Protocolo de uso de los sonicadores multimuestra de Hielscher en el análisis de biopelículas y proteómica

El uso de sonicadores multimuestra, como el sonicador multitubo VialTweeter y el sonicador de microplacas UIP400MTP, agiliza los flujos de trabajo de laboratorio para aplicaciones de alto rendimiento. Ambos dispositivos permiten un procesamiento ultrasónico preciso y uniforme de múltiples muestras, minimizando la variabilidad y mejorando la reproducibilidad. Esto resulta especialmente ventajoso en experimentos que requieren una lisis uniforme de las muestras, el desprendimiento de biopelículas, la extracción de proteínas o la digestión proteolítica, en los que los métodos manuales o de una sola muestra son menos eficaces y propensos a las incoherencias.

Agilice los flujos de trabajo con los sonicadores multimuestra

El UIP400MTP, por ejemplo, permite el tratamiento ultrasónico simultáneo de pocillos de microplacas, garantizando el desprendimiento uniforme de biopelículas o material celular. Por su parte, el VialTweeter ofrece una lisis y homogeneización precisas de muestras de múltiples tubos sin contaminación cruzada. Estos sonicadores reducen significativamente los tiempos de procesamiento, mejoran la reproducibilidad experimental y mantienen una elevada integridad de las muestras, lo que los convierte en herramientas indispensables para la investigación en microbiología, proteómica y biología molecular.
A continuación se muestra un protocolo detallado que ejemplifica el uso de los modelos de sonicador de muestras múltiples de Hielscher, el sonicador de tubos múltiples VialTweeter y el sonicador de microplacas UIP400MTP, en un estudio sobre la formación de biopelículas de E. coli y el posterior análisis proteómico.

Protocolo: Formación, desprendimiento y análisis proteómico de biopelículas mediante sonicadores multimuestra de Hielscher

1. Preparación del cultivo bacteriano

• Cultivar la bacteria E. coli (cepa W3110) a 30°C, temperatura favorable para la formación de biopelículas de E. coli, en medio de caldo de triptona (TB) que contenga:
  – 10 g/L de triptona
  – 5 g/L NaCl
• Suplementar con antibióticos según sea necesario para asegurar la retención del plásmido.
• Para los estudios de microscopía y de actividad del promotor, utilice la cepa W3110 de E. coli con un reportero genómico de GFP mejorada (eGFP) bajo el control del promotor rplL.
• Utilizar plásmidos informadores de GFP para diversos promotores (p. ej, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) para medir las actividades promotoras.

2. Cultivo y desprendimiento de biopelículas

• Sembrar 1,5 mL de cultivo bacteriano diluido por pocillo en una placa de 12 pocillos (placas CellStar de 12 pocillos, Greiner Bio-One).
• Incubar para permitir la formación de la biopelícula.
• Retire con cuidado el cultivo planctónico (no adherente).

– Lavar cada pocillo con 500 µl de PBS.
– Desprenda las células adheridas sonicando la placa de 12 pocillos en el sonicador de microplacas UIP400MTP. El UIP400MTP asegura un desprendimiento uniforme mediante la entrega de energía ultrasónica consistente en todos los pocillos.
– Ajustes de sonicación: 60% amplitud, modo ciclo: 60 seg ON / 30 seg OFF.

3. Recogida y lisis celular

• Centrifugar las células de biofilm desprendidas a 4.500 g durante 5 minutos.
• Lavar las células sedimentadas con PBS.
• Resuspender las células en 100 µl de lauroil sarcosinato sódico (SLS) al 2% e incubar a 95°C durante 15 minutos.
• Sonicate utilizando el VialTweeter Multi-Tube Sonicator para asegurar la lisis celular completa.
  – Ajustes de sonicación: 100% de amplitud, 50 s ON / 10 s OFF durante 10 min en total; mantener las muestras en hielo.

4. Reducción y alquilación

• Añadir 5 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reducir los enlaces disulfuro e incubar a 95°C durante 15 minutos.
• Alquilen las proteínas con 10 mM de yodoacetamida durante 30 minutos a 25°C.

5. Cuantificación y digestión de proteínas

• Centrifugar los lisados para eliminar los restos.
• Cuantificar el contenido total de proteínas utilizando el Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Digerir 50 µg de proteína total con 1 µg de tripsina en una solución que contenga un 2% de SLS y 100 mM de bicarbonato de amonio.
• Incubar la reacción de digestión durante toda la noche a 30°C.

6. Purificación de péptidos

• Precipitar el SLS añadiendo ácido trifluoroacético (TFA) al 1,5% y, a continuación, centrifugar.
• Purificación de péptidos mediante columnas C18 microspin.
• Secar los péptidos purificados y resuspender en TFA al 0,1%.

7. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS)

• Analizar los péptidos en un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus acoplado a un nanosistema Ultimate 3000 RSLC.
• Separar los péptidos utilizando una columna HPLC de fase inversa (75 µm × 42 cm) empaquetada con resina C18 (2,4 µm).
• Aplicar un gradiente de 2% a 35% de disolvente B (acetonitrilo con 0,15% de ácido fórmico) durante 140 minutos.
• Obtenga datos mediante barridos MS de alta resolución seguidos de barridos MS/MS en tándem de los 10 iones más intensos.

8. Análisis de datos

• Procesamiento de datos LC-MS brutos mediante el software Progenesis.
• Exporte archivos .mgf y analícelos con MASCOT.
• Realice la cuantificación de péptidos utilizando SafeQuant para el control de calidad y el ajuste de falsos descubrimientos.
• Realice todos los experimentos por duplicado o triplicado para garantizar la reproducibilidad.

Sonómetros multimuestra para la preparación de muestras de alto rendimiento

Los modelos de sonicador multimuestra VialTweeter y UIP400MTP mejoran significativamente la precisión y la eficacia de los flujos de trabajo experimentales, especialmente en la investigación de biopelículas y proteómica. Su capacidad para procesar múltiples muestras de manera uniforme garantiza un alto rendimiento sin comprometer la calidad de los datos. Estas ventajas, combinadas con los flujos de trabajo racionalizados descritos anteriormente, convierten a los sonicadores multimuestra de Hielscher en herramientas esenciales para la investigación biológica moderna.

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