Protocolo del ensayo de concentración mínima inhibitoria (MIC)

El ensayo de concentración mínima inhibitoria (MIC) basado en biopelículas es un método esencial para evaluar la eficacia de los agentes antimicrobianos frente a los microorganismos asociados a biopelículas, que presentan una mayor resistencia debido a su matriz extracelular protectora. Un paso crucial de este ensayo es el desprendimiento de las estructuras de la biopelícula para liberar las células inmersas en ella y evaluar su viabilidad con precisión. El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP facilita este proceso mediante ultrasonidos focalizados que generan cavitación controlada, desprendiendo eficazmente las células de la biopelícula y dispersándolas en una suspensión uniforme. Esta disgregación precisa y reproducible de la biopelícula mejora la fiabilidad y la capacidad de procesamiento de los ensayos MIC, lo que convierte al UIP400MTP en una herramienta esencial para el avance de la investigación sobre biopelículas.

¿Por qué utilizar la sonicación durante los ensayos MIC?

• Datos precisos y reproducibles: Obtenga suspensiones celulares uniformes que eliminen la protección de la matriz, garantizando que los recuentos de colonias y las lecturas de densidad óptica reflejen fielmente la eficacia antimicrobiana.
• Eficiencia con alta capacidad de procesamiento: Procese simultáneamente una placa completa de 96 pocillos en solo 1–3 minutos, sustituyendo el raspado manual lento e irregular por un flujo de trabajo optimizado.
• Conservación de la viabilidad celular: Desprenda suavemente las células inmersas en la biopelícula sin los daños físicos causados por el raspado, manteniendo tasas de supervivencia más altas para obtener cálculos fiables de MIC/MBEC.
• Riesgo nulo de contaminación cruzada: Benefíciese de un diseño de sonotrodo de copa sin contacto que trata todos los pocillos de manera uniforme, sin que las sondas toquen las muestras ni los pocillos individuales.
• Cumplimiento de normas: Ajuste su metodología a protocolos validados del sector, como ASTM E2799-22, para aportar mayor credibilidad a sus datos con fines regulatorios o de publicación.
• Cribado fiable de fármacos y tratamientos: Confíe en sus resultados de sensibilidad para tomar decisiones mejor fundamentadas sobre la eficacia antimicrobiana, la caracterización de la resistencia o el desarrollo terapéutico.

Sonicación para el desprendimiento de biopelículas

El ensayo MIC basado en biopelículas suele medir la viabilidad bacteriana o la inhibición del crecimiento mediante métodos como la siembra en placa, el recuento de colonias o las mediciones de densidad óptica. La sonicación es un paso crucial de los ensayos MIC basados en biopelículas cuando se evalúa la sensibilidad a los antimicrobianos de los microorganismos asociados a biopelículas. Su función principal es desprender y dispersar las células inmersas en la matriz de la biopelícula en una suspensión uniforme para realizar un análisis preciso.
Las biopelículas son considerablemente más resistentes a los agentes antimicrobianos que las células planctónicas, por lo que un desprendimiento adecuado resulta crucial para un análisis preciso. Durante este proceso, las ondas ultrasónicas generan cavitación controlada, disgregando la matriz de la biopelícula y liberando las células inmersas en ella en una suspensión uniforme dentro del medio de recuperación. Este paso permite evaluar con precisión la viabilidad de las células dispersadas de la biopelícula mediante métodos como la siembra en placa, la dilución y el recuento de colonias. La disgregación adecuada de la biopelícula mediante sonicación evita que los componentes residuales de la matriz protejan las células, lo que, de otro modo, podría llevar a subestimar la actividad antimicrobiana. El sonicador de placas multipocillo UIP400MTP es especialmente adecuado para este fin, ya que ofrece condiciones de sonicación precisas y reproducibles que garantizan una preparación fiable de las placas de ensayo con alta capacidad de procesamiento.

Por qué es necesaria la sonicación en los ensayos de concentración mínima inhibitoria basados en biopelículas

Para medir la viabilidad y realizar recuentos celulares, se requiere un desprendimiento y una dispersión completos y fiables de células individuales. El UIP400MTP favorece el desprendimiento uniforme de las biopelículas y la dispersión celular sin causar daños, para obtener resultados sólidos en los ensayos.

• Complejidad de las biopelículas: Las biopelículas son comunidades microbianas estructuradas rodeadas por una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS), que protege a los microorganismos y los hace más resistentes a los agentes antimicrobianos.
• Dispersión uniforme: Para medir con precisión la viabilidad de las células inmersas en la biopelícula o su sensibilidad a los antimicrobianos, primero debe desprenderse y disgregarse la biopelícula hasta obtener una suspensión homogénea.

Protocolo del ensayo de concentración mínima inhibitoria basado en biopelículas

El ensayo de concentración mínima inhibitoria (MIC) determina la concentración más baja de un agente antimicrobiano necesaria para inhibir el crecimiento visible de los microorganismos. Este protocolo está diseñado para microorganismos asociados a biopelículas y utiliza el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP para disgregar las biopelículas.

Paso 1: Preparación del inóculo bacteriano

1. Prepare la suspensión bacteriana:
   Cultive las bacterias en medios adecuados hasta la fase logarítmica media.
   Diluya el cultivo para obtener una densidad celular estandarizada (p. ej., estándar 0,5 de McFarland u OD600 ~0,1).
2. Prepare las soluciones antimicrobianas:
   Diluya el agente antimicrobiano en un medio adecuado para obtener un intervalo de concentraciones (p. ej., diluciones seriadas al doble).
3. Dispense en la placa de 96 pocillos:
   Añada las soluciones antimicrobianas a los pocillos de una placa estándar de 96 pocillos, con un volumen final por pocillo de ~150–200 µL.
   Incluya controles de crecimiento (sin antimicrobiano) y controles de esterilidad (sin inóculo bacteriano).

