Ultralydsproduktion af højt oprensede schizophyllan-beta-glucaner

Schizophyllan er et β-glucan fra svampe med immunmodulerende egenskaber. For at opnå stærke medicinske virkninger skal schizophyllan have en lav molekylvægt for at udvise forbedret biotilgængelighed. Det er dokumenteret, at sonikering reducerer molekylvægten af schizophyllan. Som en pålidelig og effektiv metode kan sonikering nemt anvendes til produktion af schizophyllan med lav molekylvægt.

Schizophyllum-svampe og ultralydsekstraktion af beta-glucan

Arter af Schizophyllum-svampe vokser i naturen på træer under nedbrydning efter regntider. Frugtlegemerne indsamles i den efterfølgende tørtid. Schizophyllum-arter er rige på biokemiske forbindelser såsom glucaner og indtages derfor især i tropiske lande som fødevarer og medicin. På grund af sine immunmodulerende, svampehæmmende, antineoplastiske og antivirale egenskaber har Schizophyllum commune, også kendt som kløvblad, tiltrukket bioteknologiske virksomheder og medicinalvirksomheder.
Polysaccharidet schizophyllan, også kendt som sizofiran, sonifilan eller sizofilan, er det primære β-glucan i Schizophyllum-svampe, som er en kilde til det yderst effektive bioaktive β-glucan schizophyllan.
Schizophyllum commune-svampe vokser i naturen på træer; myceliet kan også dyrkes i fermenteringsvæske. Til farmaceutiske og kosmetiske anvendelser er schizophyllan med lav molekylvægt langt mere effektivt end schizophyllan med høj molekylvægt. Dette skyldes, at schizophyllan med lav molekylvægt udviser betydeligt bedre biotilgængelighed og absorptionshastigheder. Desuden er schizophyllan med høj molekylvægt ofte problematisk i anvendelser, da det medfører høj viskositet i dets vandige opløsninger.
Ultralydsbaseret størrelsesreduktion er en yderst effektiv og pålidelig teknik til at sænke molekylvægten af schizophyllan og dermed øge kvaliteten af β-glucanmolekylet.

Protokol til produktion af schizophyllan med lav molekylvægt

Da schizophyllan med molekylvægt udviser markant bedre biotilgængelighed og anvendelsesegenskaber, undersøgte Smirnous forskerhold sonikering til spaltning og størrelsesreduktion af β-glucanmolekylet schizophyllan.

Sonikering af schizophyllan

β-1.3(1.6)-glucanet schizophyllan (SPG) blev produceret ved neddykket dyrkning af svampen S. commune i en bioreaktor med saccharose som substrat.
Efter afslutningen af dyrkningen blev dyrkningsvæsken fortyndet med demineraliseret vand til en schizophyllankoncentration på 2 g/L og sonikeret med ultralydsprocessoren UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i recirkulationstilstand med følgende parametre og betingelser: medieflow 50 mL/s, frekvens 20 kHz, udgangseffekt 2000 W, sonotrodetype BS2d22, boostertype B2-1.4 og amplitude 100%. Dyrkningsvæskens temperatur ved sonikeringens begyndelse var 25°C. Den sonikerede dyrkningsvæske (specifik energitilførsel 100 Ws/mL) blev filtreret gennem et Seitz HS800-dybdefilter ved et tryk på 1,5 bar og 40°C. Det sonikerede schizophyllan (uSPG) til kemisk karakterisering blev udfældet fra filtratet med en tredobbelt mængde isopropylalkohol ved laboratorietemperatur og tørret ved 60°C i 12h. uSPG-opløsninger til immunologiske undersøgelser blev fremstillet som følger: (1) filtratet fra den sonikerede dyrkningsvæske blev diafiltreret gennem en 0,1m2 Pall Centramate T-series PES-kassette (100 kDa afskæringsgrænse) ved 0,8 bar, og diafiltreringen fortsatte, indtil retentatets ledningsevne var 20 μS/cm; (2) opløsningen blev koncentreret ved diafiltrering til en uSPG-koncentration på 1 g/L og steriliseret ved autoklavering ved 120°C/20 min. Denatureret uSPG blev fremstillet på tilsvarende måde, bortset fra at NaOH blev tilsat dyrkningsvæskefiltratet i en koncentration på 0,2 M, og den alkaliserede opløsning blev inkuberet i 30 min ved laboratorietemperatur før diafiltrering.

Analysemetoder

Mycelieudbyttet blev bestemt gravimetrisk: dyrkningsvæsken blev fortyndet med vand 1:4 og centrifugeret ved 10.000 × g og 25°C i 20 min; bundfaldet blev vasket med en tredobbelt mængde vand, tørret ved 60°C og vejet. Schizophyllan blev udfældet fra supernatanten med en tredobbelt mængde isopropylalkohol, tørret ved 60°C i 24h, og udbyttet blev bestemt gravimetrisk. pO2 i dyrkningsvæsken blev målt med den optiske sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz).
Dyrkningsvæskens dynamiske viskositet blev målt på HAAKE Visco Tester 6L med spindlerne 1L og 2L ved 4°C og en rotationshastighed på 30 rpm. Filtreringshastigheden blev beregnet ud fra filtreringstiden for 500 mL dyrkningsvæske gennem et 200 × 200 mm Seitz HS800-dybdefilter (Pall, USA) ved et tryk på 1,5 bar og 40°C.
uSPG’s molekylvægt blev målt ved SEC-MALLS på HPLC-systemet Alliance (Waters) med serieforbundne PL aquagel OH60- og PL aquagel OH40-kolonner, og detektoren miniDAWN TREOS (Wyatt) blev koncentreret ved diafiltrering til en uSPG-koncentration på 1 g/L og steriliseret ved autoklavering ved 120°C/20 min. Denatureret uSPG blev fremstillet på tilsvarende måde, bortset fra at NaOH blev tilsat dyrkningsvæskefiltratet i en koncentration på 0,2 M, og den alkaliserede opløsning blev inkuberet i 30 min ved laboratorietemperatur før diafiltrering.

Resultater:
Sonikeringen blev anvendt direkte på S. commune-dyrkningsvæske med mycelium efter 144-h dyrkning for at lette den efterfølgende behandling af SPG.
 
Egenskaber ved sonikeret schizophyllan: Sonikeret schizophyllan (uSPG) blev udfældet fra dyrkningsvæskefiltratet med alkohol og karakteriseret. SEC-MALLS estimerede Mw for uSPG til omkring 1 MDa. Den gennemsnitlige molekylvægt af schizophyllan fra fermentering i væske er cirka 5 MDa, mens den ved dyrkning på fast substrat kan nå op på 10 MDa. Ved sammenligning af molekylvægten af sonikeret schizophyllan med molekylvægtene af nativt, ubehandlet schizophyllan kan der observeres en 5–10 gange lavere molekylvægt som følge af sonikering.
Det sonikerede polysaccharid uSPG indeholdt 0,7%w/w protein og 1,0%w/w gløderest. uSPG-hydrolysatet bestod af mere end 99% glucose. Analyseresultaterne indikerer, at sonikering spalter β-glucanets hovedkæde tilfældigt, mens sidegrenene forbliver intakte, hvorved størrelsen og molekylvægten af schizophyllan reduceres. Immunologiske undersøgelser af uSPG, som i det væsentlige var frit for protein og endotoksin, viste, at sonikeret schizophyllan med lav Mw har udpræget immunmodulerende aktivitet.

 
Reduceret viskositet: Sonikering medførte et betydeligt fald i dyrkningsvæskens viskositet. Under sonikering ændrede dyrkningsvæskens viskositet sig ikke-lineært: viskositeten faldt hurtigt i begyndelsen af sonikeringen, men senere aftog faldet. En specifik energitilførsel på 100 Ws/mL var tilstrækkelig til at reducere dyrkningsvæskens viskositet næsten 7 gange.

Forbedret filtrering: Den ultralydsbehandlede dyrkningsvæske strømmede hurtigere gennem filteret end den ubehandlede dyrkningsvæske (specifik energitilførsel 0 Ws/mL) med højmolekylært SPG. Desuden reducerede sonikering produkttabet under filtrering betydeligt. Filtratet fra ubehandlet dyrkningsvæske med højmolekylært SPG (specifik energitilførsel 0 Ws/mL) indeholdt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, mens SPG-koncentrationen før dybdefiltrering var 2 g/L. Derimod indeholdt filtratet fra dyrkningsvæske sonikeret med 100 Ws/mL SPG i en koncentration på 2,2 ± 0,2 g/L, hvilket svarer til et produkttab på næsten nul.

Konklusion: I deres konklusion opsummerer forskerholdet, at ultralydsbehandling er en effektiv teknologi til fremstilling af schizophyllan med lav molekylvægt, som derefter kan anvendes i kosmetik og medicin. Når sonikering anvendes på hele dyrkningsvæsken med mycelium, giver den visse fordele ved produktionen af schizophyllan. Den reducerer produkttab under den efterfølgende behandling og muliggør produktion af højt oprenset polysaccharid gennem effektiv anvendelse af ultrafiltrering.
Desuden fandt forskerne, at ultralydsbehandling af schizophyllan nemt kan skaleres. Én enhed af pilotanlæggets ultralydsdisintegrator UIP2000hdT behandlede 1 liter dyrkningsvæske på 110 s i gennemstrømningstilstand. Systemets produktivitet kan nemt øges ved seriekobling af yderligere ultralydsenheder.

 
Læs mere om den enkle opskalering af svampeekstraktion!
 

Højtydende ultralydsudstyr til behandling af glucaner fra svampe

Fragmentering af polysaccharider såsom glucaner samt andre bioaktive forbindelser såsom chitin og chitosan kan udføres pålideligt med Hielschers højtydende ultralydsudstyr. Vores ultralydsapparater kan levere høje amplituder, giver præcis kontrol over procesparametrene og kan anvendes 24/7 under stor belastning og i krævende miljøer. Hielscher Ultrasonics’ udvalg af udstyr opfylder disse krav pålideligt. Ud over fremragende ultralydsydelse har Hielschers ultralydsapparater høj energieffektivitet, hvilket er en betydelig økonomisk fordel – især når de anvendes i kommerciel produktion i stor skala.
Hielschers ultralydsapparater er højtydende systemer, der kan udstyres med tilbehør såsom sonotroder, boostere, reaktorer eller flowceller for optimalt at imødekomme dine procesbehov.
Med digitalt farvedisplay, mulighed for at forudindstille sonikeringsforløb, automatisk dataregistrering på et integreret SD-kort, fjernstyring via browser og mange flere funktioner sikres den højeste proceskontrol og brugervenlighed. Kombineret med robusthed og stor belastningskapacitet er Hielschers ultralydssystemer din pålidelige arbejdshest i produktionen.
Reduktion af molekylvægten af β-glucaner såsom schizophyllan kræver kraftig ultralyd for at opnå den tilsigtede spaltning og et slutprodukt af schizophyllan af høj kvalitet, som kan anvendes til farmaceutiske formål.
 
Find flere oplysninger om ultralydsekstraktion af beta-glucan fra svampe, herunder trinvise instruktioner, her!
 
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet: