Εφαρμογές υπερήχων στον ιό της ευλογιάς των πιθήκων
Υπερήχους είναι μια σημαντική μέθοδος επεξεργασίας για την απομόνωση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων (MPXV) από αναλυτικά δείγματα, για τον κατακερματισμό του DNA του ιού καθώς και για την κατασκευή εμβολίων ευλογιάς των πιθήκων. Για την προετοιμασία του δείγματος πριν από τη διάγνωση και την ανάλυση (PCR, ELISA κ.λπ.) υπερήχους χρησιμοποιείται για τη λύση των κυττάρων προκειμένου να απελευθερωθεί ο ιός της ευλογιάς των πιθήκων από το εσωτερικό του κυττάρου ή / και να κατακερματιστεί το DNA. Στην παραγωγή εμβολίων, οι εφαρμογές κυμαίνονται από την παρασκευή σωματιδίων ιού / DNA, την ενθυλάκωση σε φορείς φαρμάκων και τη διαμόρφωση του εμβολίου.
Παρακάτω μπορείτε να βρείτε λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την προετοιμασία δείγματος ιού υπερήχων ευλογιάς των πιθήκων καθώς και την υπερηχητικά υποβοηθούμενη παραγωγή εμβολίου MPXV.
Τι θα βρείτε σε αυτή τη σελίδα:
- Υπερήχων λύση για την εκχύλιση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων
- Υπερηχητικός κατακερματισμός του DNA του ιού της ευλογιάς των πιθήκων
- Εφαρμογές υπερήχων στην παραγωγή εμβολίων MPXV
Αυτό το σύστημα υπερήχων 2x 1kW για λειτουργία συνεχούς ροής είναι εγκατεστημένο σε εγκατάσταση παραγωγής εμβολίων.
Λύση με υπερήχους και κατακερματισμός DNA πριν από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Μια λοίμωξη από τον ιό της ευλογιάς των πιθήκων ανιχνεύεται με δοκιμή ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων (NAAT), χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο ή συμβατική πολυμεράση (PCR), για την ανίχνευση μοναδικών αλληλουχιών ιικού DNA. Το δείγμα (π.χ. από ρινοφαρυγγική ανταλλαγή ή βιοψίες δέρματος) περιέχει τον ιό στα κύτταρα.
Για ανάλυση, ο ιός πρέπει να απελευθερωθεί από τα κύτταρα και το ιικό DNA πρέπει να κατακερματιστεί για PCR.
Υπερήχων λύση:
Υπερήχων κυτταρική διαταραχή / λύση είναι μια αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδος για την απομόνωση ιών από δείγματα κυττάρων και ως εκ τούτου μια προτιμότερη τεχνική έναντι χημικών παραγόντων, όπως λυσοζύμη, πρωτεϊνάση Κ και διαφορετικά απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται εναλλακτικά για την επίτευξη κυτταρικής λύσης και απελευθέρωσης DNA.
Ωστόσο, η χρήση τέτοιων χημικών αντιδραστηρίων απαιτεί χρονοβόρα προετοιμασία δείγματος σε διάφορα στάδια πριν από την ανάλυση PCR για την πρόληψη της αναστολής της αντίδρασης PCR. Δεδομένου ότι οι αναστολείς PCR επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης, μικρές διακυμάνσεις της ποσότητας των αναστολέων που δεν απομακρύνονται μπορούν να οδηγήσουν σε μεγάλες διακυμάνσεις στην ενίσχυση του προϊόντος PCR (Diaco, 1995).
Το πλεονέκτημα της υπερήχων για λύση είναι ότι είναι επιθυμητή η πλήρης διαταραχή των κυτταρικών δομών και η απελευθέρωση του DNA χωρίς την ανάγκη για αντιδραστήρια λύσης και χρονοβόρα προετοιμασία δείγματος. (πρβλ. Fykse et al., 2003)
Υπερήχων κατακερματισμός DNA:
Ο υπερηχητικός κατακερματισμός του DNA είναι απλός και αξιόπιστος καθώς παράγει θραύσματα DNA ρυθμιζόμενα σε μήκος (ζεύγη βάσεων, bp). Χρησιμοποιώντας υπερήχους, το DNA μπορεί να κατακερματιστεί αποτελεσματικά στο στοχευμένο μήκος DNA. Ο ακριβής έλεγχος των παραμέτρων υπερήχων και οι εξελιγμένες επιλογές ψύξης αποτρέπουν την υποβάθμιση του DNA.
Διαβάστε περισσότερα σχετικά με τον υπερηχητικό κατακερματισμό DNA!
Εφαρμογές υπερήχων στο εμβόλιο του ιού της ευλογιάς των πιθήκων
Τα εμβόλια που χρησιμοποιούνται κατά του ιού της ευλογιάς των πιθήκων είναι επί του παρόντος εμβόλια ζωντανών ιών. Τα πρόσφατα αναπτυγμένα εμβόλια ενδέχεται να χρησιμοποιούν άλλες πλατφόρμες, όπως το DNA-based Επί του παρόντος περιέχει ένα τροποποιημένο Vaccinia Ankara viurs, έναν εξασθενημένο, μη αναπαραγόμενο orthopoxvirus. Περιέχει επίσης Tris (tris-αμινομεθάνιο) και χλωριούχο νάτριο. Το εμβόλιο μπορεί επίσης να περιέχει μικρές ποσότητες DNA και πρωτεΐνης από τα κύτταρα ινοβλαστών εμβρύου κοτόπουλου, τα οποία χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη του ιού του εμβολίου, της βενζονάσης και των αντιβιοτικών ενώσεων όπως η γενταμικίνη και η σιπροφλοξασίνη.
Η ομογενοποίηση με υπερήχους χρησιμοποιείται στην παραγωγή εμβολίων ζωντανών εξασθενημένων ιών, εμβολίων DNA, κοκτέιλ πολυδύναμου DNA, εμβολίων mRNA, εμβολίων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, εμβολίων σωματιδίων που μοιάζουν με ιούς κ.λπ.
- διασπορά σωματιδίων και παραγόντων του ιού
- Γαλακτωματοποίησης
- αδρανοποίηση ιών
- σκεύασμα φορέα φαρμάκου (NLC, SLN)
- ενθυλάκωση
- διάλυση παραγόντων
- Παρασκευή ανοσοενισχυτικών
- Απαέρωση / Απαέρωση
Πρωτόκολλο για υπερηχητική απομόνωση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων
Η ερευνητική ομάδα του Stittelaar (2005) χρησιμοποίησε υπερηχητική λύση για να απελευθερώσει τον ιό της ευλογιάς των πιθήκων από την καλλιέργεια κυττάρων ξενιστή ανάπτυξης καθώς και από κύτταρα που ελήφθησαν μέσω ανταλλαγών λαιμού από μολυσμένα πρωτεύοντα.
Προετοιμασία εμβολίου ευλογιάς των πιθήκων:
Οι ιοί της ευλογιάς των πιθήκων αναπτύχθηκαν σε κύτταρα ινοβλαστών εμβρύων κοτόπουλου χωρίς ειδικά παθογόνα. Μετά την επώαση για 1 έως 2 ημέρες, το εναιώρημα των ιικών κυττάρων συλλέχθηκε με ένα γύρο ψύξης-απόψυξης και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε με φυγοκέντρηση. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε και υποβλήθηκε σε αρκετούς γύρους ομογενοποίησης υπερήχων.
Απομόνωση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων από εμβολιασμένους μακάκους:
Τα δείγματα καταψύχθηκαν-αποψύχθηκαν τρεις φορές και υπερήχων σε ένα υπερηχητικό CupHorn. Δύο αραιώσεις (1:10 και 1:100) σε μέσο μεταφοράς συμπληρωμένες με 1% εμβρυϊκό ορό βοοειδών χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό μονοστιβάδων κυττάρων Vero σε πλάκες έξι φρεατίων. Μετά από 1 ώρα επώασης στους 37°C, τα εμβόλια αφαιρέθηκαν και αντικαταστάθηκαν με υπόστρωμα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 1% εμβρυϊκό ορό βοοειδών. Οι μονοστιβάδες καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες στους 37°C και χρωματίστηκαν με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους χρώματος.
(πρβλ. Stittelaar κ.ά., 2005)
Υπερήχων για ανάλυση ιών και παραγωγή εμβολίων
Hielscher Υπέρηχοι ευρύ χαρτοφυλάκιο προϊόντων προσφέρει το ιδανικό υπερήχων για την έρευνα και αναλυτικά εργαστήρια, καθώς και για την κατασκευή βιομηχανικών εμβολίων.
Hielscher Υπέρηχοι ειδικεύεται στο σχεδιασμό, κατασκευή και διανομή υψηλής απόδοσης υπερήχων και sono-βιοαντιδραστήρες για τη χρήση σε ερευνητικά και αναλυτικά εργαστήρια, καθώς και για την εφαρμογή στη βιομηχανική παραγωγή εμβολίων (π.χ. Εμβόλια, API).
Κατεργασία με υπερήχους μπορεί να εφαρμοστεί σε ανοικτά δοχεία, κλειστούς αντιδραστήρες συνεχούς ανάδευσης και αντιδραστήρες συνεχούς ροής. Όλα τα μέρη των συστημάτων υπερήχων, τα οποία έρχονται σε επαφή με το υγρό μέσο, είναι κατασκευασμένα από ανοξείδωτο χάλυβα, τιτάνιο ή γυαλί. Τα αυτόκλειστα εξαρτήματα και τα είδη υγιεινής εξασφαλίζουν την παραγωγή υπό συνθήκες φαρμακευτικής ποιότητας.