Paso 2: Formación de biopelículas en la tapa con clavijas

• Coloque la tapa con clavijas:
  Coloque la tapa especializada con clavijas sobre los pocillos inoculados, asegurándose de que las clavijas queden completamente sumergidas en la suspensión bacteriana.
• Incube la placa:
  Incube a la temperatura adecuada (p. ej., 37 °C) durante un tiempo especificado (p. ej., 24 horas) en condiciones estáticas para permitir la formación de biopelículas en las clavijas.

Paso 3: Exposición a los antimicrobianos

• Enjuague las clavijas:
  Retire la tapa con clavijas de la suspensión bacteriana y enjuáguela suavemente con solución salina estéril o PBS para eliminar las células planctónicas débilmente adheridas.
• Exponga las biopelículas a los antimicrobianos:
  Transfiera la tapa con clavijas a una nueva placa de 96 pocillos que contenga las diluciones antimicrobianas preparadas previamente.
  Incube durante un periodo definido (p. ej., 24 horas) en condiciones estáticas para permitir que el agente antimicrobiano actúe sobre las biopelículas.

Paso 4: Sonicación con el sonicador de microplacas UIP400MTP

La etapa de sonicación es crucial para desprender las biopelículas de las tapas con clavijas y evaluar su viabilidad. Siga estos pasos para utilizar el sonicador UIP400MTP:

1. Prepare el montaje:
   Llene cada pocillo de una nueva placa de 96 pocillos con medio de recuperación (p. ej., caldo neutralizante o medio de crecimiento estéril).
2. Transfiera la tapa con clavijas:
   Retire la tapa con clavijas de la placa de tratamiento antimicrobiano.
   Enjuague la tapa con clavijas con solución salina estéril o PBS para eliminar los agentes antimicrobianos residuales.
3. Coloque la placa en el sonicador:
   Coloque la tapa con clavijas sobre la placa con medio de recuperación.
   Introduzca la placa con medio de recuperación en el sonicador UIP400MTP, asegurándose de que quede centrada y estable, tal como se describe en el manual.
4. Ajuste los parámetros de sonicación:
   Configure los parámetros de sonicación en el UIP400MTP (los ajustes pueden adaptarse a la biopelícula):
   Amplitud: 70–100%.
   Tiempo de sonicación: 1–3 minutos (ajústelo según la estructura de la biopelícula) en modo cíclico.
5. Sonique:
   Inicie el proceso de sonicación. Las ondas ultrasónicas disgregarán la matriz de la biopelícula y desprenderán las células, liberándolas en el medio de recuperación.
6. Supervise el proceso:
   Utilice el sensor de temperatura conectable para supervisar la temperatura de las muestras en los pocillos. El UIP400MTP puede conectarse a un refrigerador de laboratorio para la refrigeración.
7. Manipulación posterior a la sonicación:
   Transfiera inmediatamente el medio de recuperación que contiene las biopelículas desprendidas a una nueva placa estéril para su posterior análisis.

(A) Placa que contiene TSB con 2% de glucosa, utilizada para la formación de biopelículas, la recuperación celular y la determinación de MIC y MBEC; (B) Tapa con clavijas para la formación de biopelículas estafilocócicas.
Las células de la biopelícula formada en las clavijas se desprendieron mediante sonicación (Hielscher Ultrasound Technology) durante 5 min en placas de 96 pocillos que contenían medio de cultivo fresco para la recuperación de las células.
(Imagen y estudio: ©de Oliveira et al., 2016)

Paso 4: Evaluación de la viabilidad

Siembre en placa y cultive las biopelículas desprendidas:

1. Realice diluciones seriadas del medio de recuperación y siémbrelas en agar para determinar el número de unidades formadoras de colonias (CFU).
2. Evalúe la MIC:
   Determine la MIC como la concentración antimicrobiana más baja que inhibe por completo el crecimiento microbiano visible en el medio de recuperación.

MIC, concentración mínima inhibitoria: ejemplo de una placa de microtitulación e interpretación de los resultados de microdilución.
(Estudio e imagen: ©Jaskiewicz et al. 2019)

¿Quién se beneficia de la sonicación durante los ensayos MIC?

• Fabricantes de productos sanitarios: Para comprobar la eficacia de los recubrimientos superficiales y validar los protocolos de limpieza de dispositivos propensos a la formación de biopelículas.
• Microbiólogos clínicos: Para diagnosticar con precisión las infecciones asociadas a implantes (como la PJI) mediante la recuperación de bacterias de los componentes de los dispositivos médicos.
• Desarrolladores de productos farmacéuticos: Para evaluar la eficacia de nuevos agentes antimicrobianos frente a patógenos resistentes inmersos en biopelículas.
• Investigadores académicos: Para realizar estudios reproducibles con alta capacidad de procesamiento sobre la biología de las biopelículas y los mecanismos de resistencia a los antimicrobianos.
• Equipos de control de calidad industrial: Para evaluar la bioincrustación y la eficacia de los desinfectantes en entornos industriales (p. ej., mediante las normas ASTM E2799-22).

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Lea aquí cómo se utiliza el UIP400MTP para desprender biopelículas en el protocolo ASTM E2799 – Evaluación de la eficacia de los desinfectantes frente a la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa mediante el ensayo MBEC.