Desparafinización y extracción de proteínas de tejidos FFPE

Facilite la extracción de proteínas de cortes de tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) mediante una combinación optimizada de desparafinización, solubilización y sonicación con un sonicador ultrasónico multitubo VialTweeter. Este protocolo permite realizar análisis proteómicos posteriores basados en espectrometría de masas y es compatible con los flujos de trabajo de limpieza mediante SP3 y digestión enzimática.

Este procedimiento normalizado de trabajo está destinado al personal de laboratorio que realiza análisis proteómicos de muestras de tejido FFPE mediante sonicación de alto rendimiento. Está optimizado para procesar en paralelo hasta diez muestras FFPE con el sonicador multitubo VialTweeter.

Protocolo: extracción de proteínas de muestras FFPE con el VialTweeter

Materiales y reactivos

Reactivos

• Xileno (grado histológico)
• Etanol (absoluto, 96%)
• Tampón de lisis:

6 M de clorhidrato de guanidina
50 mM de Tris-HCl, pH 8,5
10 mM de TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina)
40 mM de CAA (2-cloroacetamida)

• Inhibidor de proteasas (opcional; por ejemplo, cOmplete™ mini sin EDTA)

Equipos

• Sonicador ultrasónico multitubo VialTweeter
• Tubos de microcentrífuga de baja adsorción de 1,5 mL o 2,0 mL
• Bloque térmico o incubador (ajustes de 95 °C y 80 °C)
• Microcentrífuga
• Termomezclador (opcional, pero recomendado)

Cantidad de muestra

• 1–2 cortes de tejido FFPE de 10 µm de espesor por muestra (es decir, por vial)

O

• Un total de ~100 µg de tejido por muestra (es decir, por vial)

Nota: utilice cuchillas nuevas para la microtomía a fin de minimizar la contaminación con residuos de parafina.

Procedimiento

1. Desparafinización
   1. Transfiera los cortes FFPE a tubos de microcentrífuga de baja adsorción.
   2. Añada 1 mL de xileno y agite brevemente en vórtex.
   3. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   4. Centrifugue a 14.000 × g durante 2 minutos; deseche el sobrenadante.
   5. Repita el lavado con xileno una vez más (pasos 2–4).
   6. Lave el sedimento con 1 mL de etanol al 96%, agite en vórtex y, a continuación, centrifugue a 14.000 × g durante 2 minutos. Deseche el sobrenadante.
   7. Repita el lavado con etanol una vez más (un total de 2 lavados con etanol).
   8. Deje secar el sedimento al aire durante 10 minutos a temperatura ambiente con las tapas abiertas para evaporar el etanol residual.
2. Extracción de proteínas y sonicación
   1. Añada 200 µL de tampón de lisis a cada sedimento seco.

      Nota: aunque el sonicador admite hasta 1 mL, 200 µL es el volumen óptimo para el procesamiento posterior.

   2. Mezcle mediante agitación en vórtex o pipeteo suave.
3. Primera incubación térmica
   1. Incube los tubos a 95 °C durante 30 min, con agitación a 400 rpm, utilizando un termomezclador o un bloque térmico.
   2. Deje enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Primera sonicación con el VialTweeter
   1. Coloque los tubos en el VialTweeter.
   2. Configure el VialTweeter UP200St con los valores indicados a continuación y realice la sonicación.
Ajustes del sonicador
• Ajuste la amplitud (A) al 100%
• Ajuste el modo de pulsación (C) al 100%
• Temporizador de periodo: activado
• Tiempo de encendido: 60s
• Tiempo de apagado: 30s
• Valor límite: 15 min (corresponde a 10 ciclos)
(Nota de cálculo: (60 s de encendido + 30 s de apagado) × 10 ciclos = 900 s = 15 min)
5. Segunda incubación térmica
   Retire los tubos e incúbelos de nuevo a 95 °C durante 15 min, a 400 rpm.
6. Segunda sonicación
   Repita la sonicación con el VialTweeter utilizando los mismos ajustes (indicados anteriormente) durante otros 10 ciclos (15 min en total).
7. Clarificación del lisado
   1. Centrifugue las muestras a 13.000 × g durante 10 min a 23 °C (temperatura ambiente).
   2. Recoja cuidadosamente el sobrenadante en un tubo Eppendorf Safe-lock nuevo de 2,0 mL. Evite alterar el sedimento.
8. Procesamiento posterior
   El lisado ya está listo para la limpieza mediante SP3 y la digestión enzimática.

Notas y buenas prácticas

1. El riesgo de sobrecalentamiento durante la sonicación se reduce mediante ciclos programados de encendido/apagado.
2. Evite la agitación en vórtex después de la sonicación para prevenir la agregación de proteínas.

Eliminación de residuos y seguridad

La siguiente tabla ofrece una orientación sobre la capacidad aproximada de procesamiento de nuestros sonicadores ultrasónicos de laboratorio: