Protocolo ASTM E2799-22 para la evaluación de la eficacia antimicrobiana

El Hielscher UIP400MTP es un sonicador de placas multipocillo potente y eficiente, diseñado para agilizar la etapa de sonicación del protocolo ASTM E2799-22. Al suministrar energía ultrasónica uniforme a toda la placa de microtitulación, el UIP400MTP garantiza un desprendimiento uniforme y fiable de las biopelículas de las tapas con clavijas, sin dañar las células ni comprometer la integridad de las muestras. Su elevada capacidad de procesamiento y su facilidad de uso reducen significativamente el tiempo de procesamiento y mejoran la reproducibilidad, lo que lo convierte en una solución ideal para los laboratorios que realizan ensayos de viabilidad de biopelículas y pruebas de eficacia antimicrobiana.

ASTM E2799

ASTM E2799 es un método de ensayo normalizado diseñado para evaluar la eficacia de los agentes antimicrobianos frente a las biopelículas, específicamente las de Pseudomonas aeruginosa. Las biopelículas son comunidades microbianas complejas que se adhieren a las superficies y presentan una mayor resistencia a los tratamientos antimicrobianos, lo que supone un reto considerable en los ámbitos sanitario, industrial y medioambiental. Este método utiliza el ensayo de concentración mínima de erradicación de biopelículas (MBEC) para proporcionar un marco fiable y reproducible para evaluar desinfectantes en condiciones realistas de biopelícula.

¿Cómo contribuye la sonicación al método ASTM E2799?

La sonicación desempeña un papel fundamental en el protocolo ASTM E2799 al facilitar el desprendimiento de las biopelículas de las superficies de ensayo, lo que garantiza una evaluación precisa de la viabilidad microbiana tras el tratamiento. Mediante el uso de energía ultrasónica controlada, el protocolo consigue una disgregación eficiente y uniforme de las biopelículas sin dañar las células, lo que permite obtener resultados precisos y reproducibles. Esto convierte a ASTM E2799 en una herramienta esencial para avanzar en la investigación de biopelículas y desarrollar estrategias antimicrobianas eficaces.

Cómo realizar el ensayo MBEC conforme a ASTM E2799-22

El protocolo ASTM E2799-22 describe los pasos para evaluar la eficacia de los agentes antimicrobianos frente a las biopelículas. Al utilizar el sonicador de placas de microtitulación Hielscher UIP400MTP, el protocolo puede adaptarse para incorporar este avanzado método de sonicación para el desprendimiento de biopelículas. A continuación se describen los pasos adaptados al uso del sonicador de microplacas UIP400MTP:

1. Preparación de las biopelículas
   Prepare una placa de microtitulación estéril de 96 pocillos con tapas desmontables con clavijas.
   Inocule los pocillos con una suspensión bacteriana estandarizada en un medio de cultivo adecuado.
   Coloque la tapa con clavijas sobre la placa, asegurándose de que las clavijas queden completamente sumergidas en la suspensión bacteriana.
   Incube la placa en condiciones controladas (p. ej., temperatura y tiempo) para permitir la formación de biopelículas sobre las clavijas.
2. Tratamiento con agentes antimicrobianos
   Tras la formación de las biopelículas, sustituya el medio por medio fresco que contenga los agentes antimicrobianos de ensayo a diferentes concentraciones.
   Vuelva a colocar la tapa con clavijas e incube en las condiciones especificadas en el diseño del ensayo.
3. Preparación para el desprendimiento de las biopelículas
   Tras el tratamiento, enjuague la tapa con clavijas sumergiéndola en una solución de enjuague estéril para eliminar los agentes antimicrobianos residuales y las células planctónicas débilmente adheridas.
4. Desprendimiento de las biopelículas con el sonicador UIP400MTP
   Prepare una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga un medio de recuperación (p. ej., caldo neutralizante).
   Desprenda las biopelículas colocando la tapa con clavijas en los pocillos de la placa que contiene el medio de recuperación.
   Introduzca la placa en el sonicador UIP400MTP, asegurándose de que la tapa y la placa estén correctamente alineadas.
   Ajuste el sonicador a una amplitud del 70%-80% y aplique sonicación durante 3-4 minutos en modo cíclico para garantizar un desprendimiento uniforme de las biopelículas sin lisis celular.
5. Evaluación de la viabilidad de las biopelículas
   Tras la sonicación, procese el medio de recuperación que contiene las células desprendidas de las biopelículas mediante técnicas microbiológicas o analíticas estándar, como:
   • Recuento de unidades formadoras de colonias (CFU): realice diluciones seriadas y siembre en agar para cuantificar las células viables.
   • Mediciones de densidad óptica (OD): utilice un análisis espectrofotométrico para evaluar la densidad celular.
   • Ensayos de viabilidad basados en fluorescencia: cuantifique las células vivas y muertas mediante colorantes fluorescentes.
6. Análisis de datos
   Compare los datos de viabilidad de las biopelículas tratadas y no tratadas para determinar la eficacia de los agentes antimicrobianos.
   Calcule la concentración mínima de erradicación de biopelículas (MBEC) a partir de la concentración necesaria para eliminar las células viables de las biopelículas.
7. Control de calidad
   Garantice unas condiciones de sonicación uniformes mediante la calibración periódica del UIP400MTP y la verificación de que el proceso de desprendimiento de las biopelículas no provoque una lisis o destrucción celular significativa.
   Incluya controles adecuados, como biopelículas no tratadas y blancos que contengan únicamente medio, para validar los resultados.

Las células de las biopelículas formadas sobre las clavijas se desprendieron mediante sonicación (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Alemania, UIP250MTP) durante 5 min en placas de 96 pocillos que contenían medio de cultivo fresco para la recuperación de las células.
(Imagen y estudio: ©de Oliveira et al., 2016)

La integración del UIP400MTP en el flujo de trabajo de ASTM E2799-22 optimiza el proceso de desprendimiento de las biopelículas en términos de uniformidad, eficiencia y aplicaciones de alto rendimiento.