جداسازی تجمعات سلولی نمونه‌های باکتریایی با فراصوت

نمونه‌های باکتریایی به‌ندرت به‌صورت سوسپانسیون‌های واقعاً تک‌سلولی دریافت می‌شوند. کشت‌ها به‌شکل زنجیره و لخته رشد می‌کنند، جدایه‌های محیطی تجمعاتی تشکیل می‌دهند که مواد پلیمری خارج‌سلولی آن‌ها را به هم متصل می‌کنند، و رسوب‌های حاصل از سانتریفیوژ اغلب با وجود ورتکس‌کردن کامل، به‌سختی دوباره معلق می‌شوند. شمارش سلول‌های زنده، چگالی نوری، فلوسایتومتری و تعیین پروفایل میکروبیوم همگی بر این فرض استوارند که هر ذره معادل یک سلول است. جداسازی تجمعات سلولی با فراصوت این تعارض را برطرف می‌کند: دوره‌های کوتاه و کنترل‌شدهٔ فراصوت‌دهی، تجمعات را بدون لیزکردن سلول‌ها به سلول‌های منفرد جدا می‌کنند.

چرا تجمع سلولی اعتبار نتایج شما را به خطر می‌اندازد

تجمع سلولی یک ویژگی زیستی است، نه خطای آماده‌سازی. Staphylococcus، Streptococcus، Lactobacillus، Actinomyces و بسیاری از گونه‌های محیطی به‌شکل زنجیره، خوشه یا قطعات بیوفیلم رشد می‌کنند، و DNA خارج‌سلولی و پلی‌ساکاریدها سلول‌ها را در رسوب‌ها و مایعات شست‌وشوی سواب به هم می‌چسبانند. پیامدهای تحلیلی این پدیده نظام‌مند هستند:

• تعداد کلنی‌ها کمتر از مقدار واقعی برآورد می‌شود، زیرا هر توده، صرف‌نظر از تعداد سلول‌های موجود در آن، یک کلنی تولید می‌کند.
• اندازه‌گیری چگالی نوری و دستگاه‌های شمارش ذرات، به‌جای سلول‌ها تجمعات را گزارش می‌کنند و منحنی‌های رشد را دچار سوگیری می‌سازند.
• فلوسایتومتری و جداسازی سلولی، رویدادهای مربوط به توده‌های سلولی را نادرست می‌شمارند و آن‌ها را از تحلیل کنار می‌گذارند.
• استخراج‌های DNA و پروتئین فقط نمایانگر سلول‌های سطح تجمع هستند و داده‌های میکروبیوم و اُمیکس را دچار سوگیری می‌کنند.

راهکارهای متداول کند یا ناقص‌اند، یا تغییرات شیمیایی ایجاد می‌کنند. پیپتاژ و ورتکس‌کردن شدید، ریزتجمعات را باقی می‌گذارند. پراکنده‌سازی آنزیمی یا مبتنی بر عوامل کلاته‌کننده، سطح سلولی را که ممکن است قصد تحلیل آن را داشته باشید تغییر می‌دهد. جداسازی مکانیکی تجمعات با کاویتاسیون کنترل‌شده ظرف چند ثانیه عمل می‌کند و به هیچ افزودنی نیاز ندارد.

فراصوت‌دهی چگونه تجمعات سلولی را بدون لیزکردن سلول‌ها جدا می‌کند

جداسازی تجمعات سلولی با فراصوت از تفاوت در استحکام مکانیکی بهره می‌گیرد. پیوندهای بین‌سلولی نسبتاً ضعیف و یک ماتریس خارج‌سلولی، تجمعات باکتریایی را کنار هم نگه می‌دارند، درحالی‌که پوشش سالم سلول، برش بسیار بیشتری را تحمل می‌کند. با ورود فراصوت کالیبره‌شده به سوسپانسیون، کاویتاسیون آکوستیکی ریزجریان‌ها، پالس‌های فشار و نیروهای برشی ایجاد می‌کند که ابتدا در سطوح مشترک تجمعات عمل می‌کنند. توده‌ها، زنجیره‌ها و قطعات بیوفیلم پیش از رسیدن به سطح انرژی لازم برای پارگی غشاها (لیز)، بر اثر برش از هم جدا می‌شوند (کلوخه‌زدایی).

جداسازی توده‌های سلولی باکتریایی با فراصوت

جداسازی تجمعات یا لیز – نقش پارامترهای فراصوت‌دهی

نتیجهٔ عملی این است که جداسازی تجمعات و لیز با همان دستگاه، اما با پارامترهای متفاوت انجام می‌شوند. با دامنهٔ متوسط، چرخه‌های پالسی کوتاه و دمای کنترل‌شده، سوسپانسیون تک‌سلولی حاوی سلول‌های زنده به دست می‌آورید. افزایش دامنه، زمان مواجهه یا دمای نمونه، فرایند را به‌سوی تخریب کامل سلولی برای دستیابی به اهداف درون‌سلولی سوق می‌دهد. ژنراتورهای Hielscher به شما امکان می‌دهند دامنه، توان، پالس و انرژی ورودی را دقیق تنظیم و روش را ذخیره کنید؛ بنابراین مرحلهٔ جداسازی تجمعات در نمونه‌ها، میان کاربران و در اجراهای مختلف تکرارپذیر است.

