Desagregación celular por ultrasonidos de muestras bacterianas
Las muestras bacterianas rara vez llegan en forma de verdaderas suspensiones unicelulares. Los cultivos crecen en cadenas y flóculos, los aislados ambientales forman agregados unidos por sustancias poliméricas extracelulares, y los sedimentos centrifugados suelen resistirse a la resuspensión a pesar de una agitación exhaustiva en el vórtex. Los recuentos de células viables, la densidad óptica, la citometría de flujo y el perfilado del microbioma parten todos del supuesto de que una partícula equivale a una célula. La desagregación celular por ultrasonidos resuelve ese conflicto: breves ráfagas controladas de sonicación separan los agregados en células individuales sin lisarlas.
Por qué la agregación celular afecta a tus resultados
La agregación es una característica biológica, no un error de preparación. Los estafilococos, estreptococos, lactobacilos, actinomicetos y muchas especies ambientales crecen en cadenas, agrupaciones o fragmentos de biopelícula, y el ADN extracelular y los polisacáridos unen las células entre sí en los sedimentos y los eluidos de los hisopos. Las consecuencias analíticas son sistemáticas:
- El recuento de colonias se subestima, ya que cada grupo produce una colonia, independientemente del número de células que contenga.
- La densidad óptica y los contadores de partículas registran agregados en lugar de células, lo que sesga las curvas de crecimiento.
- La citometría de flujo y la clasificación celular contabilizan erróneamente los eventos agrupados y los excluyen del análisis.
- Las extracciones de ADN y proteínas solo recogen las células presentes en la superficie del agregado, lo que sesga los datos sobre el microbioma y los datos ómicos.
Los métodos convencionales son lentos, incompletos o alteran químicamente el material. El pipeteo enérgico y la agitación en vórtex dejan microagregados. La dispersión enzimática o basada en quelantes modifica la superficie celular que se desea analizar. La desagregación mecánica mediante cavitación controlada actúa en cuestión de segundos y no requiere aditivos.
Un agregado equivale a una colonia – y un resultado erróneo. Descubre cómo la desagregación por ultrasonidos produce auténticas suspensiones unicelulares sin lisis, sin aerosoles y sin necesidad de manipular sondas. ¡Solicita más información!
Multi-Tube Sonicator VialTweeter Para la preparación de muestras sin contacto: Desagregue los cúmulos celulares en tubos sellados
Cómo la sonicación desagrega las células sin lisarlas
La desagregación celular por ultrasonidos aprovecha una diferencia en la resistencia mecánica. Los agregados bacterianos se mantienen unidos mediante enlaces intercelulares relativamente débiles y una matriz extracelular, mientras que la envoltura celular intacta resiste un esfuerzo de cizallamiento sustancialmente mayor. A medida que el ultrasonido calibrado penetra en la suspensión, la cavitación acústica genera microcorrientes, pulsos de presión y fuerzas de cizallamiento que actúan en primer lugar en las interfaces de los agregados. Los grumos, las cadenas y los fragmentos de biopelícula se separan por cizallamiento (desaglomeración) antes de que se alcance el nivel de energía en el que se rompen las membranas (lisis).
Desagregación ultrasónica de aglomerados de células bacterianas
Desagregación o lisis – La importancia de los parámetros de sonicación
La consecuencia práctica es que la desagregación y la lisis son el mismo instrumento operado con parámetros diferentes. Con una amplitud moderada, ciclos de pulsos cortos y una temperatura controlada, se obtiene una suspensión viable de células individuales. Al aumentar la amplitud, el tiempo de exposición o la temperatura de la muestra, el proceso se orienta hacia la ruptura celular completa para alcanzar objetivos intracelulares. Los generadores de Hielscher permiten ajustar con precisión la amplitud, la potencia, el pulso y la energía aplicada, así como guardar el método, de modo que la etapa de desagregación es reproducible en todas las muestras, con cualquier operador y en todas las series de ensayos.
Sonicación sin contacto eficiente
La sonicación en baño no puede igualar este nivel de control. Los baños y depósitos de limpieza por ultrasonidos solo proporcionan una energía ultrasónica baja, lo que da lugar a una preparación incompleta, y la cavitación se produce de forma desigual, por lo que cada tubo se trata en función de su posición en el baño. El VialTweeter transmite fuerzas ultrasónicas intensas y focalizadas directamente a través de la pared del recipiente hacia hasta 10 muestras selladas al mismo tiempo. Los tratamientos que requieren una exposición prolongada y variable en un baño se completan siguiendo un patrón de pulsos estandarizado.
