کاربردهای فراصوت در ارتباط با ویروس آبلهٔ میمونی
فراصوت‌دهی روشی مهم در پردازش برای جداسازی ویروس آبلهٔ میمونی (MPXV) از نمونه‌های تحلیلی، قطعه‌قطعه‌سازی DNA ویروس و همچنین تولید واکسن آبلهٔ میمونی است. برای آماده‌سازی نمونه پیش از تشخیص و آنالیز (PCR، ELISA و غیره)، از فراصوت‌دهی برای لیز سلول‌ها استفاده می‌شود تا ویروس آبلهٔ میمونی از درون سلول آزاد شود و / یا DNA قطعه‌قطعه شود. در تولید واکسن، کاربردها شامل آماده‌سازی ذرات ویروس / DNA، کپسوله‌سازی در حامل‌های دارویی و فرمولاسیون مایه‌های تلقیح است.
در ادامه می‌توانید اطلاعات مفصلی دربارهٔ آماده‌سازی فراصوتی نمونه‌های ویروس آبلهٔ میمونی و همچنین تولید واکسن MPXV به کمک فراصوت بیابید.
آنچه در این صفحه خواهید یافت:
- لیز فراصوتی برای استخراج ویروس آبلهٔ میمونی
- قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA ویروس آبلهٔ میمونی
- کاربردهای فراصوت در تولید واکسن MPXV
این سامانهٔ سونیکاتورهای 2x 1kW برای کارکرد با جریان پیوسته در یک مرکز تولید واکسن نصب شده است.
لیز فراصوتی و قطعه‌قطعه‌سازی DNA پیش از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)
عفونت ویروس آبلهٔ میمونی با آزمون تکثیر اسید نوکلئیک (NAAT)، با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) بلادرنگ یا متداول، برای شناسایی توالی‌های منحصربه‌فرد DNA ویروسی تشخیص داده می‌شود. نمونه (برای مثال، حاصل از سواب نازوفارنکس یا نمونه‌برداری‌های بافتی پوست) حاوی ویروس درون سلول‌هاست.
برای آنالیز، ویروس باید از سلول‌ها آزاد شود و DNA ویروسی باید برای PCR قطعه‌قطعه شود.
لیز فراصوتی:
تخریب سلولی / لیز فراصوتی روشی قابل‌اعتماد و کارآمد برای جداسازی ویروس‌ها از نمونه‌های سلولی است و ازاین‌رو نسبت به عوامل شیمیایی مانند لیزوزیم، پروتئیناز K و شوینده‌های مختلف که به‌عنوان روش جایگزین برای لیز سلول و آزادسازی DNA استفاده می‌شوند، روشی ارجح است.
بااین‌حال، استفاده از چنین معرف‌های شیمیایی مستلزم آماده‌سازی زمان‌بر نمونه در چند مرحله پیش از آنالیز PCR است تا از مهار واکنش PCR جلوگیری شود. ازآنجاکه مهارکننده‌های PCR بر کارایی تکثیر تأثیر می‌گذارند، تغییرات اندک در مقدار مهارکننده‌هایی که حذف نشده‌اند می‌تواند به تغییرات بزرگ در تکثیر محصول PCR منجر شود (Diaco, 1995).
مزیت فراصوت‌دهی برای لیز این است که تخریب کامل ساختارهای سلولی و آزادسازی DNA بدون نیاز به معرف‌های لیزکننده و آماده‌سازی زمان‌بر نمونه، مطلوب است. (رجوع کنید به Fykse et al., 2003)
قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA:
قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA ساده و قابل‌اعتماد است، زیرا قطعات DNA با طول قابل‌تنظیم (جفت‌باز، bp) تولید می‌کند. با استفاده از فراصوت می‌توان DNA را به‌طور مؤثر به قطعاتی با طول هدف تقسیم کرد. کنترل دقیق پارامترهای فراصوت و گزینه‌های پیشرفتهٔ خنک‌سازی از تخریب DNA جلوگیری می‌کنند.
دربارهٔ قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی DNA بیشتر بخوانید!
کاربردهای فراصوت در واکسن ویروس آبلهٔ میمونی
واکسن‌هایی که در حال حاضر علیه ویروس آبلهٔ میمونی استفاده می‌شوند، واکسن‌های ویروس زنده هستند. واکسن‌های تازه‌توسعه‌یافته ممکن است از پلتفرم‌های دیگری مانند پلتفرم‌های مبتنی بر DNA استفاده کنند. در حال حاضر حاوی ویروس اصلاح‌شدهٔ Vaccinia Ankara، یک ارتوپاکس‌ویروس تضعیف‌شده و فاقد قابلیت تکثیر، است. همچنین حاوی Tris (تریس‌آمینومتان) و سدیم کلرید است. این واکسن ممکن است مقادیر کمی DNA و پروتئین حاصل از سلول‌های فیبروبلاست جنین مرغ، که برای رشد ویروس واکسن به کار می‌روند، بنزوناز و ترکیبات آنتی‌بیوتیکی مانند جنتامایسین و سیپروفلوکساسین نیز داشته باشد.
همگن‌سازی فراصوتی در تولید واکسن‌های ویروس زندهٔ تضعیف‌شده، واکسن‌های DNA، ترکیب‌های چندظرفیتی DNA، واکسن‌های mRNA، واکسن‌های پروتئین نوترکیب، واکسن‌های ذرات شبه‌ویروسی و غیره به کار می‌رود.
- پراکنش ذرات ویروس و عوامل
- امولسیون‌سازی
- غیرفعال‌سازی ویروس‌ها
- فرمولاسیون حامل دارویی (NLC, SLN)
- کپسوله‌سازی
- حل‌کردن عوامل
- آماده‌سازی ادجوانت‌ها
- گاززدایی / هواگیری
می‌توانید اطلاعات جامع‌تری دربارهٔ کاربردهای فراصوت برای بهبود تولید واکسن بیابید!
پروتکل جداسازی فراصوتی ویروس آبلهٔ میمونی
تیم پژوهشی Stittelaar (2005) از لیز فراصوتی برای آزادسازی ویروس آبلهٔ میمونی از کشت سلول‌های میزبان رشد و همچنین از سلول‌های به‌دست‌آمده با سواب حلقِ نخستی‌های آلوده استفاده کرد.
آماده‌سازی واکسن آبلهٔ میمونی:
ویروس‌های آبلهٔ میمونی روی سلول‌های فیبروبلاست جنین مرغِ عاری از عوامل بیماری‌زای مشخص رشد داده شدند. پس از انکوباسیون به‌مدت 1 تا 2 روز، سوسپانسیون ویروس–سلول با یک چرخهٔ انجماد و ذوب برداشت و سپس با سانتریفیوژ تغلیظ شد. رسوب دوباره به حالت تعلیق درآمد و تحت چند چرخه همگن‌سازی فراصوتی قرار گرفت.
جداسازی ویروس آبلهٔ میمونی از ماکاک‌های واکسینه‌شده:
نمونه‌ها سه بار منجمد و ذوب شدند و در یک CupHorn فراصوتی تحت فراصوت‌دهی قرار گرفتند. دو رقت (1:10 و 1:100) در محیط انتقالِ مکمل‌شده با 1% سرم جنین گاوی، برای تلقیح تک‌لایه‌های سلول Vero در پلیت‌های شش‌چاهکی به کار رفتند. پس از انکوباسیون به‌مدت 1 h در 37°C، مایه‌های تلقیح برداشته و با محیط کشت مکمل‌شده با 1% سرم جنین گاوی جایگزین شدند. تک‌لایه‌ها به‌مدت 5 روز در 37°C کشت داده و با محلول کریستال ویوله رنگ‌آمیزی شدند.
(رجوع کنید به Stittelaar et al., 2005)
سونیکاتورها برای آنالیز ویروس و تولید واکسن
سبد گستردهٔ محصولات Hielscher Ultrasonics، سونیکاتور ایدئال را برای آزمایشگاه‌های پژوهشی و تحلیلی و همچنین تولید صنعتی واکسن ارائه می‌دهد.
Hielscher Ultrasonics در طراحی، ساخت و توزیع سونیکاتورهای پربازده و زیست‌راکتورهای فراصوتی برای استفاده در آزمایشگاه‌های پژوهشی و تحلیلی و همچنین به‌کارگیری در تولید صنعتی واکسن تخصص دارد (برای مثال، واکسن‌ها, مواد مؤثرهٔ دارویی (APIs)).
