Preparación de muestras FFPE de alto rendimiento: Extracción de proteínas y cizallamiento de ácidos nucleicos
Con el ultrasonicador de alto rendimiento UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics aborda los retos de la fijación en formol y la preparación de tejidos embebidos en parafina (FFPE). Descubra cómo la ultrasonicación procesa muestras FFPE en grandes cantidades para la desparafinización FFPE, la lisis tisular, la homogeneización, la extracción de proteínas y el cizallamiento de ADN/ARN. Aproveche las ventajas de la preparación ultrasónica de tejidos FFPE – Procesamiento de grandes cantidades de muestras en placas multipocillo Obtenga muestras de alta calidad y consiga un elevado número de muestras para obtener resultados de investigación fiables. Y por último, ¡ahorre tiempo y dinero!
La sonicación de alto rendimiento facilita la preparación de muestras FFPE
La fijación en formol e inclusión en parafina (FFPE) es el método más común para conservar y archivar tejidos sólidos. La extracción de biomoléculas a partir de muestras de tejidos FFPE suele plantear importantes retos debido a la calidad de las muestras almacenadas. Estas muestras, que constituyen un activo inestimable en biología molecular e investigación clínica, proporcionan una rica fuente de información biológica para estudios retrospectivos y validación de biomarcadores de diagnóstico. Sin embargo, el proceso de fijación en formol e incrustación en parafina, aunque preserva la arquitectura y morfología de los tejidos, complica la extracción de ácidos nucleicos y proteínas de alta calidad. La formalina induce la reticulación de los ácidos nucleicos y las proteínas, lo que provoca la fragmentación molecular y modificaciones químicas. Descubra cómo el ultrasonicador de alto rendimiento UIP400MTP supera los retos de la preparación de muestras FFPE.
Ultrasonidos para la preparación eficaz de muestras FFPE
- Flujo de trabajo fácil de usar: Procesos simplificados y fáciles de usar.
- Deparafinización, extracción de proteínas, cizallamiento de ADN/ARN
- Procesamiento rápido de alto rendimiento: Manipulación eficiente de placas de múltiples pocillos.
- Desparafinización eficaz: Mejor solubilización de las proteínas.
- Disolventes no tóxicos: Evita el uso de disolventes orgánicos nocivos como el xileno.
UIP400MTP sonicador de alto rendimiento para el procesamiento de alto rendimiento de muestras FFPE en placas multipocillo
Avances en las técnicas de extracción de proteínas a partir de tejidos FFPE
Hielscher Ultrasonics aborda los retos de la preparación de muestras FFPE de alto rendimiento. La sonicación emplea ondas ultrasónicas para generar vibraciones mecánicas y cavitación focalizada, alterando eficazmente las estructuras celulares y mejorando la solubilización de biomoléculas. Esta técnica ha ganado popularidad por su capacidad para aumentar la eficiencia y el rendimiento de la extracción de ácidos nucleicos y proteínas de tejidos FFPE, así como el cizallamiento de ADN y ARN para la preparación de bibliotecas. Es muy importante destacar que la ultrasonicación con el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP mantiene la integridad de estas biomoléculas para las aplicaciones posteriores.
Cizallamiento de ácidos nucleicos mediante ultrasonidos de alto rendimiento
El ultrasonicador de múltiples pocillos UIP400MTP para el uso en entornos de alto rendimiento lleva la preparación de muestras FFPE a un nuevo nivel. Este método de sonicación de múltiples pocillos proporciona una solución eficaz y fiable para el procesamiento simultáneo de múltiples muestras. Facilita la extracción rápida y reproducible de ADN, ARN y proteínas, que son fundamentales para diversas técnicas analíticas, como la secuenciación de nueva generación (NGS), la PCR cuantitativa y los análisis proteómicos. La optimización de los parámetros de sonicación, como la amplitud, la duración y la temperatura, mejora aún más la calidad y la cantidad de las biomoléculas extraídas.
