Ultraheli rakendused apaatia viiruses

Ultraheli töötlus on oluline töötlemismeetod apaatia viiruse (MPXV) isoleerimiseks analüütilistest proovidest, viiruse DNA fragmenteerimiseks ning apaatia vaktsiini tootmisel. Proovide ettevalmistamisel enne diagnostikat ja analüüsi (PCR, ELISA jne) kasutatakse ultraheli töötlust rakkude lüüsimiseks, et vabastada apaatia viirus raku sisemusest ja/või fragmenteerida DNA-d. Vaktsiinide tootmisel ulatuvad rakendused viiruseosakeste / DNA ettevalmistamisest, kapseldamisest ravimi kandjatesse ja inokulaatide formuleerimisest.
Allpool leiate üksikasjalikku teavet ultraheli apaatia viiruse proovide ettevalmistamise ning ultraheliga toetatud MPXV vaktsiini tootmise kohta.

 

Mida leiate sellelt lehelt:

• Ultraheli lüüsimine apaatia viiruse eraldamiseks
• Ultraheli fragmenteerimine apaatia viiruse DNA jaoks
• Ultraheli rakendused MPXV vaktsiini tootmises

Ultraheli lüüsimine ja DNA fragmenteerimine enne polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR)

Apaatia viiruse infektsioon tuvastatakse nukleiinhappe võimendamise testi (NAAT) abil, kasutades reaalajas või tavalist polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) viiruse DNA unikaalsete järjestuste tuvastamiseks. Proov (nt ninaneelu tampoonist või nahabiopsiatest) sisaldab viirust rakkudes.
Analüüsi jaoks tuleb viirus rakkudest vabastada ja viiruse DNA tuleb PCR jaoks fragmenteerida.

Ultraheli lüüsimine:

Ultraheli rakkude lõhkumine / lüüsimine on usaldusväärne ja tõhus meetod viiruste isoleerimiseks rakuproovidest ning seega eelistatud tehnika võrreldes keemiliste agentidega, nagu lüsosüüm, proteinas K ja erinevad detergendid, mida alternatiivselt kasutatakse rakkude lüüsimiseks ja DNA vabastamiseks.
Selliste keemiliste reagentide kasutamine nõuab aga aeganõudvat proovide ettevalmistamist mitmes etapis enne PCR analüüsi, et vältida PCR reaktsiooni inhibeerimist. Kuna PCR inhibiitorid mõjutavad võimendamise efektiivsust, võivad väikesed variatsioonid eemaldamata inhibiitorite koguses viia suurte variatsioonideni PCR produkti võimendamisel (Diaco, 1995).
Ultraheli töötluse eelis lüüsimisel on see, et on soovitav saavutada rakustruktuuride täielik lõhkumine ja DNA vabastamine ilma lüüsivate reagentide ja aeganõudva proovide ettevalmistamiseta. (vrd. Fykse et al., 2003)

Ultraheli DNA fragmenteerimine:

Ultraheli DNA fragmenteerimine on lihtne ja usaldusväärne, kuna see toodab DNA fragmente, mille pikkus on reguleeritav (aluspaarid, bp). Kasutades ultraheli, saab DNA-d tõhusalt fragmenteerida sihtpikkuseni. Täpne kontroll ultraheli parameetrite üle ja arenenud jahutusvõimalused takistavad DNA lagunemist.
Loe lisaks ultraheli DNA fragmenteerimise kohta!

Ultraheli rakendused apaatia viiruse vaktsiinis

Apaatia viiruse vastu kasutatavad vaktsiinid on praegu elusviiruse vaktsiinid. Uusarendatud vaktsiinid võivad kasutada teisi platvorme, nagu DNA-põhised Praegu sisaldab see modifitseeritud Vaccinia Ankara viirust, attenueritud, mitte-replitseeruvat orthopoxviirust. See sisaldab ka Tris (tris-aminometaani) ja naatriumkloriidi. Vaktsiin võib sisaldada ka väikeses koguses DNA-d ja valku kanna embrüo fibroblastirakkudest, mida kasutatakse vaktsiiniviiruse kasvatamiseks, benzonaasi ja antibiootikume, nagu gentamütsiin ja tsiprofloksatsiin.