فراصوت‌دهی کارآمد بدون تماس

فراصوت‌دهی در حمام نمی‌تواند به این سطح از کنترل برسد. حمام‌ها و مخازن شست‌وشوی فراصوتی فقط انرژی فراصوتی کمی فراهم می‌کنند که به آماده‌سازی ناقص منجر می‌شود، و کاویتاسیون به‌صورت ناهمگن رخ می‌دهد؛ بنابراین هر لوله متناسب با موقعیت خود در حمام تیمار می‌شود. VialTweeter نیروهای فراصوتی شدید و متمرکز را مستقیماً از میان دیوارهٔ ظرف، به‌طور هم‌زمان به حداکثر 10 نمونهٔ دربسته منتقل می‌کند. تیمارهایی که در حمام به مواجههٔ طولانی و متغیر نیاز دارند، با یک الگوی پالسی استاندارد تکمیل می‌شوند.
سونیکاتورهای بدون تماس Hielscher فراصوت شدید و متمرکز را از میان دیواره‌های ویال‌های بسته اعمال می‌کنند. VialTweeter حداکثر 10 ویال را هم‌زمان با شدت یکسان پردازش می‌کند، بدون قرارگرفتن پروب در نمونه، آلودگی متقاطع یا انتشار آئروسل. هرجا ظرفیت پردازش نمونه‌ها ایجاب کند، سونیکاتورهای میکروپلیت UIP400MTP و UIP550MTP همین انتقال کنترل‌شدهٔ انرژی را به پلیت‌های چندچاهکی گسترش می‌دهند.

مزایای جداسازی تجمعات با فراصوت بدون تماس

• بدون هیچ آلودگی متقاطع: ازآنجاکه ویال‌ها همواره بسته می‌مانند و هیچ پروبی در نمونه فرو برده نمی‌شود، از آلودگی متقاطع و اتلاف نمونه کاملاً جلوگیری می‌شود. بین نمونه‌ها چیزی برای استریل‌کردن وجود ندارد و هیچ اجرایی نمی‌تواند بر اجرای بعدی اثر بگذارد.
• محافظت در برابر آئروسل: فراصوت‌دهی با پروب در ظرف باز، آئروسل‌های عفونی تولید می‌کند و سطوح دستگاه را آلوده می‌سازد. فراصوت‌دهی در ویال دربسته، نمونه را درون لولهٔ خودش محصور نگه می‌دارد؛ این موضوع هنگام کار با باکتری‌های بیماری‌زا مانند Mycobacterium tuberculosis و دیگر عوامل BSL-2 یا BSL-3 اهمیت دارد.
• بدون فرسایش نوک پروب: پروب‌های تیتانیومی ممکن است هنگام کار مقدار کمی ریزذره وارد نمونه کنند. این ذرات، چگالی نوری و شمارش ذرات را در مراحل بعدی تغییر می‌دهند. فراصوت‌دهی غیرمستقیم از میان دیوارهٔ ظرف، این منبع ورود ذرات جامد را به‌کلی حذف می‌کند.
• پردازش یکنواخت نمونه‌ها: VialTweeter شدت فراصوت یکسانی را به هر یک از حداکثر 10 ویال می‌رساند؛ بنابراین نتایج فراصوت‌دهی یکنواخت و تکرارپذیرند. اثرات موقعیت که در حمام‌ها و کار با پروب برای تک‌نمونه مشکل‌سازند، از بین می‌روند و مقادیر پایهٔ شما در تکرارها قابل‌مقایسه باقی می‌مانند.
• حفظ یکپارچگی نمونه: لوله‌ها در تمام مدت پردازش بسته می‌مانند؛ بنابراین نمونه نمی‌تواند آلوده، فاسد یا تبخیر شود. حجم‌های کم، از جمله رسوب‌های ارزشمند بالینی که نمی‌توان آن‌ها را در معرض یک مرحلهٔ انتقال اضافی قرار داد، بدون رقیق‌سازی قابل‌پردازش‌اند.
• کنترل فرایند: دامنه از 20 تا 100% و حالت پالسی از 0 تا 100% قابل‌تنظیم است و سامانه‌ها از پایش دما پشتیبانی می‌کنند تا سویه‌ها و پروتئین‌های حساس به گرما در دماهایی پایین‌تر از آستانه‌های آسیب باقی بمانند.

کاربردهای متداول

• تحلیل میکروبیوم و محتویات روده: پراکنده‌سازی Lactobacillus، Bifidobacterium و نمونه‌های مدفوع پیش از کشت روی پلیت یا توالی‌یابی، تا توده‌ها باعث کمترشدن شمارش نشوند.
• میکروب‌شناسی مواد غذایی و آب: جداسازی لخته‌ها در نمونه‌های سواب، مایعات آبکشی و محیط‌های کشت مایع غنی‌سازی، برای تعیین دقیق تعداد کلنی‌ها و زنده‌مانی.
• پژوهش بیوفیلم: بازیابی سلول‌ها از حامل‌ها و سطوح به‌صورت سوسپانسیون‌های تک‌سلولی، بدون تیمار آنزیمی که پروتئین‌های سطحی را جدا می‌کند.
• تشخیص بالینی: معلق‌سازی مجدد خلط، چرک و مایعات شست‌وشوی سواب در شرایط مهار زیستی.
• کشت سلولی: جداسازی تجمعات به‌هم‌چسبیدهٔ سلول‌های پستانداران، حشرات و CHO پیش از شمارش و پاساژ.
• آماده‌سازی در سراسر گردش کار: همان دستگاهی که در دامنهٔ پایین تجمعات را جدا می‌کند، در تنظیمات بالاتر تخریب کامل سلولی را انجام می‌دهد؛ بنابراین لیز، استخراج پروتئین و قطعه‌قطعه‌سازی DNA بدون انتقال نمونه بین لوله‌ها در ادامه انجام می‌شوند.

منابع علمی / مراجع

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.