Protocolo del ensayo MBEC con el sonicador para placas de 96 pocillos UIP400MTP

El ensayo MBEC se utiliza para determinar la concentración de agentes antimicrobianos necesaria para eliminar las biopelículas formadas en tapas con clavijas. Para evaluar la viabilidad de las biopelículas, primero deben desprenderse de las tapas con clavijas de una placa de 96 pocillos. La sonicación es el método más fiable y eficaz para lograr este desprendimiento. El sonicador para placas multipocillo UIP400MTP está diseñado específicamente para procesar placas de ensayo con la máxima eficiencia y comodidad, agilizando y acelerando los ensayos MBEC de alto rendimiento.

Sonicación para el desprendimiento de biopelículas

La sonicación es un paso crucial en los ensayos de concentración mínima de erradicación de biopelículas (MBEC), ya que permite desprender eficazmente las células de la biopelícula de la superficie a la que están adheridas. Las biopelículas son comunidades intrínsecamente estructuradas de microorganismos envueltos en una matriz extracelular, lo que las hace considerablemente más resistentes a los agentes antimicrobianos que las células planctónicas. Durante los ensayos MBEC, la sonicación utiliza ondas ultrasónicas para generar cavitación controlada, desestructurando la matriz de la biopelícula y liberando las células contenidas en ella para formar una suspensión. Este paso garantiza que las células de la biopelícula se dispersen uniformemente en el medio de recuperación, lo que facilita una evaluación precisa de la viabilidad mediante siembra en placa, dilución o métodos espectrofotométricos. Sin un desprendimiento adecuado de la biopelícula, los componentes residuales de la matriz podrían proteger las células y dar lugar a una subestimación de la eficacia antimicrobiana. Por tanto, la sonicación es indispensable para obtener valores de MBEC fiables y reproducibles que reflejen el verdadero potencial de erradicación de los agentes evaluados. El sonicador para placas multipocillo UIP400MTP permite preparar fácilmente muestras en placas de ensayo con un alto rendimiento.

Protocolo del ensayo de concentración mínima de erradicación de biopelículas (MBEC)

Paso 1: Formación de biopelículas

1. Prepare la suspensión bacteriana:
   Cultive las bacterias en medios adecuados hasta la fase de crecimiento logarítmico.
   Diluya el cultivo bacteriano hasta una densidad óptica definida (p. ej., OD600 ~0,1).
2. Inocule la placa de 96 pocillos:
   Añada la suspensión bacteriana (p. ej., 150–200 µL) a cada pocillo de una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos.
3. Coloque la tapa con clavijas:
   Coloque la tapa con clavijas sobre la placa inoculada para permitir la formación de biopelículas en las superficies de las clavijas.
4. Incube la placa:
   Incube el conjunto a una temperatura adecuada (p. ej., 37 °C) durante 24–48 horas sin agitación para favorecer el crecimiento de las biopelículas.

Paso 2: Tratamiento con agentes antimicrobianos

• Prepare las soluciones antimicrobianas:
  Prepare una serie de concentraciones de antimicrobianos en medios frescos.
  Exponga las biopelículas a los agentes antimicrobianos:
  Retire la tapa con clavijas del cultivo bacteriano y enjuáguela con solución salina estéril o PBS para eliminar las células planctónicas.
  Coloque la tapa con clavijas en una nueva placa de 96 pocillos que contenga las soluciones antimicrobianas.
• Incube la placa:
  Incube durante un periodo definido (p. ej., 24 horas) para permitir la exposición a los antimicrobianos.

Paso 3: Sonicación con el sonicador para placas de 96 pocillos UIP400MTP

La etapa de sonicación es crucial para desprender las biopelículas de las tapas con clavijas y evaluar su viabilidad. Siga estos pasos para utilizar el sonicador UIP400MTP:

1. Prepare el conjunto:
   Añada medio de recuperación (p. ej., caldo neutralizante o medio de crecimiento fresco) a cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos.
2. Transfiera la tapa con clavijas:
   Retire la tapa con clavijas de la placa de tratamiento antimicrobiano.
   Enjuague la tapa con clavijas con solución salina estéril o PBS para eliminar los agentes antimicrobianos residuales.
3. Coloque la placa y el sonicador:
   Coloque la tapa con clavijas sobre la placa que contiene el medio de recuperación.
   Coloque la placa con el medio de recuperación sobre la plataforma del sonicador UIP400MTP, asegurándose de que esté centrada y estable.
4. Ajuste los parámetros de sonicación:
   Configure los parámetros de sonicación en el UIP400MTP (los ajustes pueden adaptarse a la biopelícula):
   Amplitud: 70–100%.
   Tiempo de sonicación: 1–3 minutos (ajústelo en función de la resistencia de la biopelícula) en modo cíclico.
5. Sonique:
   Inicie el proceso de sonicación. La vibración ultrasónica desprenderá las biopelículas de las superficies de las clavijas y las liberará en el medio de recuperación.
6. Supervise el proceso:
   Utilice el sensor de temperatura enchufable para controlar la temperatura de las muestras en los pocillos. El UIP400MTP puede conectarse a un refrigerador de laboratorio para la refrigeración.
7. Manipulación posterior a la sonicación:
   Transfiera inmediatamente el medio de recuperación (que ahora contiene las biopelículas desprendidas) a una nueva placa estéril para su análisis posterior.

(A) Placa que contiene TSB con 2% de glucosa utilizada para la formación de biopelículas, la recuperación celular y la
determinación de MIC y MBCB; (B) Tapa con clavijas para la formación de biopelículas estafilocócicas. determinación de MIC y MBCB; (B) Tapa con clavijas para la formación de biopelículas estafilocócicas.
Las células de las biopelículas formadas en las clavijas se desprendieron mediante sonicación (Hielscher Ultrasound Technology) durante 5 min en placas de 96 pocillos que contenían medio de cultivo fresco para la recuperación de las células.
(Imagen y estudio: ©de Oliveira et al., 2016)

Paso 4: Evaluación de la viabilidad

Siembre en placa y cultive las biopelículas desprendidas:

1. Realice diluciones seriadas del medio de recuperación y siémbrelas en agar para cuantificar las unidades formadoras de colonias (CFU).
   Como alternativa, utilice un ensayo de viabilidad colorimétrico o basado en fluorescencia.
2. Registre los resultados:
   Determine la MBEC como la concentración más baja de antimicrobiano que eliminó toda viabilidad detectable de la biopelícula.

Diseño, fabricación y asesoramiento – Calidad fabricada en Alemania

Los ultrasonicadores Hielscher son reconocidos por sus máximos estándares de calidad y diseño. Su robustez y facilidad de uso permiten integrar nuestros ultrasonicadores sin dificultades en instalaciones industriales. Los sonicadores Hielscher soportan sin problemas las condiciones adversas y los entornos exigentes.

Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO que presta especial atención a los ultrasonicadores de alto rendimiento con tecnología de vanguardia y facilidad de uso. Por supuesto, los ultrasonicadores Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.

Lea aquí cómo se utiliza el UIP400MTP para desprender biopelículas como etapa de preparación de muestras en el protocolo ASTM E2799, destinado a evaluar la eficacia de los desinfectantes frente a biopelículas de Pseudomonas aeruginosa mediante el ensayo MBEC.