Protocolo de cultivo y desprendimiento de biopelículas de estafilococos

Los métodos estandarizados son esenciales para obtener resultados fiables en la investigación. Aquí encontrará un protocolo de cultivo y desprendimiento de biopelículas estafilocócicas. Este protocolo se centra en la preparación racionalizada de muestras de alto rendimiento utilizando el sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP para el desprendimiento eficaz y de alto rendimiento de biopelículas en placas de 96 pocillos. El protocolo también contiene los pasos clave para el cultivo de biopelículas, lavado y visualización, con un enfoque en la minimización de la variabilidad y garantizar la reproducibilidad.

Biopelícula de estafilococos e investigación sobre antibióticos

Las biopelículas de estafilococos desempeñan un papel fundamental en las infecciones persistentes debido a su resistencia a los antibióticos y a las respuestas inmunitarias. La formación de biopelículas proporciona un entorno protector a las bacterias, lo que dificulta el tratamiento de las infecciones. La investigación sobre biopelículas suele centrarse en comprender su formación, comportamiento y susceptibilidad a los antimicrobianos, haciendo hincapié en métodos de alto rendimiento para agilizar los flujos de trabajo experimentales.
El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP ofrece una ventaja significativa en la investigación de biopelículas al permitir el desprendimiento rápido y eficaz de biopelículas de placas de 96 pocillos. Este dispositivo proporciona energía ultrasónica uniforme a todos los pocillos, garantizando resultados consistentes y minimizando la variabilidad.

Protocolo para el cultivo y desprendimiento de biopelículas de estafilococos

A continuación, le guiamos paso a paso en el proceso de cultivo y desprendimiento de una biopelícula de estafilococos. Como paso analítico ejemplar, le mostramos cómo cuantificar espectrofotométricamente la biomasa cultivada mediante tinción con violeta cristal.

Cultivo de la biopelícula de Staphylococcus

Material necesario:

• Placas microtiter estériles de 96 pocillos de fondo plano de poliestireno para cultivo de tejidos con tapa
• Caldo de soja Tryptic (TSB) con 0,25% de glucosa
• Cabina de seguridad biológica

Pasos:

1. Prepare un entorno de trabajo estéril en una cabina de seguridad biológica para minimizar la contaminación.
2. Añada TSB con 0,25% de glucosa a los pocillos de la placa de microtitulación. La TSB sin glucosa no suele favorecer la formación de biopelículas y sólo debe utilizarse como control si es necesario.
3. Inocular los pocillos con cepas bacterianas preparadas como se describe a continuación:
4. Preparar suspensiones bacterianas, asegurándose de que no haya agrupaciones celulares preexistentes, homogeneizando las suspensiones mediante sonicación o rompiendo las agrupaciones con una aguja de calibre 23 y agitando brevemente en vórtex.
5. Sellar la placa con su tapa e incubar en condiciones óptimas para la formación de la biopelícula (por ejemplo, 37°C durante 24 horas).
6. Realice el experimento por triplicado para cada cepa bacteriana (tres pocillos por cepa) para garantizar la fiabilidad.
7. Asigne seis pocillos por placa para los controles negativos. Pueden analizarse hasta 30 cepas por placa de 96 pocillos.

Visualización y lavado de biopelículas

1. Tras la incubación, deseche el medio con cuidado para no alterar la biopelícula.
2. Lavar cada pocillo cuatro veces con solución salina fisiológica para eliminar las bacterias planctónicas.
3. Inspeccione el fondo de los pocillos en busca de manchas blancas que indiquen la presencia de biopelícula.

Desprendimiento de biopelículas con el Sonicator para placas de pocillos múltiples UIP400MTP

Configuración y parámetros del dispositivo:

• UIP400MTP Sonicator para placas de pocillos múltiples
• Ajustes de funcionamiento: 60% de amplitud, modo ciclo con 60 segundos ON / 30 segundos OFF

Pasos:

1. Coloque la placa de microtitulación lavada en la plataforma UIP400MTP.
2. Sonicar las muestras con los ajustes recomendados (60% de amplitud, 60 segundos ON, 30 segundos OFF). Ajuste la configuración a la cepa bacteriana.
3. Inicie el proceso de sonicación para desprender la biopelícula. Las ondas ultrasónicas alteran la matriz del biofilm, liberando las bacterias adheridas.
4. El UIP400MTP garantiza una exposición uniforme en todos los pocillos para obtener resultados de desprendimiento consistentes.

Paso analítico: Cuantificación de la biomasa de biopelículas de estafilococos desprendidas mediante violeta de cristal (CV)

Material necesario:

• 0.1% de solución de violeta cristal (CV)
• 95% de etanol o 30% de ácido acético (para solubilización)
• Lector de microplacas capaz de leer a 570 nm
• Placas de microtitulación estériles para tinción

Pasos:

1. Preparación de la placa de tinción: Transfiera 100 µl de la suspensión de biopelícula desprendida de cada pocillo de la placa sonicada a los pocillos correspondientes de una placa de microtitulación de 96 pocillos estéril y limpia. Esto garantiza un entorno claro y uniforme para la tinción.
2. Tinción de la biopelícula desprendida: Añadir 150 µl de solución de violeta cristal al 0,1% a cada pocillo que contenga la suspensión de biopelícula desprendida. Pipetear suavemente para asegurar una mezcla homogénea de la suspensión de biopelícula y el violeta cristal.
3. Incubación: Dejar incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos para que el violeta cristal tiña eficazmente la biomasa.
4. Lavado: Tras la incubación, desechar cuidadosamente la solución de violeta cristal de los pocillos sin alterar la biomasa. Lavar cada pocillo tres veces con solución salina fisiológica estéril para eliminar el tinte no unido.
5. Secado: Deje secar la placa al aire a temperatura ambiente o bajo una campana de flujo de aire estéril. Evite el calentamiento, ya que puede alterar los resultados.
6. Solubilización: Añada 200 µl de etanol al 95% (o ácido acético al 30%, según las prácticas habituales de laboratorio) a cada pocillo para solubilizar el cristal violeta unido. Mezclar suavemente pipeteando o agitando la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Medición: Medir la densidad óptica (DO) de la solución de violeta cristal solubilizada a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
8. Análisis de datos: Restar el valor OD570 medio de los controles negativos (pocillos con TSB pero sin inóculo bacteriano) de los pocillos experimentales para tener en cuenta la tinción de fondo. Registrar y analizar los datos.

Nota: Realice el experimento por triplicado para cada condición a fin de garantizar la reproducibilidad. Asegúrese de manipular correctamente el violeta cristal y el etanol, respetando los protocolos de seguridad y eliminación.
 

Las principales ventajas del UIP400MTP de un vistazo:

• Procesamiento de alto rendimiento: Diseñado específicamente para placas de pocillos múltiples, lo que le permite procesar varias muestras simultáneamente.
• Distribución ultrasónica uniforme: Garantiza la misma intensidad ultrasónica en todos los pocillos, proporcionando resultados uniformes en todas las muestras.
• Utilice cualquier placa estándar: El UIP400MTP puede manejar cualquier placa multipocillo estándar, placas Petri y gradillas de tubos. No se necesitan costosas placas patentadas.
• Interfaz fácil de usar: Fácil de configurar y controlar, lo que la convierte en una herramienta excelente para aumentar la productividad del laboratorio. Los ajustes programables y la automatización facilitan la estandarización de los procesos.