Los sonicadores sin contacto de Hielscher aplican ultrasonidos intensos y focalizados a través de las paredes de los viales cerrados. El VialTweeter procesa hasta 10 viales simultáneamente con la misma intensidad, sin sonda en la muestra, sin contaminación cruzada y sin emisión de aerosoles. Cuando el rendimiento lo exige, los sonicadores para microplacas UIP400MTP y UIP550MTP amplían esta misma transferencia controlada de energía a las placas multipocillo.
El VialTweeter sonica simultáneamente hasta 10 viales más pequeños y hasta 5 tubos de ensayo más grandes.
Ventajas de la desagregación ultrasónica sin contacto
- Cero contaminación cruzada: Dado que los viales permanecen cerrados en todo momento y no se sumerge ninguna sonda en la muestra, se evitan por completo la contaminación cruzada y la pérdida de muestra. No hay que esterilizar nada entre una muestra y otra, y una serie de análisis no puede afectar a la siguiente.
- Protección contra los aerosoles: La sonicación con sonda abierta genera aerosoles infecciosos y contamina las superficies de los instrumentos. La sonicación en viales sellados mantiene la muestra dentro de su propio tubo, lo cual es importante a la hora de manipular bacterias patógenas como el Mycobacterium tuberculosis y otros agentes de nivel de seguridad biológico 2 (BSL-2) o 3 (BSL-3).
- Sin pérdida de propina: Las sondas de titanio pueden desprender una pequeña cantidad de micropartículas en la muestra durante su funcionamiento. Esas partículas alteran la densidad óptica y el recuento de partículas en las etapas posteriores del proceso. La sonicación indirecta a través de la pared del recipiente elimina por completo esta fuente de sólidos.
- Rendimiento uniforme: El VialTweeter aplica la misma intensidad de ultrasonidos a cada uno de los hasta 10 viales, por lo que los resultados de la sonicación son uniformes y reproducibles. Desaparecen los efectos de la posición que afectan a los baños de ultrasonidos y a la sonda de una sola muestra, y las líneas de base se mantienen comparables entre las distintas réplicas.
- Integridad de la muestra: Los tubos permanecen cerrados durante todo el proceso, por lo que la muestra no puede contaminarse, deteriorarse ni volatilizarse. Los volúmenes pequeños se pueden analizar sin dilución, incluidas las valiosas muestras clínicas sedimentadas que no admiten un paso adicional de transferencia.
- Control de procesos: La amplitud se puede ajustar entre el 20 % y el 100 %, el modo de pulso entre el 0 % y el 100 %, y los sistemas permiten supervisar la temperatura para que las cepas y proteínas termosensibles se mantengan por debajo de los umbrales que podrían causar daños.
Aplicaciones típicas
- Análisis del microbioma y del contenido intestinal: dispersar las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, así como las muestras fecales, antes de su siembra o secuenciación, para que los recuentos no se vean reducidos por la formación de grumos.
- Microbiología de los alimentos y el agua: desagregación de flóculos en hisopos, enjuagues y caldos de enriquecimiento para una determinación precisa del número de colonias y la viabilidad.
- Investigación sobre biopelículas: recuperación de células de soportes y superficies en forma de suspensiones de células individuales, sin tratamiento enzimático que elimine las proteínas de la superficie.
- Diagnóstico clínico: resuspensión de esputo, pus y eluidos de hisopos en condiciones de contención.
- Cultivo celular: separación de los agregados de células de mamíferos, insectos y CHO antes del recuento y el pasaje.
- Preparación de todo el flujo de trabajo: el mismo instrumento que desagrega a baja amplitud realiza la disrupción celular completa a ajustes más altos, por lo que la lisis, la extracción de proteínas y la fragmentación del ADN se llevan a cabo sin necesidad de trasvasar los tubos.
Sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP para la desaglomeración a gran escala de aglomerados celulares
Los modelos de sonicadores para microplacas UIP400MTP y UIP550MTP no solo sirven para placas de múltiples pocillos, sino que también procesan portatubos.