Ultraheli homogeniseerimist kasutatakse elus-attenueritud viiruse vaktsiinide, DNA vaktsiinide, mitmevalentsete DNA kokteilide, mRNA vaktsiinide, rekombinantsete valgu vaktsiinide, viiruselaadsete osakeste vaktsiinide jne tootmises.

Leiate rohkem põhjalikku teavet ultraheli rakenduste kohta vaktsiinide tootmise parandamiseks!

Protokoll apaatia viiruse ultraheli isoleerimiseks

Stittelaari (2005) teadusrühm kasutas ultraheli lüüsimist, et vabastada apaatia viirus kasvataja rakukultuurist ning rakkudest, mis saadi kurgu tampoonidega nakatunud primaatidelt.

Apaatia vaktsiini ettevalmistamine:

Apaatia viirusi kasvatati spetsiifiliste patogeenide vabadel kanna embrüo fibroblastirakkudel. Pärast 1 kuni 2 päeva kestnud inkubeerimist koguti viiruse-raku suspensioon ühe külmutamise-sulitamise tsükli abil ja kontsentreeriti seejärel tsentrifuugimise teel. Setet suspendeeriti uuesti ja töödeldi mitme ultraheli homogeniseerimise tsükliga.

Apaatia viiruse isoleerimine vaktsineeritud makakkidest:

Proovid külmutati ja sulatati kolm korda ning sonikeeriti ultraheli CupHorn seadmes. Kaks lahjendust (1:10 ja 1:100) transpordisöötmes, millele oli lisatud 1% looteveiseerumit, kasutati Vero rakkude monokihtide inokuleerimiseks kuue kaevikuga plaatidel. Pärast 1 h inkubeerimist temperatuuril 37°C eemaldati inokulaadid ja asendati need kultuurisöötmega, millele oli lisatud 1% looteveiseerumit. Monokihte kasvatati 5 päeva temperatuuril 37°C ja värviti kristallvioletsuse lahusega.
(vrd. Stittelaar et al., 2005)

Ultrasonikaatorid viiruste analüüsiks ja vaktsiinide tootmiseks

Hielscher Ultrasonics’i lai tooteportfell pakub ideaalset ultrasonikaatorit teadus- ja analüüsilaboritele ning tööstuslikuks vaktsiinide tootmiseks.
Hielscher Ultrasonics on spetsialiseerunud kõrgjõudlusega ultrasonikaatorite ja sono-bioreaktorite disainile, tootmisele ja levitamisele kasutamiseks teadus- ja analüüsilaborites ning rakendamiseks tööstuslikus vaktsiinide tootmises (nt vaktsiinid, API-d).
Ultraheli töötlust saab rakendada avatud anumates, suletud pidevalt segatud reaktorites ja pideva läbivooluga reaktorites. Kõik ultrahelisüsteemide osad, mis puutuvad kokku vedela keskkonnaga, on valmistatud roostevabast terasest, titaanist või klaasist. Autoklaavitavad osad ja hügieenilised liitmikud tagavad tootmise farmatseutilise kvaliteediga tingimustes.
Automaatne andmesalvestus: Intelligentne tarkvara salvestab ultraheli töötluse protsessi parameetrid automaatselt integreeritud SD mälukaardile. Kõigi protsessiparameetrite täpne kontroll tagab reprodutseeritavuse, tootmise standardiseerimise, ning hõlbustab farmatseutiliste toodete ohutusstandardite täitmist.
Hielscher Ultrasonics’i ultraheli protsessorid on väga usaldusväärsed ja neid saab täpselt juhtida. Kõiki tööstuslikke ultrasonikaatoreid saab reguleerida, et edastada kogu vahemikku madalatest väga kõrgeni amplituudideni. Hielscheri ultrahelisüsteemide vastupidavus võimaldab 24/7 tööd raske koormuse ja nõudlikes tingimustes.

Allpool olev tabel annab ülevaate meie ultrasonikaatorite ligikaudsest töötlemisvõimsusest: