Desparafinización y extracción de proteínas de FFPE
Facilite la extracción de proteínas de secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) mediante una combinación optimizada de desparafinización, solubilización y sonicación con un ultrasonicador multitubo VialTweeter. Este protocolo es compatible con la proteómica basada en espectrometría de masas y con los flujos de trabajo de limpieza SP3 y digestión enzimática.
Este PNT está dirigido al personal de laboratorio que participa en el análisis proteómico de muestras de tejido FFPE mediante sonicación de alto rendimiento. Está optimizado para un máximo de diez muestras FFPE procesadas en paralelo utilizando el sonicador VialTweeter Multi-Tube Sonicator.
VialTweeter Sonicator para la sonicación simultánea de 10 muestras, por ejemplo, para lisis y extracción de proteínas de muestras FFPE
Protocolo: Extracción de proteínas de muestras FFPE utilizando el VialTweeter
Materiales y reactivos
Reactivos
- Xileno (grado histológico)
- Etanol (absoluto 96%)
- Tampón de lisis:
- Inhibidor de la proteasa (opcional; por ejemplo, cOmplete™ mini sin EDTA).
6 M Clorhidrato de guanidina
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfina)
40 mM CAA (2-cloroacetamida)
Equipo
- Ultrasonidos multitubo VialTweeter
- Tubos de microcentrífuga de bajo enlace de 1,5 mL o 2,0 mL
- Bloque térmico o incubadora (95°C y 80°C)
- Microcentrífuga
- Thermomixer (opcional pero recomendado)
Entrada de muestras
- 1-2 secciones de tejido FFPE de 10 µm de grosor por muestra (es decir, por vial)
- Un total de ~100 µg de tejido por muestra (es decir, por vial)
o
Nota: Utilice cuchillas nuevas para la microtomía a fin de minimizar la contaminación por restos de parafina.
Procedimiento
- desparafinización
- Transfiera las secciones FFPE a tubos de microcentrífuga de baja unión.
- Añadir 1 mL de xileno, agitar brevemente.
- Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 14.000 × g durante 2 minutos; desechar el sobrenadante.
- Repita el lavado con xileno una vez más (Pasos 2-4).
- Lavar el pellet con 1 mL de etanol al 96%, agitar y centrifugar a 14.000 × g durante 2 minutos. Desechar el sobrenadante.
- Repetir el lavado con etanol una vez más (total de 2 lavados con etanol).
- Secar al aire el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente con las tapas abiertas para evaporar el etanol residual.
- Extracción de proteínas y sonicación
- Añadir 200 µl de tampón de lisis a cada pellet seco.
Nota: Aunque el sonicador admite hasta 1 mL, 200 µL es lo óptimo para el procesamiento posterior. - Mezclar mediante vórtex o pipeteo suave.
- Añadir 200 µl de tampón de lisis a cada pellet seco.
- Primera incubación térmica
- Incubar los tubos a 95 °C durante 30 min, con agitación a 400 rpm utilizando un termomezclador o un bloque térmico.
- Dejar enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min.
- Primera sonicación con el VialTweeter
- Coloque los tubos en el VialTweeter.
- Ajustar el VialTweeter UP200St a los valores indicados a continuación y sonicar.
- Segunda incubación térmica
Retirar los tubos e incubar de nuevo a 95 °C durante 15 min, 400 rpm. - Segunda sonicación
Repetir la sonicación en el VialTweeter utilizando los mismos ajustes (como arriba) durante 10 ciclos adicionales (15 min en total). - Clarificación del lisado
- Centrifugar las muestras a 13.000 × g durante 10 min a 23°C (temperatura ambiente).
- Recoger cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo Eppendorf Safe-lock de 2,0 ml. Evite perturbar el pellet.
- Tratamiento posterior
El lisado ya está listo para la limpieza SP3 y la digestión enzimática.
- Ajuste la Amplitud (A) al 100%
- Ajuste el modo de pulsación (C) al 100%.
- Reloj de época: En
- Puntualidad: 60
- Tiempo de apagado: 30s
- Valor límite: 15 min (corresponde a 10 ciclos)
(Nota de cálculo: (60 s Encendido + 30 s Apagado) × 10 ciclos = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter con 10 tubos Eppendorf
Notas y buenas prácticas
- El riesgo de sobrecalentamiento durante la sonicación se mitiga mediante ciclos ON/OFF programados.
- Evitar la agitación en vórtex después de la saturación para evitar la agregación de proteínas.
Eliminación de residuos y seguridad
La tabla siguiente le ofrece una indicación de la capacidad de procesamiento aproximada de nuestros ultrasonicadores de tamaño laboratorio:
| Dispositivos recomendados | Volumen del lote | Tasa de flujo |
|---|---|---|
| UIP400MTP Sonicador de placas de 96 pocillos | placas multipocillo / microtituladoras | n.a. |
| CupHorn ultrasónico | CupHorn para viales o vaso de precipitados | n.a. |
| GDmini2 | reactor ultrasónico de microflujo | n.a. |
| VialTweeter | 0,5 a 1,5 mL | n.a. |
| UP100H | 1 a 500 mL | 10 a 200 mL/min. |
| UP200Ht, UP200St | De 10 a 1000 ml | 20 a 200mL/min |
| UP400St | 10 a 2000 mL | 20 a 400 mL/min. |
| Tamizadora ultrasónica | n.a. | n.a. |
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos de alto rendimiento para aplicaciones de mezcla, dispersión, emulsificación y extracción a escala de laboratorio, piloto e industrial.
Literatura / Referencias
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Preguntas frecuentes
¿Por qué las muestras de tejido se fijan como FFPE?
La conservación en parafina fijada con formalina (FFPE) estabiliza la morfología de los tejidos y las estructuras proteicas mediante la formación de enlaces cruzados covalentes a través del formaldehído. La inclusión en parafina permite el almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente, al tiempo que mantiene la integridad histológica y molecular para análisis retrospectivos.
¿Cómo se desparafinizan las muestras FFPE?
La desparafinización implica lavados secuenciales con disolventes para eliminar la parafina: normalmente dos incubaciones con xileno, seguidas de dos lavados con etanol (96%). Tras la centrifugación y el secado, el tejido está listo para la extracción posterior. Este proceso restablece la accesibilidad de la muestra para la lisis y la digestión enzimática.
¿Para qué sirve la incubación térmica?
La incubación térmica se refiere a la exposición controlada de una muestra a una temperatura definida durante un periodo de tiempo específico para inducir cambios bioquímicos o físicos. En proteómica, suele utilizarse para desnaturalizar proteínas, invertir enlaces cruzados de formaldehído en tejidos FFPE o mejorar la eficacia del tampón de lisis. La temperatura y la duración son parámetros críticos, adaptados a la reacción objetivo o al tipo de muestra.
¿Qué es la digestión SP3?
Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) es un flujo de trabajo proteómico basado en microesferas. Utiliza microesferas paramagnéticas para unir proteínas, lo que permite una limpieza, concentración y digestión enzimática eficiente en la microesfera en condiciones desnaturalizantes. SP3 minimiza la pérdida de muestras y es altamente compatible con muestras FFPE y de bajo rendimiento.
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