Preparación de muestras FFPE de alto rendimiento: extracción de proteínas y cizallamiento de ácidos nucleicos
Con el ultrasonicador de alto rendimiento UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics aborda los retos de la preparación de tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE). ¡Descubra cómo la ultrasonicación permite procesar grandes cantidades de muestras FFPE para la desparafinización, la lisis tisular, la homogeneización, la extracción de proteínas y el cizallamiento de ADN/ARN! ¡Aproveche la preparación ultrasónica de tejidos FFPE para procesar grandes cantidades de muestras en placas multipocillo! ¡Obtenga muestras de alta calidad y procese grandes cantidades de muestras para lograr resultados de investigación fiables! Y, por último, pero no menos importante, ¡ahorre tiempo y dinero!
Preparación de muestras FFPE facilitada por la sonicación de alto rendimiento
La fijación en formalina y la inclusión en parafina (FFPE) es el método más habitual para conservar y archivar tejidos sólidos. La extracción de biomoléculas de muestras de tejido FFPE suele presentar retos importantes debido a la calidad de las muestras almacenadas. Estas muestras, que constituyen recursos de incalculable valor en biología molecular e investigación clínica, ofrecen una abundante fuente de información biológica para estudios retrospectivos y la validación de biomarcadores diagnósticos. Sin embargo, aunque el proceso de fijación en formalina e inclusión en parafina conserva la arquitectura y la morfología del tejido, dificulta la extracción de ácidos nucleicos y proteínas de alta calidad. La formalina induce el entrecruzamiento de ácidos nucleicos y proteínas, lo que provoca fragmentación molecular y modificaciones químicas. ¡Descubra cómo el ultrasonicador de alto rendimiento UIP400MTP supera los retos de la preparación de muestras FFPE!
Ultrasonicador para una preparación eficiente de muestras FFPE
- Flujo de trabajo fácil de utilizar: procesos simplificados y fáciles de realizar.
- Desparafinización, extracción de proteínas, cizallamiento de ADN / ARN
- Procesamiento rápido de alto rendimiento: manejo eficiente de placas multipocillo.
- Desparafinización eficaz: mejora de la solubilización de proteínas.
- Disolventes no tóxicos: evita el uso de disolventes orgánicos nocivos como el xileno.
Sonicador de alto rendimiento UIP400MTP para el procesamiento de muestras FFPE de alto rendimiento en placas multipocillo
Avances en las técnicas de extracción de proteínas de tejidos FFPE
Hielscher Ultrasonics aborda los retos de la preparación de muestras FFPE de alto rendimiento. La sonicación utiliza ondas ultrasónicas para generar vibraciones mecánicas y cavitación focalizada, lo que rompe eficazmente las estructuras celulares y mejora la solubilización de biomoléculas. Esta técnica ha ganado popularidad por su capacidad para aumentar la eficiencia y el rendimiento de la extracción de ácidos nucleicos y proteínas de tejidos FFPE, así como del cizallamiento de ADN y ARN para la preparación de bibliotecas. Es muy importante destacar que la ultrasonicación con el sonicador para placas multipocillo UIP400MTP mantiene la integridad de estas biomoléculas para aplicaciones posteriores.
Cizallamiento de ácidos nucleicos mediante ultrasonicación de alto rendimiento
El ultrasonicador para placas multipocillo UIP400MTP, diseñado para su uso en entornos de alto rendimiento, lleva la preparación de muestras FFPE a un nuevo nivel. Este método de sonicación de placas multipocillo ofrece una solución eficiente y fiable para el procesamiento simultáneo de múltiples muestras. Facilita la extracción rápida y reproducible de ADN, ARN y proteínas, que son esenciales para diversas técnicas analíticas, como la secuenciación de nueva generación (NGS), la PCR cuantitativa y los análisis proteómicos. La optimización de parámetros de sonicación como la amplitud, la duración y la temperatura mejora aún más la calidad y la cantidad de las biomoléculas extraídas.
El sonicador para placas multipocillo UIP400MTP ofrece ventajas significativas para la fragmentación y el cizallamiento de ADN y ARN de tejidos FFPE. Una de las características más destacadas de este sistema es su capacidad para obtener fragmentos de ADN y ARN con una distribución estrecha de tamaños, gracias al ajuste preciso de la intensidad de sonicación para obtener fragmentos cortos de 150-200 pares de bases (bp) o fragmentos más largos de 15-20 kilopares de bases (kbp). Esta versatilidad convierte al UIP400MTP en una herramienta indispensable tanto para aplicaciones de secuenciación de lecturas cortas como de lecturas largas, y garantiza resultados de alta calidad en la secuenciación de nueva generación (NGS) y la secuenciación del genoma completo (WGS). Su control preciso del tamaño de los fragmentos es crucial para investigadores de todos los campos de la genómica, ya que permite preparar las muestras conforme a las especificaciones.
Contacte con nosotros para obtener soluciones avanzadas para tejidos FFPE
Descubra el sonicador para placas multipocillo UIP400MTP para la recuperación eficiente de biomoléculas de muestras FFPE, que mantiene la integridad de los ácidos nucleicos y las proteínas extraídos y garantiza la reproducibilidad de los resultados. Esta tecnología se integra fácilmente con otros flujos de trabajo de preparación y análisis, agilizando y mejorando las investigaciones moleculares que utilizan archivos de tejidos FFPE.
Fijadores y sus efectos
La fijación es una etapa crucial de la preparación de muestras que conserva las estructuras celulares, detiene las reacciones bioquímicas y evita la degradación. Se utilizan diversos fijadores según los requisitos experimentales específicos. Los dos fijadores más habituales son el formaldehído y el paraformaldehído, que entrecruzan proteínas y ácidos nucleicos, preservando la morfología y la antigenicidad de las células y los tejidos. Otros fijadores, como el etanol, el metanol y el glutaraldehído, se utilizan para aplicaciones específicas.
Los fijadores de formaldehído y paraformaldehído forman puentes de metileno entre grupos amino, lo que provoca el entrecruzamiento de proteínas. Este proceso inmoviliza eficazmente los componentes celulares y conserva su integridad durante las etapas posteriores de análisis. Factores como la concentración, el pH y la temperatura pueden influir en los efectos de estos fijadores, y optimizar estos parámetros es crucial para garantizar la conservación óptima de las estructuras celulares.
Ventajas de la preparación ultrasónica de muestras FFPE
La ultrasonicación es una potente técnica para romper células y tejidos fijados que supera a las técnicas convencionales. Ofrece varias ventajas destacadas frente a los métodos tradicionales de lisis:
- Rapidez y eficiencia: La lisis ultrasónica proporciona una ruptura rápida de células y tejidos, lo que reduce significativamente el tiempo de procesamiento en comparación con los métodos de lisis mecánica o química. Las ondas sonoras de alta frecuencia generadas por la sonda ultrasónica crean fuerzas mecánicas de cizallamiento que provocan la ruptura de las estructuras celulares fijadas. Esta ruptura rápida y eficiente permite a los investigadores procesar grandes volúmenes de muestras en poco tiempo.
- Suave y ajustable: La lisis ultrasónica ofrece un mecanismo de ruptura suave que minimiza el daño a biomoléculas sensibles como proteínas, ácidos nucleicos y enzimas. A diferencia de los métodos mecánicos que generan calor o fuerzas de cizallamiento excesivos, la lisis ultrasónica utiliza cavitación controlada para romper las células y, al mismo tiempo, conservar la integridad y la funcionalidad de los componentes intracelulares.
- Versatilidad: La lisis ultrasónica puede aplicarse con diversos fijadores, lo que permite a los investigadores trabajar con una amplia variedad de muestras fijadas. Tanto si se utiliza formaldehído o paraformaldehído como otros fijadores, la lisis ultrasónica proporciona de forma constante una ruptura eficiente y garantiza una recuperación óptima de los componentes celulares.
- Alto rendimiento y calidad: La lisis ultrasónica facilita la obtención de un alto rendimiento de componentes celulares intactos gracias a su capacidad para romper uniformemente células y tejidos fijados. Esto permite que las aplicaciones posteriores, como el análisis de proteínas, la extracción de ácidos nucleicos y los ensayos enzimáticos, produzcan resultados fiables y reproducibles.
- Compatibilidad con la automatización: La lisis ultrasónica puede integrarse fácilmente en sistemas automatizados, lo que permite el procesamiento de muestras de alto rendimiento. Esta compatibilidad permite a los investigadores agilizar su flujo de trabajo y aumentar la productividad, especialmente en estudios a gran escala.
Sonicador para placas de 96 pocillos UIP400MTP para la sonicación de placas de microtitulación y multipocillo
La lisis ultrasónica ha revolucionado la ruptura de células y tejidos fijados, ofreciendo numerosas ventajas frente a los métodos tradicionales de lisis. Su rapidez, eficiencia, selectividad, versatilidad, alto rendimiento y compatibilidad con la automatización la convierten en una herramienta indispensable para la investigación en biología molecular y biotecnología. Con su gama de sonicadores sin contacto y sonicadores de sonda, Hielscher Ultrasonics ofrece el homogeneizador ultrasónico más adecuado para su aplicación en ciencias de la vida. Tanto si desea procesar muestras individuales como múltiples muestras o cantidades muy elevadas de muestras simultáneamente, le ofreceremos el sonicador que mejor se adapte a sus requisitos de investigación y diagnóstico.
¡Obtenga más información sobre los sonicadores sin contacto de Hielscher para la preparación de múltiples muestras y la preparación de muestras de alto rendimiento!
- inversión única
- utilice sus propios consumibles
- sin costes recurrentes por accesorios y consumibles exclusivos del fabricante
- alto rendimiento
- control de precisión
- tecnología de vanguardia
- fiabilidad y robustez
- control del proceso ajustable y preciso
- calidad industrial: puede funcionar de forma continua 24/7
- fácil y seguro de utilizar
- mantenimiento reducido
¡Obtenga más información sobre las aplicaciones de los sonicadores en ciencias de la vida!
Sonicador de placas UIP400MTP para cualquier placa de 96 pocillos, placa de microtitulación y placa multipocillo.
Diseño, fabricación y asesoramiento – Calidad fabricada en Alemania
Los ultrasonicadores Hielscher son conocidos por sus máximos estándares de calidad y diseño. La robustez y la facilidad de uso permiten integrar nuestros ultrasonicadores sin dificultades en instalaciones industriales. Los ultrasonicadores Hielscher afrontan fácilmente condiciones adversas y entornos exigentes.
Hielscher Ultrasonics es una empresa con certificación ISO y presta especial atención a los ultrasonicadores de alto rendimiento que incorporan tecnología de vanguardia y facilidad de uso. Por supuesto, los ultrasonicadores Hielscher cumplen la normativa CE y los requisitos de UL, CSA y RoHs.
¡Contacte con nosotros! / ¡Consúltenos!
Ultrasonicador UIP400MTP: Preparación de muestras FFPE de alto rendimiento en placas multipocillo
Preguntas frecuentes
A continuación, respondemos a preguntas frecuentes relacionadas con la preparación de tejidos FFPE y la ultrasonicación de muestras FFPE.
¿Cómo se prepara el tejido FFPE?
Etapas de la preparación de tejidos FFPE: la manipulación y el procesamiento meticulosos del tejido fresco son fundamentales para generar muestras FFPE de alta calidad. Garantizar la conservación de la arquitectura celular, los ácidos nucleicos y las proteínas es esencial para realizar análisis posteriores precisos. Cada etapa –desde la obtención hasta la inclusión– requiere precisión para mantener la integridad de la muestra en diversos análisis, como el examen histológico, la inmunohistoquímica y los estudios moleculares. Si se realiza correctamente, este proceso de fijación e inclusión garantiza que el tejido conservado refleje fielmente el estado in vivo, lo que permite obtener resultados fiables en diagnóstico e investigación.
Le guiamos por las 6 etapas principales del proceso de inclusión de muestras de tejido FFPE.
- Obtención del tejido
Tanto las biopsias de mamíferos vivos como los cultivos de tejidos son fuentes viables para obtener tejido fresco destinado a la preparación de muestras FFPE.
Es importante utilizar una técnica aséptica: utilice instrumentos y guantes estériles para evitar la contaminación. Lo ideal es obtener los tejidos en un entorno estéril, como un quirófano o una cabina de flujo laminar.
Dado que la muestra es muy frágil, es esencial manipularla con cuidado: minimice los retrasos en el procesamiento e inicie inmediatamente el procesamiento posterior del tejido tras la escisión. Esto es crucial para evitar la autólisis y la degradación. Mantenga el tejido a temperatura ambiente; evite la congelación, ya que puede provocar la formación de cristales de hielo y daños en el tejido. - Fijación del tejido
En primer lugar, el tejido se trata con una solución fijadora: utilice formalina tamponada neutra (NBF) al 10%, que equivale a formaldehído al 4% en agua, tamponado a un pH neutro.
Sumerja completamente el tejido en formalina. Asegure una relación de volumen fijador:tejido de al menos 10:1. El tiempo de fijación suele oscilar entre 6 y 24 horas, dependiendo del tipo y el tamaño del tejido. Es importante que el fijador pueda penetrar completamente en el tejido. Sin embargo, una fijación excesiva puede provocar un entrecruzamiento que dificulte la recuperación antigénica, mientras que una fijación insuficiente puede dar lugar a una conservación deficiente del tejido. - Recorte del tejido
En segundo lugar, recorte el tejido hasta obtener un grosor de aproximadamente 3-5 mm para permitir una penetración adecuada del fijador. Asegure una orientación correcta del tejido para incluir las estructuras histológicas pertinentes. Esto facilita el proceso de extracción cuando el tejido se utiliza posteriormente para el análisis. - Procesamiento de la muestra fijada
Ahora debe deshidratarse el tejido fijado: tras la fijación, el tejido debe deshidratarse para garantizar una penetración completa de la parafina. Pase el tejido por una serie de concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 90% y 100%) para eliminar el agua.
Aclaramiento con xileno: la parafina es insoluble en agua, pero soluble en xileno. Por tanto, el agua del tejido debe sustituirse por xileno. Sin embargo, el propio xileno es insoluble en agua, pero soluble en alcohol, por lo que se requiere una etapa intermedia en la que primero se sustituye el agua por alcohol. Sumerja el tejido en xileno o en un sustituto del xileno para eliminar el etanol y preparar el tejido para la infiltración de parafina.
Infiltración con parafina: incluya el tejido en parafina fundida, asegurando una infiltración completa. Esta etapa suele implicar varios cambios de parafina para garantizar una impregnación completa. - Inclusión del tejido
En esta etapa, se moldea el tejido para formar un bloque: coloque el tejido en un molde con la orientación deseada y vierta parafina fundida sobre él. Deje que la parafina se solidifique al enfriarse a temperatura ambiente o sobre una placa fría. - Corte y montaje
Microtomía: para seccionar el tejido incluido, utilice un micrótomo para obtener cortes finos (normalmente de 4-5 micrómetros) del bloque de parafina. A continuación, monte la muestra colocando los cortes en portaobjetos de vidrio para su posterior tinción y análisis microscópico.
Por último, compruebe la calidad histológica: evalúe los primeros cortes al microscopio para asegurarse de que la fijación y el procesamiento sean adecuados. Ajuste los protocolos según sea necesario en función del tipo de tejido y de la calidad observada.
Los tejidos FFPE pueden utilizarse para recuperar ARN, ADN y proteínas, así como para detectar signos de cáncer u otras enfermedades. Pueden almacenarse durante años y constituyen un recurso esencial para que investigadores y médicos utilicen muestras de tejido en diagnóstico e investigación.
¿Cuáles son los problemas y retos habituales de los tejidos FFPE?
Las muestras de tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) se utilizan ampliamente en investigación y diagnóstico, pero presentan varios retos y problemas habituales:
- Degradación de biomoléculas: La fijación prolongada puede provocar la degradación de ADN, ARN y proteínas, lo que dificulta la extracción de ácidos nucleicos o proteínas de alta calidad para aplicaciones posteriores. Una fijación correcta (evitando tanto la fijación insuficiente como la excesiva) es esencial para conservar el tejido.
- Enmascaramiento antigénico: El proceso de fijación puede enmascarar los sitios antigénicos, lo que reduce la eficacia de la unión de los anticuerpos en la inmunohistoquímica y otros ensayos inmunológicos. Esto suele requerir una recuperación antigénica, un procedimiento mediante el cual se revierte el enmascaramiento de un epítopo y se restablece la unión entre el epítopo y el anticuerpo. Sin embargo, no siempre es posible restablecer completamente la antigenicidad.
- Calidad variable de la fijación: Las diferencias en los tiempos y las condiciones de fijación pueden dar lugar a una calidad de muestra inconsistente, lo que afecta a la reproducibilidad y la comparabilidad de los resultados. Utilice protocolos de fijación fiables y evite tanto la fijación insuficiente como la excesiva.
- Daño y fragmentación del ADN: La fijación en formalina de muestras FFPE puede causar diversos tipos de daño en el ADN, como la desaminación de citosina (mutaciones de C a T), el daño oxidativo (por ejemplo, 8-oxo-guanina que provoca mutaciones de G a T), así como alteraciones físicas, como roturas de cadena sencilla, huecos y sitios abásicos, que dificultan la actividad de la ADN polimerasa. El proceso de fijación en formalina puede provocar la fragmentación del ADN, lo que complica los análisis genéticos y genómicos, como la PCR y la secuenciación.
- Calidad del ARN: El ARN extraído de tejidos FFPE suele estar fragmentado y modificado químicamente, lo que dificulta la realización de análisis transcriptómicos de alta calidad.
- Modificaciones de las proteínas: La formalina puede inducir modificaciones químicas en las proteínas, afectando a su estructura y función, lo que puede interferir en los análisis proteómicos.
- Artefactos del procesamiento de muestras: Durante el proceso de inclusión y corte, las tensiones mecánicas y el calor pueden introducir artefactos y causar daños adicionales en el tejido.
- Variabilidad entre lotes: Las variaciones en los protocolos de fijación e inclusión entre distintos lotes pueden provocar una variabilidad significativa en los resultados, lo que dificulta las comparaciones entre estudios.
- Problemas de almacenamiento: El almacenamiento prolongado de bloques FFPE puede provocar una degradación adicional y una pérdida de integridad de los ácidos nucleicos con el tiempo, lo que afecta a la viabilidad de las muestras archivadas para estudios retrospectivos.
Entrecruzamiento: La fijación en formalina provoca el entrecruzamiento de proteínas y ácidos nucleicos, lo que puede dificultar el análisis molecular y afectar a la precisión de la inmunohistoquímica y otros ensayos.
El uso de protocolos optimizados, la manipulación cuidadosa de las muestras y la aplicación de técnicas avanzadas ayudan a mejorar la calidad y la fiabilidad de los datos obtenidos de tejidos FFPE.
¿Cuál es la diferencia entre el tejido FFPE y el tejido congelado?
El tejido FFPE (fijado en formalina e incluido en parafina) se conserva mediante su fijación con formalina y su posterior inclusión en parafina, lo que permite almacenarlo durante largos periodos a temperatura ambiente manteniendo su morfología. En cambio, el tejido congelado se conserva rápidamente mediante congelación, lo que mantiene mejor la integridad de los ácidos nucleicos y las proteínas, pero requiere almacenamiento a temperaturas muy bajas.
¿Qué sustancias químicas se utilizan para la inclusión de tejidos FFPE?
Las sustancias químicas utilizadas para la inclusión de tejidos FFPE suelen ser formalina para la fijación y parafina para la inclusión. Para la inclusión de tejidos FFPE, los tejidos suelen fijarse con formalina tamponada neutra (FA) al 10% (v/v) o con una solución de formaldehído (PFA) al 4% (w/v), recién preparada a partir de paraformaldehído en polvo. La formalina, que es una solución de formaldehído en agua, se tampona a un pH neutro para conservar la morfología del tejido y evitar un entrecruzamiento excesivo. La solución a base de paraformaldehído también proporciona una fijación eficaz mediante el entrecruzamiento de proteínas, estabilizando así la estructura del tejido para su posterior inclusión en parafina. Estas sustancias químicas son esenciales para mantener la integridad y la morfología del tejido durante el proceso de fijación e inclusión.
¿Cómo se elimina la parafina de las muestras FFPE?
Para eliminar la parafina de las muestras FFPE, los cortes de tejido suelen someterse a una serie de lavados con xileno, seguidos de una rehidratación mediante una serie de concentraciones decrecientes de alcohol y, finalmente, agua. Dado que el xileno es muy tóxico y presenta riesgos para la salud, como problemas respiratorios, irritación cutánea y posibles efectos a largo plazo por exposición repetida, la eliminación ultrasónica de parafina está surgiendo como una alternativa prometedora en muchos laboratorios. Este método utiliza ondas ultrasónicas intensas para eliminar la parafina de forma eficiente y segura sin necesidad de disolventes tóxicos como el xileno, reduciendo así el riesgo para el personal de laboratorio y creando un entorno de trabajo más seguro.
¿Cuánto tiempo debo fijar los tejidos para obtener muestras FFPE de buena calidad?
Las recomendaciones generales sobre la duración de la fijación suelen aconsejar fijar las muestras de tejido en formalina durante 24 a 48 horas. Este tiempo suele ser suficiente para conservar la morfología del tejido y las estructuras celulares, minimizando al mismo tiempo la fijación excesiva, que puede provocar un entrecruzamiento excesivo y la degradación de ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, el tiempo óptimo de fijación puede variar según el tamaño y el tipo de tejido, y las muestras más pequeñas o delicadas requieren tiempos de fijación más cortos. Es crucial lograr una fijación adecuada para evitar la autólisis y la degradación del tejido, sin prolongarla hasta el punto de dificultar los análisis moleculares posteriores.