Protocolo de ensayo de concentración inhibitoria mínima (CIM)

El ensayo de concentración inhibitoria mínima (CIM) basado en biopelículas es un método esencial para evaluar la eficacia de los agentes antimicrobianos contra los microorganismos asociados a biopelículas, que muestran una mayor resistencia debido a su matriz extracelular protectora. Un paso crucial en este ensayo es la disrupción de las estructuras de la biopelícula para liberar las células incrustadas y realizar una evaluación precisa de la viabilidad. El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP facilita este proceso empleando ultrasonidos focalizados para generar una cavitación controlada, desprendiendo eficazmente las células de la biopelícula y dispersándolas en una suspensión uniforme. Esta disrupción precisa y reproducible de la biopelícula mejora la fiabilidad y el rendimiento de los ensayos de MIC, lo que convierte al UIP400MTP en una herramienta esencial para avanzar en la investigación de la biopelícula.

Sonicación para el desprendimiento de biopelículas

El ensayo de CMI basado en biopelículas suele medir la viabilidad bacteriana o la inhibición del crecimiento mediante métodos como la siembra en placas, el recuento de colonias o la medición de la densidad óptica. La sonicación es un paso crítico en los ensayos MIC basados en biopelículas cuando se evalúa la susceptibilidad antimicrobiana de microorganismos asociados a biopelículas. Su función principal es desprender y dispersar las células incrustadas en la matriz de la biopelícula en una suspensión uniforme para un análisis preciso.
Las biopelículas son mucho más resistentes a los agentes antimicrobianos que las células planctónicas, por lo que un desprendimiento adecuado es fundamental para un análisis preciso. Durante este proceso, las ondas ultrasónicas generan una cavitación controlada que rompe la matriz de la biopelícula y libera las células incrustadas en una suspensión uniforme dentro del medio de recuperación. Este paso permite realizar evaluaciones precisas de la viabilidad de las células dispersas en el biofilm mediante métodos como la siembra en placas, la dilución y el recuento de colonias. La disrupción adecuada de la biopelícula mediante sonicación evita que los componentes residuales de la matriz protejan a las células, lo que de otro modo podría conducir a una subestimación de la actividad antimicrobiana. El sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP es especialmente adecuado para este fin, ya que ofrece condiciones de sonicación precisas y reproducibles para garantizar una preparación fiable y de alto rendimiento de las placas de ensayo.

Por qué es necesaria la sonicación en los ensayos de concentración inhibitoria mínima basados en biopelículas

Para las mediciones de viabilidad y el recuento de células, se requiere un desprendimiento y dispersión completos y fiables de las células individuales. El UIP400MTP favorece un desprendimiento uniforme y no dañino de la biopelícula y la dispersión celular para obtener resultados sólidos en los ensayos.

• Complejidad del biofilm: Las biopelículas son comunidades microbianas estructuradas encerradas en una matriz de sustancia polimérica extracelular (EPS), que protege a los microorganismos y los hace más resistentes a los agentes antimicrobianos.
• Dispersión uniforme: Para medir con precisión la viabilidad de las células incrustadas en la biopelícula o su susceptibilidad a los antimicrobianos, primero hay que desprender la biopelícula y descomponerla en una suspensión homogénea.

Protocolo de ensayo de concentración inhibitoria mínima basado en biopelículas

El ensayo de concentración inhibitoria mínima (CIM) determina la concentración más baja de un agente antimicrobiano necesaria para inhibir el crecimiento visible de microorganismos. Este protocolo está diseñado para microorganismos asociados a biopelículas, utilizando el sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP para la disrupción de biopelículas.

Paso 1: Preparación del inóculo bacteriano

1. Preparar la suspensión bacteriana:
   Cultivar las bacterias en medios adecuados hasta la fase logarítmica media.
   Diluir el cultivo hasta alcanzar una densidad celular normalizada (por ejemplo, 0,5 McFarland estándar u OD600 ~0,1).
2. Preparar soluciones antimicrobianas:
   Diluir el agente antimicrobiano en un medio adecuado para crear una gama de concentraciones (por ejemplo, diluciones seriadas al doble).
3. Dispensar en la placa de 96 pocillos:
   Añadir las soluciones antimicrobianas en los pocillos de una placa estándar de 96 pocillos, con un volumen final de pocillos de ~150-200 µl.
   Incluir controles de crecimiento (sin antimicrobiano) y controles de esterilidad (sin inóculo bacteriano).

Paso 2: Formación de biofilm en la tapa de la clavija

• Coloque la tapa de la clavija:
  Coloque la tapa especializada en clavijas en los pocillos inoculados, asegurándose de que las clavijas estén completamente sumergidas en la suspensión bacteriana.
• Incubar la placa:
  Incubar a la temperatura adecuada (por ejemplo, 37°C) durante un tiempo determinado (por ejemplo, 24 horas) en condiciones estáticas para permitir la formación de biopelículas en las clavijas.

Paso 3: Exposición antimicrobiana

• Aclara las clavijas:
  Retire la tapa de la suspensión bacteriana y enjuague suavemente con solución salina estéril o PBS para eliminar las células planctónicas sueltas.
• Exposición a antimicrobianos:
  Transfiera la tapa de la clavija a una nueva placa de 96 pocillos que contenga las diluciones antimicrobianas preparadas anteriormente.
  Incubar durante un periodo definido (por ejemplo, 24 horas) en condiciones estáticas para permitir que el agente antimicrobiano actúe sobre las biopelículas.

Paso 4: Sonicación con el sonicador de microplacas UIP400MTP

El paso de sonicación es fundamental para desprender las biopelículas de las tapas de las clavijas y evaluar la viabilidad. Siga estos pasos para el sonicador UIP400MTP:

1. Prepara el montaje:
   Llenar una nueva placa de 96 pocillos con medio de recuperación (por ejemplo, caldo neutralizante o medio de crecimiento estéril) en cada pocillo.
2. Transferir la tapa de la clavija:
   Retire la tapa de la placa de tratamiento antimicrobiano.
   Enjuague la tapa de la clavija en solución salina estéril o PBS para eliminar los agentes antimicrobianos residuales.
3. Coloque la placa en el sonicador:
   Coloque la tapa de la clavija en la placa del medio de recuperación.
   Coloque la placa de medio de recuperación en el sonicador UIP400MTP, asegurándose de que la placa se asienta centrada y estable como en el manual descrito.
4. Ajuste los parámetros de sonicación:
   Ajustar los parámetros de sonicación en el UIP400MTP (los ajustes pueden adaptarse a la biopelícula):
   Amplitud: 70-100%.
   Tiempo de sonicación: 1-3 minutos (ajustar en función de la estructura de la biopelícula) en modo ciclo.
5. Sonicate:
   Inicie el proceso de sonicación. Las ondas ultrasónicas romperán la matriz del biofilm y desalojarán las células al medio de recuperación.
6. Supervise el proceso:
   Utilice el sensor de temperatura enchufable para controlar la temperatura de la muestra en los pocillos. El UIP400MTP puede conectarse a un refrigerador de laboratorio para la refrigeración.
7. Manipulación posterior a la sonicación:
   Transfiera inmediatamente el medio de recuperación que contiene las biopelículas desprendidas a una placa estéril nueva para su posterior análisis.

(A) Placa que contiene TSB con glucosa al 2% utilizada para la formación de biopelículas, la recuperación de células y la determinación de MIC y MBEC; (B) Tapa con alfileres para la formación de biopelículas estafilocócicas.
Las células de biopelícula formadas en las agujas se desalojaron mediante sonicación (tecnología de ultrasonidos Hielscher) durante 5 min en placas de 96 pocillos que contenían medio de cultivo fresco para la recuperación de las células.
(Fotografía y estudio: ©de Oliveira et al., 2016)

Paso 4: Evaluación de la viabilidad

Placa y cultivo de biopelículas desprendidas:

1. Realizar diluciones seriadas del medio de recuperación y colocar en placas de agar para enumerar las unidades formadoras de colonias (UFC).
2. Evaluar el MIC:
   Determinar la CMI como la concentración antimicrobiana más baja que inhibe completamente el crecimiento microbiano visible en el medio de recuperación.

MIC Concentración inhibitoria mínima: Ejemplo de placa de microtitulación e interpretación de los resultados de la microdilución.
(Estudio e imagen: ©Jaskiewicz et al. 2019)

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Lea aquí cómo se utiliza el UIP400MTP para el desprendimiento de biopelículas en el protocolo ASTM E2799 – Comprobación de la eficacia de los desinfectantes contra la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa mediante el ensayo MBEC.