El sonicador UIP400MTP para placas multipocillo ofrece ventajas significativas para la fragmentación y cizallamiento de ADN y ARN a partir de tejido FFPE. Una de las características más destacadas de este sistema es su capacidad para lograr tamaños de fragmento estrechos de ADN y ARN, proporcionando una sintonización precisa de la intensidad de sonicación para obtener fragmentos cortos de 150-200 pares de bases (pb) o fragmentos más largos de 15-20 pares de kilobases (kbp). Esta versatilidad hace que el UIP400MTP sea indispensable tanto para aplicaciones de secuenciación de lectura corta como de lectura larga, garantizando resultados de alta calidad para la secuenciación de próxima generación (NGS) y la secuenciación del genoma completo (WGS). Su control preciso del tamaño de los fragmentos es crucial para los investigadores de todos los campos de la genómica, ya que permite preparar las muestras según las especificaciones.
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Descubra el sonicador de placas multipocillo UIP400MTP para una recuperación eficaz de biomoléculas a partir de muestras FFPE, manteniendo la integridad de los ácidos nucleicos y proteínas extraídos y garantizando la reproducibilidad de los resultados. Esta tecnología se integra perfectamente con otros flujos de trabajo preparativos y analíticos, agilizando y mejorando las investigaciones moleculares que utilizan archivos de tejidos FFPE.
Fijadores y sus efectos
La fijación es un paso crucial en la preparación de muestras que preserva las estructuras celulares, detiene las reacciones bioquímicas y evita la degradación. Se emplean diversos fijadores en función de los requisitos experimentales específicos. Los dos fijadores más comunes son el formaldehído y el paraformaldehído, que reticulan las proteínas y los ácidos nucleicos, preservando la morfología y la antigenicidad de las células y los tejidos. Otros fijadores, como el etanol, el metanol y el glutaraldehído, se utilizan para aplicaciones específicas.
Los fijadores de formaldehído y paraformaldehído forman puentes de metileno entre los grupos amino, lo que provoca la reticulación de las proteínas. Este proceso inmoviliza eficazmente los componentes celulares, preservando su integridad durante los pasos posteriores del análisis. Los efectos de estos fijadores pueden verse influidos por factores como la concentración, el pH y la temperatura, y la optimización de estos parámetros es crucial para garantizar la conservación óptima de las estructuras celulares.
Ventajas de la preparación ultrasónica de FFPE
La ultrasonicación es una potente técnica de disrupción de células y tejidos fijados que supera a las técnicas convencionales. Ofrece varias ventajas notables sobre los métodos de lisis tradicionales:
- Rapidez y eficacia: La lisis ultrasónica proporciona una rápida disrupción de células y tejidos, reduciendo significativamente el tiempo de procesamiento en comparación con los métodos de lisis mecánica o química. Las ondas sonoras de alta frecuencia generadas por la sonda ultrasónica crean fuerzas mecánicas de cizallamiento, provocando la disrupción de las estructuras celulares fijadas. Esta disrupción rápida y eficaz permite a los investigadores procesar grandes volúmenes de muestras en poco tiempo.
- Suave y ajustable: La lisis ultrasónica ofrece un mecanismo de disrupción suave que minimiza el daño a biomoléculas sensibles como proteínas, ácidos nucleicos y enzimas. A diferencia de los métodos mecánicos que generan calor excesivo o fuerzas de cizallamiento, la lisis ultrasónica utiliza la cavitación controlada para disgregar las células preservando la integridad y funcionalidad de los componentes intracelulares.
- Versatilidad: La lisis ultrasónica puede aplicarse a diversos fijadores, lo que permite a los investigadores trabajar con una amplia gama de muestras fijadas. Tanto si se utiliza formaldehído, paraformaldehído o fijadores alternativos, la lisis ultrasónica proporciona una disrupción eficaz y constante, garantizando una recuperación óptima de los componentes celulares.
- Alto rendimiento y calidad: La lisis ultrasónica facilita un alto rendimiento de los componentes celulares intactos gracias a su capacidad para disgregar uniformemente las células y los tejidos fijados. Esto permite que las aplicaciones posteriores, como el análisis de proteínas, la extracción de ácidos nucleicos y los ensayos enzimáticos, produzcan resultados fiables y reproducibles.
- Compatibilidad de automatización: La lisis ultrasónica puede integrarse fácilmente en sistemas automatizados, lo que permite un procesamiento de muestras de alto rendimiento. Esta compatibilidad permite a los investigadores agilizar su flujo de trabajo y aumentar la productividad, sobre todo en estudios a gran escala.