Αυτόματη καταγραφή δεδομένων: Έξυπνο λογισμικό καταγράφει αυτόματα τις παραμέτρους της διαδικασίας υπερήχων στην ενσωματωμένη κάρτα μνήμης SD. Ο ακριβής έλεγχος όλων των παραμέτρων της διεργασίας εξασφαλίζει την Αναπαραγωγιμότητα, τυποποίηση της παραγωγής, και διευκολύνει την εκπλήρωση των προτύπων ασφάλειας των φαρμακευτικών προϊόντων.
Hielscher Ultrasonics’ Οι επεξεργαστές υπερήχων είναι εξαιρετικά αξιόπιστοι και μπορούν να ελεγχθούν με ακρίβεια. Όλοι οι βιομηχανικοί υπερήχων μπορούν να προσαρμοστούν για να παραδώσουν το πλήρες φάσμα από χαμηλότερα έως πολύ υψηλά πλάτη. Η ευρωστία των συστημάτων υπερήχων Hielscher επιτρέπει 24 ώρες το 24ωρο, 7 ημέρες την εβδομάδα λειτουργία υπό βαρέα καθήκοντα και σε απαιτητικά περιβάλλοντα.
Ο παρακάτω πίνακας σας δίνει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση ικανότητας επεξεργασίας των υπερήχων μας:
| Όγκος παρτίδας | Ροή | Προτεινόμενες συσκευές |
|---|---|---|
| πλάκες πολλαπλών φρεατίων / μικροτιτλοδότησης | Δ / υ | UIP400MTP |
| 1 έως 500mL | 10 έως 200mL/min | UP100Η |
| 10 έως 2000mL | 20 έως 400mL / λεπτό | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 έως 20L | 0.2 έως 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 έως 100L | 2 έως 10L / λεπτό | UIP4000hdT |
| Δ / υ | 10 έως 100L / λεπτό | UIP16000 |
| Δ / υ | μεγαλύτερου | σύμπλεγμα UIP16000 |
Επικοινωνήστε μαζί μας! / Ρωτήστε μας!
Υπερήχων DNA διάτμηση
Προσαρμοσμένο από το Jkwchui υπό CC-BY-SA.03
Βιβλιογραφία / Αναφορές
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Γεγονότα που αξίζει να γνωρίζετε
ιός ευλογιάς των πιθήκων
Η ευλογιά των πιθήκων (MPV, MPXV ή hMPXV) είναι ένα είδος δίκλωνου ιού DNA, ο οποίος προκαλεί ιογενή ζωονοσογόνο νόσο. Αυτή η ασθένεια είναι γνωστή ως λοίμωξη από ευλογιά των πιθήκων και μπορεί να εμφανιστεί σε ανθρώπους και ζώα. Ανήκει στο γένος Orthopoxvirus στην οικογένεια Poxviridae. Ο ιός της ευλογιάς των πιθήκων είναι ένας από τους ανθρώπινους ορθοποξικούς ιούς μαζί με τους ιούς variola (VARV), cowpox (CPX) και vaccinia (VACV). Οι ορθοποξοϊοί χαρακτηρίζονται από μεγάλα σωματίδια ιού σε σχήμα τούβλου, που περιέχουν ένα δίκλωνο γονιδίωμα DNA περίπου 200.000 bp.
Δοκιμασία ELISA
Το ELISA σημαίνει Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay και είναι μια επισημασμένη ανοσολογική δοκιμασία που θεωρείται το χρυσό πρότυπο ανοσοπροσδιορισμών. Το ELISA είναι ένα ανοσολογικό τεστ, που αποτιμάται για την υψηλή διαγνωστική ευαισθησία του, χρησιμοποιείται για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση μορίων, συμπεριλαμβανομένων αντισωμάτων, αντιγόνων, πρωτεϊνών, γλυκοπρωτεϊνών και ορμονών. Η αρχή της ELISA βασίζεται στην αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος. Με αυτή την αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος, τα ειδικά αντισώματα συνδέονται με το αντιγόνο-στόχο του. Μόνο όταν λαμβάνει χώρα η αλληλεπίδραση, το υπόστρωμα μπορεί να συνδεθεί με το ένζυμο και μπορεί να παρατηρηθεί μια επακόλουθη μετατροπή υποστρώματος, πράγμα που σημαίνει ότι επιτυγχάνεται θετικό αποτέλεσμα.
Hielscher Υπέρηχοι κατασκευάζει υψηλής απόδοσης υπερήχων ομογενοποιητές από εργαστήριο προς βιομηχανικό μέγεθος.