiseksi kitiinin uuttamisesta sienilajeista on tullut vakaa vaihtoehtoinen tuotantotapa. Kitiinin ja kitosaanin tuotanto sienistä voidaan toteuttaa helposti ja luotettavasti ultraääniuutto- ja deasetylaatiotekniikalla. Voimakas ultraäänikäsittely hajottaa solurakenteita kitiinin vapauttamiseksi ja edistää aineensiirtoa vesipohjaisissa liuottimissa, jolloin saavutetaan erinomainen kitiinisaanto ja uuttotehokkuus. Sitä seuraava ultraäänideasetylaatio muuntaa kitiinin arvokkaaksi kitosaaniksi. Sekä kitiinin ultraääniuutto että deasetylaatio kitosaaniksi voidaan skaalata lineaarisesti mille tahansa kaupalliselle tuotantotasolle.

Ultraäänikäsittely tehostaa sieniperäisen kitosaanin tuotantoa ja tekee tuotannosta tehokkaampaa ja taloudellisempaa.
(kuva ja tutkimus: © Zhu et al., 2019)

Tutkimustuloksia kitiinin ja kitosaanin ultraäänideasetylaatiosta

Zhu et al. (2018) päättelevät tutkimuksessaan, että ultraäänideasetylaatio on osoittautunut ratkaisevaksi läpimurroksi, jolla β-kitiini muunnetaan kitosaaniksi 83–94%:n deasetylaatioasteella alennetuissa reaktiolämpötiloissa. Vasemmalla oleva kuva on SEM-kuva ultraäänellä deasetyloidusta kitosaanista (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (kuva ja tutkimus: © Zhu et al., 2018)
Heidän menetelmässään NaOH-liuos (20 w/v %) valmistettiin liuottamalla NaOH-hiutaleita deionisoituun veteen. Emäsliuos lisättiin sitten GLSP-sakkaan (0,5 g) sentrifugiputkessa kiinteän aineen ja nesteen suhteessa 1:20 (g: mL). Kitosaania lisättiin NaCl:ään (40 mL, 0,2 M) ja etikkahappoon (0,1 M) liuosten tilavuussuhteessa 1:1. Suspensiota käsiteltiin sitten ultraäänellä maltillisessa 25°C:n lämpötilassa 60 min ajan anturityyppisellä ultraäänilaitteella (250W, 20kHz). (vrt. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) havaitsivat, että polymeerin liuottamiseen käytettyjen happojen pitoisuudet vaikuttavat harvoin kitosaaniliuosten hajoamisnopeuteen. Se riippuu suurelta osin lämpötilasta, ultraääniaaltojen intensiteetistä ja polymeerin liuottamiseen käytettyjen väliaineiden ionivahvuudesta. (vrt. Pandit et al., 2021)
 
Toisessa tutkimuksessa Zhu et al. (2019) käyttivät sieniperäisenä raaka-aineena Ganoderma lucidum -itiöjauheita ja tutkivat ultraääniavusteista deasetylaatiota sekä prosessiparametrien, kuten ultraäänikäsittelyajan, kiinteän aineen ja nesteen suhteen, NaOH-pitoisuuden ja säteilytystehon, vaikutuksia kitosaanin deasetylaatioasteeseen (DD). Suurin DD-arvo saavutettiin seuraavilla ultraääniparametreilla: 20 min ultraäänikäsittely 80W:n teholla, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Ultraäänellä saadun kitosaanin pinnan morfologiaa, kemiallisia ryhmiä, lämpöstabiiliutta ja kiteisyyttä tutkittiin SEM-, FTIR-, TG- ja XRD-menetelmillä. Tutkimusryhmä raportoi ultraäänellä tuotetun kitosaanin deasetylaatioasteen (DD), dynaamisen viskositeetin ([η]) ja molekyylipainon (Mv¯) merkittävästä kasvusta. Tulokset korostivat sienten ultraäänideasetylaatiotekniikan olevan erittäin tehokas tuotantomenetelmä kitosaanille, joka soveltuu biolääketieteellisiin sovelluksiin. (vrt. Zhu et al., 2019)

Erinomainen kitosaanin laatu ultraäänidepolymeroinnilla ja -deasetylaatiolla

Ultraääneen perustuvia kitiinin / kitosaanin uutto- ja depolymerointiprosesseja voidaan hallita tarkasti, ja ultraääniprosessin parametrit voidaan sovittaa raaka-aineisiin ja tavoiteltuun lopputuotteen laatuun (esim. molekyylipainoon ja deasetylaatioasteeseen). Tämä mahdollistaa ultraääniprosessin mukauttamisen ulkoisiin tekijöihin ja optimaalisten parametrien asettamisen erinomaisen tuloksen ja tehokkuuden saavuttamiseksi.
Ultraäänellä deasetyloidun kitosaanin biologinen hyötyosuus ja bioyhteensopivuus ovat erinomaisia. Kun ultraäänellä valmistettuja kitosaanibiopolymeerejä verrataan lämpökäsittelyllä saatuun kitosaaniin biolääketieteellisten ominaisuuksien osalta, ultraäänellä tuotettu kitosaani osoittaa merkittävästi parantunutta fibroblastien (L929-solujen) elinkykyä ja tehostunutta antibakteerista aktiivisuutta sekä Escherichia coli (E. coli) -bakteeria että Staphylococcus aureus (S. aureus) -bakteeria vastaan.
(vrt. Zhu et al., 2018)
 

Pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvia (SEM) 100× suurennoksella: a) gladius, b) ultraäänellä käsitelty gladius, c) β-kitiini, d) ultraäänellä käsitelty β-kitiini ja e) kitosaani (lähde: Preto et al. 2017)

Tehokkaat ultraäänilaitteet kitiinin ja kitosaanin käsittelyyn

Kitiinin fragmentointi ja kitiinin deasetylaatio kitosaaniksi edellyttävät tehokkaita ja luotettavia ultraäänilaitteita, jotka tuottavat suuria amplitudeja, mahdollistavat prosessiparametrien tarkan hallinnan ja joita voidaan käyttää 24/7 raskaassa kuormituksessa ja vaativissa ympäristöissä. Hielscher Ultrasonics täyttää tuotevalikoimallaan nämä vaatimukset luotettavasti. Hielscher tarjoaa ultraäänilaitteissaan erinomaisen ultraäänisuorituskyvyn lisäksi korkean energiatehokkuuden, mikä on merkittävä taloudellinen etu – erityisesti kaupallisessa suurtuotannossa.
Hielscher tarjoaa tehokkaita ultraäänijärjestelmiä, jotka voidaan varustaa lisävarusteilla, kuten sonotrodeilla, amplitudinvahvistimilla, reaktoreilla tai virtauskennoilla, jotta ne vastaavat prosessisi tarpeita optimaalisesti.
 Digitaalisen värinäytön, ultraäänikäsittelyjaksojen esiasetusmahdollisuuden, integroidulle SD-kortille tapahtuvan automaattisen tietojen tallennuksen, selaimella tapahtuvan etähallinnan ja monien muiden ominaisuuksien ansiosta Hielscher takaa ultraäänilaitteillaan parhaan prosessinhallinnan ja käyttäjäystävällisyyden. Hielscher tarjoaa kestäviä ja suurta kuormitusta sietäviä ultraäänijärjestelmiä, jotka ovat tuotantosi luotettavia työjuhtia. 
Kitiinin fragmentointi ja deasetylaatio edellyttävät voimakasta ultraääntä tavoitellun muuntumisen ja korkealaatuisen kitosaanilopputuotteen saamiseksi. Erityisesti kitiinihiutaleiden fragmentoinnissa ja depolymerointi- / deasetylaatiovaiheissa suuret amplitudit ja kohotetut paineet ovat ratkaisevan tärkeitä. Hielscher Ultrasonics tarjoaa teollisia ultraääniprosessoreita, jotka tuottavat helposti erittäin suuria amplitudeja. Jopa 200µm:n amplitudeja voidaan käyttää jatkuvasti 24/7-käytössä. Vielä suurempia amplitudeja varten on saatavilla räätälöityjä ultraäänisonotrodeja. Hielscher tarjoaa ultraäänijärjestelmissään tehokapasiteetin, joka mahdollistaa tehokkaan ja nopean depolymeroinnin ja deasetylaation turvallisessa ja käyttäjäystävällisessä prosessissa.
 

Ultraäänikäsittelyllä tehostettu synergistinen kitiinin käsittely

Perinteisen kemiallisen ja entsymaattisen kitiinin deasetylaation haittojen (eli heikon tehokkuuden, korkeiden energiakustannusten, pitkän käsittelyajan ja myrkyllisten liuottimien) voittamiseksi kitiinin ja kitosaanin käsittelyyn on integroitu voimakasta ultraääntä. Voimakas ultraäänikäsittely ja siitä aiheutuvat akustisen kavitaation vaikutukset johtavat polymeeriketjujen nopeaan katkeamiseen ja vähentävät polydispersiteettiä, mikä edistää kitosaanin synteesiä. Lisäksi ultraäänen leikkausvoimat tehostavat aineensiirtoa liuoksessa, jolloin kemialliset, hydrolyyttiset tai entsymaattiset reaktiot tehostuvat. Kitiinin ultraäänikäsittely voidaan yhdistää jo olemassa oleviin kitiinin käsittelytekniikoihin, kuten kemiallisiin menetelmiin, hydrolyysiin tai entsymaattisiin menetelmiin.

Ultraääniavusteinen kemiallinen deasetylaatio ja depolymerointi

Koska kitiini on reagoimaton ja liukenematon biopolymeeri, sen on käytävä läpi demineralisointi-, deproteinointi- ja depolymerointi- / deasetylaatiovaiheet liukoisen ja biologisesti saatavilla olevan kitosaanin saamiseksi. Näihin prosessivaiheisiin sisältyy käsittelyjä vahvoilla hapoilla, kuten HCl:llä, ja vahvoilla emäksillä, kuten NaOH:lla ja KOH:lla. Koska nämä tavanomaiset prosessivaiheet ovat tehottomia, hitaita ja vaativat paljon energiaa, prosessin tehostaminen ultraäänikäsittelyllä parantaa kitosaanin tuotantoa merkittävästi. Teho-ultraäänen käyttö lisää kitosaanin saantoja ja parantaa sen laatua, lyhentää prosessin päivistä muutamaan tuntiin, mahdollistaa miedompien liuottimien käytön ja tekee koko prosessista energiatehokkaamman.

Ultraäänellä tehostettu kitiinin deproteinointi

Vallejo-Dominguez et al. (2021) havaitsivat kitiinin deproteinointia koskevassa tutkimuksessaan, että ”ultraäänen käyttö biopolymeerien tuotannossa vähensi kitiinin proteiinipitoisuutta ja hiukkaskokoa. Ultraäänen avulla tuotettiin kitosaania, jolla oli korkea deasetylaatioaste ja keskimääräinen molekyylipaino.”

Ultraäänihydrolyysi kitiinin depolymerointiin

Kemiallisessa hydrolyysissä kitiinin deasetylointiin käytetään joko happoja tai emäksiä, mutta emäksillä (esim. natriumhydroksidilla NaOH) tehtävä deasetylaatio on yleisemmin käytössä. Happohydrolyysi on vaihtoehtoinen menetelmä perinteiselle kemialliselle deasetylaatiolle, ja siinä kitiiniä ja kitosaania depolymeroidaan orgaanisilla happoliuoksilla. Happohydrolyysimenetelmää käytetään useimmiten silloin, kun kitiinin ja kitosaanin molekyylipainon on oltava tasainen. Tämä tavanomainen hydrolyysiprosessi tunnetaan hitaana sekä energiaa ja kustannuksia vaativana. Vahvojen happojen, korkeiden lämpötilojen ja paineiden tarve tekee hydrolyyttisestä kitosaaniprosessista erittäin kalliin ja aikaa vievän menetelmän. Käytetyt hapot edellyttävät jatkokäsittelyjä, kuten neutralointia ja suolanpoistoa.
Kun hydrolyysiprosessiin integroidaan suuritehoinen ultraääni, kitiinin ja kitosaanin hydrolyyttisen pilkkomisen lämpötila- ja painevaatimuksia voidaan alentaa merkittävästi. Lisäksi ultraäänikäsittely mahdollistaa pienemmät happopitoisuudet tai miedompien happojen käytön. Tämä tekee prosessista kestävämmän, tehokkaamman, kustannustehokkaamman ja ympäristöystävällisemmän.

Ultraääniavusteinen kemiallinen deasetylaatio

Kitiinin ja kitosaanin kemiallinen hajotus ja deasetylaatio toteutetaan pääasiassa käsittelemällä kitiiniä tai kitosaania mineraalihapoilla (esim. suolahapolla HCl), natriumnitriitillä (NaNO₂) tai vetyperoksidilla (H₂O₂). Ultraääni parantaa deasetylaationopeutta ja lyhentää siten tavoitellun deasetylaatioasteen saavuttamiseen tarvittavaa reaktioaikaa. Tämä tarkoittaa, että ultraäänikäsittely lyhentää tarvittavan käsittelyajan 12–24 tunnista muutamaan tuntiin. Lisäksi ultraäänikäsittely mahdollistaa huomattavasti pienemmät kemikaalipitoisuudet, esimerkiksi 40% (w/w) natriumhydroksidia ultraäänikäsittelyä käytettäessä, kun ilman ultraääntä tarvitaan 65% (w/w).

Ultraääniavusteinen entsymaattinen deasetylaatio

Vaikka entsymaattinen deasetylaatio on mieto ja ympäristölle haitaton käsittelytapa, se on tehokkuutensa ja kustannustensa kannalta epätaloudellinen. Koska entsyymien eristäminen lopputuotteesta ja puhdistaminen jatkokäsittelyssä on monimutkaista, työlästä ja kallista, kitiinin entsymaattista deasetylaatiota ei käytetä kaupallisessa tuotannossa vaan ainoastaan tieteellisissä tutkimuslaboratorioissa.
Ultraääniesikäsittely ennen entsymaattista deasetylaatiota fragmentoi kitiinimolekyylejä, mikä suurentaa pinta-alaa ja antaa entsyymien käyttöön enemmän pintaa. Tehokas ultraäänikäsittely auttaa tehostamaan entsymaattista deasetylaatiota ja tekee prosessista taloudellisemman.