فراصوت‌دهی را می‌توان در ظروف باز، راکتورهای بسته با هم‌زدن مداوم و راکتورهای عبوری با جریان پیوسته انجام داد. تمام قطعات سامانه‌های فراصوتی که با محیط مایع تماس دارند از فولاد زنگ‌نزن، تیتانیوم یا شیشه ساخته شده‌اند. قطعات قابل‌اتوکلاو و اتصالات بهداشتی تضمین می‌کنند که تولید در این شرایط انجام شود: شرایط مطابق با الزامات تولید دارویی.
ثبت خودکار داده‌ها: نرم‌افزار هوشمند، پارامترهای فرایند فراصوت‌دهی را به‌طور خودکار روی کارت حافظهٔ SD تعبیه‌شده ثبت می‌کند. کنترل دقیق تمام پارامترهای فرایند، این موارد را تضمین می‌کند: تکرارپذیری, استانداردسازی تولید؛ همچنین، این کنترل دقیق رعایت استانداردهای ایمنی محصولات دارویی را تسهیل می‌کند.
پردازشگرهای فراصوتی Hielscher Ultrasonics بسیار قابل‌اعتماد هستند و می‌توان آن‌ها را به‌دقت کنترل کرد. تمام سونیکاتورهای صنعتی را می‌توان برای ارائهٔ گسترهٔ کامل دامنه‌های ارتعاش، از پایین تا بسیار بالا، تنظیم کرد. استحکام سامانه‌های فراصوتی Hielscher امکان کارکرد 24/7 تحت بار کاری سنگین و در محیط‌های دشوار را فراهم می‌کند.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سونیکاتورهای ما ارائه می‌دهد:
| حجم بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| پلیت‌های چندچاهکی / میکروتیتر | قابل‌اعمال نیست | UIP400MTP |
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0٫1 تا 20L | 0٫2 تا 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 تا 100L | 2 تا 10L/min | UIP4000hdT |
| قابل‌اعمال نیست | 10 تا 100L/min | UIP16000 |
| قابل‌اعمال نیست | بیشتر | مجموعه‌ای از دستگاه‌های UIP16000 |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
برش فراصوتی DNA
اقتباس از Jkwchui تحت مجوز CC-BY-SA.03
منابع علمی / مراجع
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
دانستنی‌ها
ویروس آبلهٔ میمونی
آبلهٔ میمونی (MPV، MPXV یا hMPXV) گونه‌ای ویروس با DNA دورشته‌ای است که یک بیماری ویروسی مشترک بین انسان و حیوان ایجاد می‌کند. این بیماری با نام عفونت آبلهٔ میمونی شناخته می‌شود و می‌تواند در انسان‌ها و حیوانات رخ دهد. این ویروس به سردهٔ Orthopoxvirus از خانوادهٔ Poxviridae تعلق دارد. ویروس آبلهٔ میمونی در کنار ویروس‌های واریولا (VARV)، آبلهٔ گاوی (CPX) و واکسینیا (VACV)، یکی از ارتوپاکس‌ویروس‌های انسانی است. ارتوپاکس‌ویروس‌ها با ذرات ویروسی بزرگ و آجری‌شکل مشخص می‌شوند که حاوی ژنوم DNA دورشته‌ای با طول تقریبی 200٬000 bp هستند.
آزمون ELISA
ELISA مخفف آزمون ایمونوسوربنت متصل به آنزیم است و یک سنجش ایمنی نشان‌دار است که استاندارد طلایی سنجش‌های ایمنی به شمار می‌رود. ELISA یک آزمون ایمنی‌شناختی است که به‌دلیل حساسیت تشخیصی بالای خود ارزشمند است و برای شناسایی و اندازه‌گیری کمی مولکول‌ها، از جمله آنتی‌بادی‌ها، آنتی‌ژن‌ها، پروتئین‌ها، گلیکوپروتئین‌ها و هورمون‌ها استفاده می‌شود. اساس ELISA بر برهم‌کنش آنتی‌ژن–آنتی‌بادی استوار است. در این برهم‌کنش آنتی‌ژن–آنتی‌بادی، آنتی‌بادی‌های اختصاصی به آنتی‌ژن هدف خود متصل می‌شوند. تنها زمانی که این برهم‌کنش رخ دهد، سوبسترا می‌تواند به آنزیم متصل شود و تبدیل بعدی سوبسترا قابل‌مشاهده باشد؛ این به معنای به‌دست‌آمدن نتیجهٔ مثبت است.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی پربازده را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.