Protocolo de ensayo MBEC con el sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP

El ensayo MBEC se utiliza para determinar la concentración de agentes antimicrobianos necesaria para eliminar las biopelículas formadas en las tapas de las placas. Para evaluar la viabilidad de las biopelículas, primero hay que separarlas de las tapas de una placa de 96 pocillos. La sonicación es el método más fiable y eficaz para este desprendimiento. El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP está diseñado específicamente para procesar placas de ensayo con la máxima eficiencia y comodidad, agilizando y acelerando los ensayos MBEC de alto rendimiento.

Sonicación para el desprendimiento de biopelículas

La sonicación es un paso crucial en los ensayos de Concentración Mínima de Erradicación de Biopelículas (MBEC), ya que permite desalojar eficazmente las células de biopelículas de su superficie de fijación. Las biopelículas son comunidades intrínsecamente estructuradas de microorganismos encerrados en una matriz extracelular, lo que las hace mucho más resistentes a los agentes antimicrobianos que las células planctónicas. Durante los ensayos MBEC, la sonicación utiliza ondas ultrasónicas para generar una cavitación controlada que rompe la matriz de la biopelícula y libera las células incrustadas en una suspensión. Este paso garantiza que las células del biofilm se dispersen uniformemente en el medio de recuperación, lo que facilita la evaluación precisa de la viabilidad mediante métodos de chapado, dilución o espectrofotometría. Sin un desprendimiento adecuado de la biopelícula, los componentes residuales de la matriz podrían proteger a las células, lo que llevaría a subestimar la eficacia antimicrobiana. Por lo tanto, la sonicación es indispensable para obtener valores de MBEC fiables y reproducibles, que reflejen el verdadero potencial de erradicación de los agentes ensayados. El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP permite la preparación sencilla de muestras de alto rendimiento en placas de ensayo.

Protocolo de ensayo de concentración mínima de erradicación de biopelículas (MBEC)

Paso 1: Formación del biofilm

1. Preparar la suspensión bacteriana:
   Cultivar las bacterias en los medios adecuados hasta alcanzar la fase logarítmica.
   Diluir el cultivo bacteriano hasta una densidad óptica definida (por ejemplo, OD600 ~0,1).
2. Inocular la placa de 96 pocillos:
   Añadir la suspensión bacteriana (por ejemplo, 150-200 µl) en cada pocillo de una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos.
3. Coloque la tapa de la clavija:
   Coloque la tapa de la clavija en la placa inoculada para permitir la formación de biofilm en las superficies de la clavija.
4. Incubar la placa:
   Incubar el montaje a una temperatura adecuada (por ejemplo, 37°C) durante 24-48 horas sin agitar para favorecer el crecimiento de la biopelícula.

Paso 2: Tratamiento con agentes antimicrobianos

• Preparar soluciones antimicrobianas:
  Preparar una gama de concentraciones antimicrobianas en medios frescos.
  Exponer las biopelículas a agentes antimicrobianos:
  Retire la tapa del cultivo bacteriano y enjuáguelo en solución salina estéril o PBS para eliminar las células planctónicas.
  Colocar la tapa de la clavija en una nueva placa de 96 pocillos que contenga las soluciones antimicrobianas.
• Incubar la placa:
  Incubar durante un período definido (por ejemplo, 24 horas) para permitir la exposición antimicrobiana.

Paso 3: Sonicación con el sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP

El paso de sonicación es fundamental para desprender las biopelículas de las tapas de las clavijas y evaluar la viabilidad. Siga estos pasos para el sonicador UIP400MTP:

1. Prepara el montaje:
   Llenar una placa de 96 pocillos nueva con medio de recuperación (por ejemplo, caldo neutralizante o medio de crecimiento nuevo) en cada pocillo.
2. Transferir la tapa de la clavija:
   Retire la tapa de la placa de tratamiento antimicrobiano.
   Enjuague la tapa de la clavija en solución salina estéril o PBS para eliminar los agentes antimicrobianos residuales.
3. Coloque la placa y el sonicador:
   Coloque la tapa de la clavija en la placa del medio de recuperación.
   Coloque la placa del medio de recuperación en la plataforma del sonicador UIP400MTP, asegurándose de que la placa esté centrada y estable.
4. Ajuste los parámetros de sonicación:
   Ajustar los parámetros de sonicación en el UIP400MTP (Los ajustes pueden adaptarse a la biopelícula):
   Amplitud: 70-100%.
   Tiempo de sonicación: 1-3 minutos (ajustar en función de la solidez de la biopelícula) en modo ciclo.
5. Sonicate:
   Inicie el proceso de sonicación. La vibración ultrasónica desalojará las biopelículas de las superficies de las clavijas al medio de recuperación.
6. Supervise el proceso:
   Utilice el sensor de temperatura enchufable para controlar la temperatura de la muestra en los pocillos. El UIP400MTP puede conectarse a un refrigerador de laboratorio para la refrigeración.
7. Manipulación posterior a la sonicación:
   Transfiera inmediatamente el medio de recuperación (que ahora contiene biopelículas desprendidas) a una placa estéril nueva para su análisis posterior.

(A) Placa que contiene TSB con glucosa al 2% utilizada para la formación de biopelículas, recuperación de células y
determinación de MIC y MBCB; (B) Tapa con alfileres para la formación de biopelículas estafilocócicas. determinación de MIC y MBCB; (B) Tapa con alfileres para la formación de biopelículas estafilocócicas.
Las células de biopelícula formadas en las agujas se desalojaron mediante sonicación (tecnología de ultrasonidos Hielscher) durante 5 min en placas de 96 pocillos que contenían medio de cultivo fresco para la recuperación de las células.
(Fotografía y estudio: ©de Oliveira et al., 2016)

Paso 4: Evaluación de la viabilidad

Placa y cultivo de biopelículas desprendidas:

1. Realizar diluciones seriadas del medio de recuperación y colocar en placas de agar para enumerar las unidades formadoras de colonias (UFC).
   Como alternativa, utilice un ensayo de viabilidad colorimétrico o basado en fluorescencia.
2. Resultados récord:
   Determinar la MBEC como la concentración más baja de antimicrobiano que erradicó la viabilidad detectable de la biopelícula.

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Lea aquí cómo se utiliza el UIP400MTP para el desprendimiento de la biopelícula como paso de preparación de la muestra durante el protocolo ASTM E2799 para probar la eficacia de los desinfectantes contra la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa utilizando el ensayo MBEC.