Encuentra el sonicador adecuado para tu flujo de trabajo de desagregación
Sonómetro multitubo VialTweeter
El método de elección para la desagregación de viales estériles y sellados. Accionado por el procesador UP200St de 200 vatios a 26 kHz con sintonización automática, el VialTweeter transmite ultrasonidos de forma indirecta a través de las paredes de hasta 10 viales cerrados al mismo tiempo, con una potencia de hasta 10 W por vial, lo que garantiza resultados uniformes y reproducibles sin contaminación cruzada ni pérdida de muestra. El sonotrodo de titanio del VialTweeter es autoclavable, y la amplitud y el pulso son ajustables y se pueden guardar, lo que constituye el rango de control que requiere un protocolo de desaglomeración. El sonotrodo estándar de 10 posiciones admite viales para muestreadores automáticos, tubos de microcentrífuga y tubos Eppendorf o Nunc de 1 a 5 ml. El dispositivo de sujeción VialPress admite hasta 5 recipientes más grandes de hasta 20 mm de diámetro.
Hay disponibles modelos VialTweeter específicos de un solo tubo para los tubos Falcon y para viales individuales adaptados al tamaño del recipiente. Al desmontar el sonotrodo en bloque, la unidad central UP200St funciona como un sonicador de sonda convencional para el tratamiento directo de muestras de tamaño pequeño a mediano.
Sonicadores para microplacas
Amplía tu capacidad de preparación de muestras de alto rendimiento con la sonicación de placas multipocillo: para los flujos de trabajo basados en placas, los sonicadores de microplacas UIP400MTP y UIP550MTP amplían la sonicación uniforme y sin contacto de diez tubos a una placa completa.
El UIP400MTP, de 400 vatios, trata placas de microtitulación y multipocillo estándar, incluidos los formatos de 96 pocillos, con un control preciso de la amplitud, la potencia y los pulsos, además de un temporizador, una sonda de temperatura y un sistema de refrigeración por baño de agua. La eliminación de biopelículas y el procesamiento de cultivos bacterianos son aplicaciones consolidadas del sonicador de microplacas UIP400MTP.
El UIP550MTP, de 550 vatios, es la opción más potente – ideal para aplicaciones más exigentes.
Ambos sistemas de sonicación sin contacto procesan de forma fiable placas de 6, 12, 24, 48, 96 y 384 pocillos, así como portatubos y placas de Petri. Los sonicadores de microplacas de Hielscher funcionan con cualquier placa estándar, lo que evita el uso de costosos consumibles patentados. Gracias a los límites de temperatura programables, la sonicación se detiene automáticamente cuando se alcanza la temperatura máxima de la muestra y se reanuda tras el enfriamiento, lo que protege la viabilidad en ciclos repetidos. Preparación de muestras inteligente y fiable de alto rendimiento para obtener resultados repetibles.
La siguiente tabla ofrece una visión general de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros sonicadores de laboratorio utilizados en ciencias de la vida, genómica, proteómica y diagnóstico:
| Dispositivos recomendados | Volumen del lote | Tasa de flujo |
|---|---|---|
| Sonómetro multitubo VialTweeter | 0viales de 0,5 a 1,5 ml | n.a. |
| Sonicador para placas multipocillo UIP400MTP (440 vatios) | placas multipocillo / microtituladoras | n.a. |
| Sonicador para placas multipocillo UIP550MTP (550 vatios) | placas multipocillo / microtituladoras | n.a. |
| CupHorn ultrasónico | CupHorn para viales o vaso de precipitados | n.a. |
| UP100H: sonicador de tipo sonda de 100 vatios | 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. |
| UP200Ht, UP200St Modelos de sonicadores de tipo sonda de 200 vatios | De 10 a 1000 ml | 20 a 200mL/min |
| UP400St: sonicador de sonda de 400 vatios | 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. |
| GDmini2 | reactor ultrasónico de microflujo estéril | n.a. |
| Tamizadora ultrasónica | n.a. | n.a. |
Preguntas frecuentes sobre la desagregación celular por ultrasonidos
¿Cuál es la diferencia entre la desagregación celular y la lisis celular?
La desagregación, también denominada desaglomeración, separa las células agrupadas en una suspensión unicelular, manteniendo las células intactas y viables. La lisis rompe la membrana celular y libera el contenido intracelular. Ambos procesos se producen por el esfuerzo cortante de la cavitación, y la diferencia radica en la energía aportada. Con ajustes optimizados de amplitud, pulso y temperatura, la sonicación logra la desagregación por debajo del umbral de lisis.
¿Por qué los baños de ultrasonidos no son adecuados para la desagregación estandarizada?
Los baños solo proporcionan una energía ultrasónica baja, lo que da lugar a una preparación incompleta, y la cavitación se desarrolla de forma muy desigual en todo el depósito, por lo que cada muestra recibe un tratamiento diferente en función de su posición. Los recuentos microbiológicos y los estudios comparativos dependen de la comparabilidad. Los sonicadores sin contacto, como el sonicador multitubo VialTweeter, así como los modelos de sonicadores para microplacas UIP400MTP y UIP550MTP, procesan todos los recipientes en condiciones ultrasónicas ajustadas, lo que mejora la reproducibilidad entre las réplicas.
¿Puede la sonicación dañar las células?
Sí, si no se controlan los parámetros. Una sonicación excesiva o un calentamiento descontrolado pueden dañar las células, y el ADN liberado hace que las muestras se vuelvan viscosas y favorece la reagragación. Por eso el proceso debe desarrollarse de forma deliberada: una amplitud moderada, ciclos pulsados, enfriamiento e instrumentos con temperatura limitada mantienen el tratamiento en el lado de la desagregación de la curva.
Todos los sonicadores digitales de Hielscher ofrecen parámetros controlables con precisión, sensores de temperatura enchufables, ajustes programables y registro automático de datos para garantizar una preparación fiable de las muestras.
¿Es necesario trasladar la muestra a otro recipiente?
No. Los viales y las placas se procesan en sus envases originales cerrados. La sonicación indirecta evita tanto las pérdidas por transferencia como el arrastre asociado a la manipulación de la sonda.
¿Qué formatos de viales puede procesar el VialTweeter?
El sonotrodo estándar de 10 posiciones admite viales para muestreadores automáticos, tubos de microcentrífuga y tubos Eppendorf o Nunc de 1 a 5 ml. El accesorio VialPress admite hasta 5 recipientes más grandes de hasta 20 mm de diámetro. Existen modelos específicos de VialTweeter de un solo tubo para tubos Falcon y para formatos personalizados de un solo vial o de mayor tamaño.
¿Puedo realizar la desagregación y la lisis con un solo instrumento?
Sí. El mismo sistema que desagrega a una amplitud moderada lleva a cabo la disrupción celular completa a una amplitud mayor y con una exposición más prolongada, por lo que la suspensión de células individuales y la extracción posterior pueden realizarse de forma consecutiva sin cambiar de plataforma.
¿Se utiliza la sonicación en los ensayos MBEC?
La sonicación es un componente consolidado y, en gran medida, estándar. En el ensayo MBEC con tapones de poliestireno, una vez que las biopelículas se han cultivado en tapones de poliestireno y se han expuesto al antibiótico, los tapones se transfieren a un medio fresco y se someten a agitación en vórtex y sonicación para desprender y desagregar las células adheridas de la biopelícula y convertirlas en una suspensión planctónica antes de la dilución en serie y el recuento de células viables (el MBEC se define como la concentración más baja que reduce los recuentos recuperados en ≥3 log10 en comparación con la biopelícula no tratada). La sonicación mejora significativamente la calidad de la dispersión: la liberación incompleta de las células incrustadas en la matriz de EPS subestima la erradicación e infla los valores de MBEC. La sonicación selectiva de los pocillos con soportes de varillas en las placas de ensayo mediante el sonicador de microplacas UIP400MTP supera las deficiencias tradicionales de la sonicación en baño – a saber, la distribución desigual de la energía, el calentamiento y el riesgo de contaminación por aerosoles o contaminación cruzada.
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¿Se utiliza la sonicación en los ensayos de CMI?
La sonicación se aplica en diferentes procesos relacionados con la CMI para mejorar la eficiencia y la reproducibilidad:
- la micobacteriología, en la que el esputo y otras muestras viscosas se descontaminan y homogeneizan de forma rutinaria —a veces mediante sonicación— antes de realizar las pruebas de sensibilidad, y en la que los inóculos de micobacterias que forman aglomerados se benefician de una breve dispersión para obtener concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) precisas;
- organismos propensos a formar agregados (por ejemplo, estreptococos y estafilococos en gránulos), en los que los microagregados distorsionan la densidad del inóculo; y
- diagnósticos combinados, como la sonificación de implantes y el cultivo de fluidos, seguidos de pruebas de sensibilidad en casos de infección de prótesis articulares (una aplicación similar a la del método MBEC, no la clásica del CMI).
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Literatura / Referencias
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
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