Sonicador de placas de 96 pocillos UIP400MTP para la sonicación de placas microtiter y multipocillo
La lisis ultrasónica ha revolucionado la disrupción de células y tejidos fijados, ofreciendo numerosas ventajas sobre los métodos de lisis tradicionales. Su velocidad, eficacia, selectividad, versatilidad, alto rendimiento y compatibilidad con la automatización la convierten en una herramienta indispensable en la investigación en biología molecular y biotecnología. Ofreciendo sonicadores sin contacto así como sonicadores tipo sonda, Hielscher Ultrasonics ofrece el homogeneizador ultrasónico más adecuado para su aplicación en ciencias de la vida. Tanto si desea procesar muestras individuales, muestras múltiples o un número muy elevado de muestras simultáneamente, le ofreceremos el mejor sonicador que se adapte a sus requisitos de investigación y diagnóstico.
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Diseño, fabricación y consultoría – Calidad Made in Germany
Los ultrasonidos de Hielscher son conocidos por sus elevados estándares de calidad y diseño. Su robustez y fácil manejo permiten una integración sin problemas de nuestros ultrasonidos en las instalaciones industriales. Los ultrasonidos de Hielscher soportan sin problemas las condiciones más duras y los entornos más exigentes.
Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO y pone especial énfasis en los ultrasonidos de alto rendimiento con tecnología punta y facilidad de uso. Por supuesto, los ultrasonidos de Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.
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Ultrasonidos UIP400MTP: Preparación de muestras FFPE de alto rendimiento en Multi-Well-Plate
Preguntas más frecuentes
A continuación, respondemos a las preguntas más frecuentes relacionadas con la preparación de tejidos FFPE y la ultrasonicación de muestras FFPE.
¿Cómo se prepara el tejido FFPE?
Pasos para la preparación de tejidos FFPE: La manipulación y el procesamiento meticulosos del tejido fresco son fundamentales para generar muestras FFPE de alta calidad. Garantizar la conservación de la arquitectura celular, los ácidos nucleicos y las proteínas es esencial para realizar análisis posteriores precisos. Cada paso, desde la recogida hasta la incrustación, requiere precisión para mantener la integridad de la muestra para diversos análisis, como el examen histológico, la inmunohistoquímica y los estudios moleculares. Si se ejecuta correctamente, este proceso de fijación e incrustación garantiza que el tejido conservado refleje con exactitud el estado in vivo, lo que permite obtener resultados fiables en el diagnóstico y la investigación.
Le guiamos a través de los 6 pasos principales del proceso de incrustación de muestras de tejido FFPE.
- Colección de tejidos
Tanto las biopsias de mamíferos vivos como los cultivos de tejidos son fuentes viables para obtener tejido fresco para la preparación de muestras FFPE.
Es importante utilizar una técnica aséptica: Utilice instrumentos y guantes estériles para evitar la contaminación. Lo ideal es recoger los tejidos en un entorno estéril, como una sala quirúrgica o una campana de flujo laminar.
Dado que la muestra es muy frágil, es esencial manipularla con delicadeza: Reduzca al mínimo los retrasos en el procesamiento y comience inmediatamente el procesamiento posterior del tejido tras la escisión. Esto es crucial para evitar la autolisis y la degradación. Mantenga el tejido a temperatura ambiente; evite la congelación, ya que puede provocar la formación de cristales de hielo y dañar el tejido. - Fijación de tejidos
En primer lugar, el tejido se trata con una solución fijadora: Utilice formalina tamponada neutra (NBF) al 10%, que equivale a un 4% de formaldehído en agua, tamponada a un pH neutro.
Sumergir el tejido completamente en formol. Asegúrese de que la proporción de volumen de fijador/tejido sea de al menos 10:1. El tiempo de fijación suele oscilar entre 6 y 24 horas, según el tipo y el tamaño del tejido. Es importante que el fijador pueda penetrar completamente en el tejido. Sin embargo, un exceso de fijación puede dar lugar a una reticulación que complique la recuperación de antígenos, mientras que una fijación insuficiente puede dar lugar a una mala conservación del tejido. - Recorte de tejidos
En segundo lugar, recorte el tejido a un grosor de unos 3-5 mm para permitir una penetración adecuada del fijador. Asegúrese de orientar correctamente el tejido para captar las estructuras histológicas pertinentes. Esto facilita el proceso de extracción cuando el tejido se utiliza posteriormente para el análisis. - Procesamiento de la muestra fijada
Ahora hay que deshidratar el tejido fijado: Tras la fijación, es necesario deshidratar el tejido para garantizar una penetración completa de la parafina. Pase el tejido por una serie graduada de etanol (70%, 80%, 90% y 100%) para eliminar el agua.
Aclarado con xileno: La parafina es insoluble en agua, pero soluble en xileno. Por lo tanto, el agua del tejido debe sustituirse por xileno. Sin embargo, el propio xileno es insoluble en agua pero soluble en alcohol, por lo que es necesario un paso intermedio en el que primero se sustituya el agua por alcohol.Sumerja el tejido en xileno o en un sustituto del xileno para eliminar el etanol y preparar el tejido para la infiltración de parafina.
Infiltración mediante parafina: Incrustar el tejido en parafina fundida, asegurando una infiltración completa. Este paso suele implicar varios cambios de parafina para garantizar una impregnación completa. - Incrustación del tejido
En este paso, el tejido se moldea en un bloque de tejido: Coloque el tejido en un molde con la orientación deseada y vierta sobre él parafina fundida. Deje que la parafina se solidifique enfriándose a temperatura ambiente o en una placa fría. - Seccionamiento y montaje
Microtomía: Para cortar el tejido incrustado, se utiliza un micrótomo para cortar secciones finas (normalmente de 4-5 micrómetros) del bloque de parafina. A continuación se monta la muestra, colocando las secciones en portaobjetos de vidrio para su posterior tinción y análisis microscópico.
Por último, compruebe la calidad de la histología: Evalúe las primeras secciones al microscopio para garantizar una fijación y un procesamiento adecuados. Ajuste los protocolos según sea necesario en función del tipo de tejido y la calidad observada.
Los tejidos FFPE pueden utilizarse para recuperar ARN, ADN y proteínas, así como para descubrir signos de cáncer u otras enfermedades. Pueden almacenarse durante años y son una parte esencial de la forma en que los investigadores y los médicos aprovechan las muestras de tejido para el diagnóstico y la investigación.
¿Cuáles son los problemas y retos habituales con los tejidos FFPE?
Las muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) se utilizan ampliamente en investigación y diagnóstico, pero presentan varios retos y problemas comunes:
- Degradación de biomoléculas: Una fijación prolongada puede provocar la degradación del ADN, el ARN y las proteínas, lo que dificulta la extracción de ácidos nucleicos o proteínas de alta calidad para aplicaciones posteriores. Una fijación correcta (evitando la fijación insuficiente o excesiva) es esencial para la conservación de los tejidos.
- Enmascaramiento de antígenos: El proceso de fijación puede enmascarar sitios antigénicos, reduciendo la eficacia de la unión del anticuerpo en inmunohistoquímica y otros ensayos inmunológicos. Esto requiere a menudo la recuperación del antígeno, un procedimiento mediante el cual se invierte el enmascaramiento de un epítopo y se restablece la unión epítopo-anticuerpo. Sin embargo, no siempre se recupera toda la antigenicidad.
- Calidad de fijación variable: Las diferencias en los tiempos y las condiciones de fijación pueden dar lugar a una calidad desigual de las muestras, lo que afecta a la reproducibilidad y la comparabilidad de los resultados. Utilice protocolos de fijación fiables y evite la fijación insuficiente o excesiva.
- Daño y fragmentación del ADN: La fijación con formalina de las muestras FFPE puede causar varios tipos de daños en el ADN, como la desaminación de la citosina (mutaciones de C a T), daños oxidativos (por ejemplo, 8-oxo-guanina que da lugar a mutaciones de G a T), así como alteraciones físicas como muescas, huecos y sitios abásicos que dificultan la actividad de la ADN polimerasa. El proceso de fijación con formol puede provocar la fragmentación del ADN, lo que complica los análisis genéticos y genómicos, como la PCR y la secuenciación.
- Calidad del ARN: El ARN extraído de tejidos FFPE suele estar fragmentado y modificado químicamente, lo que dificulta la realización de análisis transcriptómicos de alta calidad.
- Modificaciones de las proteínas: La formalina puede inducir modificaciones químicas en las proteínas, afectando a su estructura y función, lo que puede interferir con los análisis proteómicos.
- Artefactos de procesamiento de muestras: Durante el proceso de incrustación y seccionamiento, la tensión mecánica y el calor pueden introducir artefactos y causar más daños al tejido.
- Variabilidad entre lotes: Las variaciones en los protocolos de fijación e incrustación entre distintos lotes pueden dar lugar a una variabilidad significativa de los resultados, lo que complica las comparaciones entre estudios.
- Problemas de almacenamiento: El almacenamiento a largo plazo de bloques FFPE puede provocar una degradación adicional y la pérdida de la integridad de los ácidos nucleicos con el paso del tiempo, lo que afecta a la viabilidad de las muestras de archivo para estudios retrospectivos.
Reticulación: La fijación con formalina provoca la reticulación de proteínas y ácidos nucleicos, lo que puede dificultar el análisis molecular y afectar a la precisión de la inmunohistoquímica y otros ensayos.
El uso de protocolos optimizados, la manipulación cuidadosa de las muestras y la aplicación de técnicas avanzadas contribuyen a mejorar la calidad y la fiabilidad de los datos obtenidos a partir de tejidos FFPE.
¿Cuál es la diferencia entre FFPE y tejido congelado?
El tejido FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) se conserva utilizando formalina para fijar el tejido y después se incrusta en parafina, lo que permite su almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente manteniendo la morfología del tejido. En cambio, los tejidos congelados se conservan rápidamente mediante congelación, que mantiene mejor la integridad de los ácidos nucleicos y las proteínas, pero requiere un almacenamiento a temperaturas muy bajas.
¿Qué productos químicos se utilizan para la incrustación de FFPE?
Los productos químicos utilizados para la incrustación FFPE normalmente incluyen formalina para la fijación y cera de parafina para la incrustación. Para la incrustación FFPE, los tejidos se fijan normalmente utilizando formalina tamponada neutra (FA) al 10% (v/v) o una solución de formaldehído (PFA) al 4% (p/v) recién preparada a partir de polvo de paraformaldehído. La formalina, que es una solución de formaldehído en agua, se tampona a un pH neutro para preservar la morfología del tejido y evitar una reticulación excesiva. La solución a base de paraformaldehído también proporciona una fijación eficaz mediante la reticulación de las proteínas, estabilizando así la estructura del tejido para su posterior incrustación en parafina. Estos productos químicos son esenciales para mantener la integridad y la morfología de los tejidos durante el proceso de fijación e incrustación.
¿Cómo se elimina la parafina de las muestras FFPE?
Para eliminar la parafina de las muestras FFPE, las secciones de tejido suelen someterse a una serie de lavados con xileno, seguidos de rehidratación mediante una serie graduada de alcoholes y, por último, agua. Dado que el xileno es muy tóxico y plantea riesgos para la salud como problemas respiratorios, irritación cutánea y posibles efectos a largo plazo con una exposición repetida, la eliminación ultrasónica de la parafina se perfila como una alternativa prometedora en muchos laboratorios. Este método utiliza ondas ultrasónicas intensas para eliminar la parafina de forma eficaz y segura sin necesidad de disolventes tóxicos como el xileno, reduciendo así el riesgo para el personal de laboratorio y creando un entorno de trabajo más seguro.
¿Cuánto tiempo debo fijar mis tejidos para obtener una buena calidad de las muestras FFPE?
Las recomendaciones generales sobre la duración de la fijación suelen sugerir fijar las muestras de tejido en formol entre 24 y 48 horas. Este tiempo suele ser suficiente para preservar la morfología de los tejidos y las estructuras celulares, al tiempo que se minimiza el exceso de fijación, que puede provocar una reticulación excesiva y la degradación de los ácidos nucleicos y las proteínas. Sin embargo, el tiempo de fijación óptimo puede variar en función del tamaño y el tipo de tejido, ya que las muestras más pequeñas o delicadas requieren tiempos de fijación más cortos. Es crucial equilibrar una fijación adecuada para prevenir la autolisis y la degradación del tejido, evitando al mismo tiempo una fijación prolongada que podría complicar los análisis moleculares posteriores.