Protocolo de uso de sonicadores Hielscher para múltiples muestras en el análisis de biopelículas y el análisis proteómico

El uso de sonicadores para múltiples muestras, como el sonicador multitubo VialTweeter y el sonicador de microplacas UIP400MTP, agiliza los flujos de trabajo de laboratorio para aplicaciones de alta capacidad de procesamiento. Ambos equipos permiten un procesamiento ultrasónico preciso y uniforme de múltiples muestras, lo que minimiza la variabilidad y mejora la reproducibilidad. Esto resulta especialmente ventajoso en experimentos que requieren una lisis de muestras, un desprendimiento de biopelículas, una extracción de proteínas o una digestión proteolítica uniformes, en los que los métodos manuales o de procesamiento de una sola muestra son menos eficientes y propensos a resultados inconsistentes.

Agilice los flujos de trabajo con sonicadores para múltiples muestras

El UIP400MTP, por ejemplo, permite el tratamiento ultrasónico simultáneo de los pocillos de las microplacas, lo que garantiza un desprendimiento uniforme de las biopelículas o del material celular. Por su parte, el VialTweeter ofrece una lisis y una homogeneización precisas de múltiples muestras en tubos sin contaminación cruzada. Estos sonicadores reducen significativamente los tiempos de procesamiento, mejoran la reproducibilidad experimental y preservan un alto grado de integridad de las muestras, por lo que son herramientas indispensables en la investigación en microbiología, proteómica y biología molecular.
A continuación se presenta un protocolo detallado que ejemplifica el uso de los modelos de sonicadores Hielscher para múltiples muestras, el sonicador multitubo VialTweeter y el sonicador de microplacas UIP400MTP, en un estudio sobre la formación de biopelículas de E. coli y su posterior análisis proteómico.

Protocolo: formación y desprendimiento de biopelículas y análisis proteómico mediante sonicadores Hielscher para múltiples muestras

1. Preparación del cultivo bacteriano

• Cultive bacterias E. coli (cepa W3110) a 30 °C, una temperatura favorable para la formación de biopelículas de E. coli, en un medio de caldo de triptona (TB) que contenga:
  – 10 g/L de triptona
  – 5 g/L de NaCl
• Añada antibióticos según sea necesario para garantizar la retención de los plásmidos.
• Para los estudios de microscopía y de actividad de los promotores, utilice la cepa W3110 de E. coli con un reportero genómico de GFP mejorada (eGFP) bajo el control del promotor rplL.
• Utilice plásmidos reporteros de GFP para diversos promotores (p. ej., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) para medir la actividad de los promotores.

2. Cultivo y desprendimiento de biopelículas

• Siembre 1,5 mL de cultivo bacteriano diluido por pocillo en una placa de 12 pocillos (placas CellStar de 12 pocillos, Greiner Bio-One).
• Incube para permitir la formación de biopelículas.
• Retire cuidadosamente el cultivo planctónico (no adherido).

– Lave cada pocillo con 500 µL de PBS.
– Desprenda las células adheridas sonicando la placa de 12 pocillos en el sonicador de microplacas UIP400MTP. El UIP400MTP garantiza un desprendimiento uniforme al suministrar energía ultrasónica de forma homogénea a todos los pocillos.
– Parámetros de sonicación: amplitud del 60%, modo de ciclos: 60 sec de encendido / 30 sec de apagado.

3. Recolección y lisis celular

• Centrifugue las células desprendidas de la biopelícula a 4.500 g durante 5 minutos.
• Lave con PBS las células sedimentadas.
• Resuspenda las células en 100 µL de lauroil sarcosinato de sodio (SLS) al 2% e incube a 95 °C durante 15 minutos.
• Sonique con el sonicador multitubo VialTweeter para garantizar una lisis celular completa.
  – Parámetros de sonicación: amplitud del 100%, 50 s de encendido / 10 s de apagado durante un tiempo total de funcionamiento de 10 min; mantenga las muestras en hielo.

4. Reducción y alquilación

• Añada 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reducir los enlaces disulfuro e incube a 95 °C durante 15 minutos.
• Alquile las proteínas con 10 mM de yodoacetamida durante 30 minutos a 25 °C.

5. Cuantificación y digestión de proteínas

• Centrifugue los lisados para eliminar los restos celulares.
• Cuantifique el contenido total de proteínas con el kit Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Digiera 50 µg de proteína total con 1 µg de tripsina en una solución que contenga 2% de SLS y 100 mM de bicarbonato de amonio.
• Incube la reacción de digestión durante toda la noche a 30 °C.

6. Purificación de péptidos

• Precipite el SLS añadiendo ácido trifluoroacético (TFA) al 1,5% y, a continuación, centrifugue.
• Purifique los péptidos con columnas de microcentrifugación C18.
• Seque los péptidos purificados y resuspéndalos en TFA al 0,1%.

7. Cromatografía líquida–espectrometría de masas (LC-MS/MS)

• Analice los péptidos en un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus acoplado a un sistema Ultimate 3000 RSLC nano.
• Separe los péptidos mediante una columna de HPLC de fase inversa (75 µm × 42 cm) empaquetada con resina C18 (2,4 µm).
• Aplique un gradiente del 2% al 35% de disolvente B (acetonitrilo con 0,15% de ácido fórmico) durante 140 minutos.
• Adquiera los datos mediante barridos de MS de alta resolución seguidos de barridos de MS/MS en tándem de los 10 iones más intensos.

8. Análisis de datos

• Procese los datos brutos de LC-MS con el software Progenesis.
• Exporte los archivos .mgf y analícelos con MASCOT.
• Realice la cuantificación de péptidos con SafeQuant para el control de calidad y el ajuste por falsos descubrimientos.
• Realice todos los experimentos por duplicado o triplicado para garantizar la reproducibilidad.

Sonicadores para múltiples muestras destinados a la preparación de muestras con alta capacidad de procesamiento

Los modelos de sonicadores para múltiples muestras VialTweeter y UIP400MTP mejoran significativamente la precisión y la eficiencia de los flujos de trabajo experimentales, especialmente en la investigación de biopelículas y en proteómica. Su capacidad para procesar múltiples muestras de forma uniforme garantiza una alta capacidad de procesamiento sin comprometer la calidad de los datos. Estas ventajas, junto con los flujos de trabajo optimizados descritos anteriormente, convierten a los sonicadores Hielscher para múltiples muestras en herramientas esenciales para la investigación biológica moderna.

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