Schizophyallan er en svampe β glucan med immunmodulerende egenskaber. For meget aktive medicinske virkninger skal schizophyllan have en lav molekylvægt for at vise forbedret biotilgængelighed. Ultralydbehandling har vist sig at reducere molekylvægten af schizophyllan. Som pålidelig og effektiv metode kan sonikering let anvendes til produktion af lav molekylvægt schizophyllan.

Schizophyllum svampe og ultralyd beta-glucan ekstraktion

Arter af Schizophyllum champignon vokser i naturen på forfaldne træer efter regntiden. Frugtlegemerne opsamles i den følgende tørre sæson. Schizophyllum arter er rige på biokemiske forbindelser såsom glukannødder og forbruges derfor især i tropiske lande som mad og medicin. På grund af sin immunmodulerende, svampedræbende, antineoplastiske og antivirale egenskaber har Schizophyllum kommune, også kendt som Splitgill mushroom, tiltrukket biotek- og medicinalvirksomheder.
Den polysaccharid schizophyllan, også kendt som sizofiran, sonifilan, eller sizofilan, er den største β glucan findes i Schizophyllum svampe, som tilbyder den meget effektive bioaktive β glucan schizophyllan.
Schizophyllum kommune svampe vokser i naturen på træer, mycellium kan også dyrkes i gæring bouillon. Til farmaceutiske og kosmetiske anvendelser er lav molekylvægt schizophyllan langt mere effektiv end høj molekylvægt schizophyllan. Dette skyldes det faktum, at lav molekylvægt schizophyllan viser betydeligt bedre biotilgængelighed og absorptionshastigheder. Desuden er høj molekylvægt schizophyllan ofte problematisk i applikationer, da det resulterer i høj viskositet af sine vandige løsninger.
Ultralyd størrelse reduktion er en meget effektiv og pålidelig teknik til at sænke molekylvægten af schizophyllan, hvilket øger kvaliteten af β glucan molekyle.

Protokol til produktion af lav molekylvægt Schizophyllan

Da molekylvægt schizophyllan demonstrerer drastisk bedre biotilgængelighed og anvendelsesegenskaber, undersøgte forskerholdet i Smirnou ultralydning for kavalergang og størrelsesreduktion af β-glucanmolekyle schizophyllan.

Ultralydbehandling af Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) blev fremstillet ved neddykket dyrkning af S. kommunesvamp i bioreaktor ved hjælp af saccharose som substrat.
Efter dyrkningens afslutning blev kultur bouillon fortyndet med demineraliseret vand til schizophyllan koncentration 2 g / L og ultralydet med Ultrasonic processor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i genbrugstilstand ved følgende parametre og betingelser: medium flow 50 mL/s, frekvens 20 kHz, output 2000 W, sonotrode type BS2d22, booster type B2-1.4 og amplitud 100%. Kultur bouillon temperatur i begyndelsen af sonikering var 25 ° C. Den ultralydede kultur bouillon (specifik energi input 100 Ws/mL) blev filtreret gennem Seitz HS800 dybdefilter under 1,5 bar tryk ved 40 ° C. Den ultralydede schizophyllan (uSPG) til kemisk karakterisering blev udfældet fra filtratet med tredobbelt mængde isopropylalkohol ved laboratorietemperatur og tørret ved 60 °C i 12 timer uSPG-opløsninger til immunologiske undersøgelser blev udarbejdet som følger: (1) den ultralydede kultur bouillonfiltrat blev diafiltreret gennem 0,1 m2 Pall Centramate T-serien PES kassette (100 kDa cut-off) ved 0,8 bar og diafiltration fortsatte indtil retentate ledningsevne var 20 μS/cm; (2) opløsningen var koncentreret ved diafiltration til uSPG-koncentration 1 g/L og steriliseret ved autoklavering ved 120 °C/20 min. Denatureret uSPG blev fremstillet på samme måde, bortset fra at NaOH blev tilsat kultur bouillonfiltrat i koncentration 0,2 M, og den alkaliske opløsning blev inkuberet i 30 min ved laboratorietemperatur før diafiltration.

Analysemetoder

Myceliumudbyttet blev anslået gravimetrically: kultur bouillon blev fortyndet med vand 1:4, centrifugeret 10000 × g ved 25 ° C i 20 min, bundfald blev vasket med tredobbelt mængde vand, tørret ved 60 ° C og vægtet. Schizophyllan blev udfældet af supernatant med tredobbelt mængde isopropylalkohol, tørret ved 60 °C i 24 timer, og udbyttet blev bestemt gravimetrically. pO2 i kultur bouillon blev målt ved optisk sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz).
Kultur bouillon dynamisk viskositet blev målt på HAAKE Visco Tester 6L med spindler 1L og 2L ved 4 ° C og rotationshastighed på 30 rpm. Filtreringshastigheden blev beregnet fra filtreringstiden for 500 mL kultur bouillon til 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) dybdefilter ved 1,5 bar tryk og 40 ° C.
uSPG molekylvægt blev målt af SEC-MALLS på HPLC system Alliance (Waters) med serieforbundne PL aquagel OH60 og PL aquagel OH40 kolonner, og detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) blev koncentreret ved diafiltration til uSPG koncentration 1 g / L og steriliseret ved autoklavering ved 120 ° C / 20 min. Denatureret uSPG blev fremstillet på samme måde, bortset fra at NaOH blev tilsat kultur bouillonfiltrat i koncentration 0,2 M, og den alkaliske opløsning blev inkuberet i 30 min ved laboratorietemperatur før diafiltration.

Resultater:
Ultralydbehandlingen blev anvendt direkte på S. kommune 144-timers kultur bouillon med mycelium for at lette SPG downstream-behandling.
 
Egenskaber ved Sonicated Schizophyllan: Ultralydet schizophyllan (uSPG) blev udfældet fra kultur bouillon filtrat af alkohol og karakteriseret. SEC-MALLS anslog Mw af uSPG til at være omkring 1 MDa. Den gennemsnitlige molekylvægt af schizophyllan fra flydende gæring er ca. 5 MDa, mens den i fast tilstand kan nå op til 10 MDa. Sammenligning af molekylvægten af ultralydet schizophyllan med molekylvægtene af indfødte ubehandlede schizophyllan, en 5- til 10-fold reduceret molekylvægt kan observeres på grund af ultralydbehandling.
Den sonikerede polysaccharid uSPG indeholdt 0,7% w / w protein og 1,0% w / w rester efter tænding. uSPG hydrolysat bestod af glukose med mere end 99%. De analytiske resultater tyder på, at sonikering spalter β-glucan rygraden tilfældigt og sidegrene forbliver intakte og derved reducere størrelse og molekylvægt af schizophyllan. Immunologiske undersøgelser af hovedsagelig protein- og endotoksinfri uSPG viste, at ultralydet lav mw schizophyllan har udtalt immunmodulerende aktivitet.

 
Reduceret viskositet: Ultralydbehandling resulterede i et betydeligt fald i kultur bouillon viskositet. Under ultralydning ændrede kultur bouillonviskositeten sig ikke lineært: viskositetsreduktionen var hurtig i begyndelsen af ultrasonikering, men senere bremsede det. Specifik energitilførsel 100 Ws/mL var tilstrækkelig til at reducere kulturens bouillonviskositet næsten 7 gange.

Forbedret filtrering: Den ultralydbehandlede kultur bouillon flød gennem filteret hurtigere end den ubehandlede kultur bouillon (specifik energi input 0 Ws / mL) med høj molekylær SPG. Desuden reducerede ultralydgørelsen betydeligt produkttab under filtrering. Filtratet af ubehandlet kultur bouillon med høj molekylær SPG (specifik energitilførsel 0 Ws/mL) indeholdt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, mens SPG-koncentrationen før dybdefiltrering var 2 g/L. I modsætning hertil indeholdt filtratet på 100 Ws / mL ultralydskultur begge SPG i koncentration 2,2 ± 0,2 g / L, hvilket svarer til næsten nul produkttab.

Konklusion: I deres konklusion fortsætter forskerholdet, at ultralydsbehandling er en effektiv teknologi til fremstilling af lav molekylvægt schizophyllan, som derefter kan bruges i kosmetik og medicin. Ultralydbehandling, når den anvendes på komplet kultur bouillon med mycelium, bringer visse fordele til schizophyllan produktion. Det reducerer produkttab under downstream-forarbejdning og gør produktion af stærkt renset polysaccharid mulig på grund af effektiv brug af ultrafiltration.
Derudover fandt forskerne, at ultralydsbehandling af schizophyllan er let skalerbar. En enhed af pilotfabrikken ultralydsdeintegrator UIP2000hdT forarbejdede 1 liter kultur bouillon i 110 s i flowtilstand. Produktiviteten af systemet kan let øges ved sekventiel tilslutning af yderligere ultralydsenheder.

 
Læs mere om den enkle opskalering af svampeekstraktion!
 

Højtydende ultralydsudstyr til svampe glucanbehandling

Fragmenteringen af polysaccharider såsom glucaner samt andre bioaktive forbindelser såsom chitin og chitosan kan pålideligt behandles med Hielscher højtydende ultralydsudstyr. Vores ultralydapparater kan levere høje amplituder, tilbyder præcis styrbarhed over procesparametrene og kan betjenes 24/7 under tung belastning og i krævende miljøer. Hielscher Ultrasonics udstyrssortiment opfylder disse krav pålideligt. Udover fremragende ultralyd ydeevne, Hielscher ultralydapparater prale høj energieffektivitet, hvilket er en betydelig økonomisk fordel – især når de anvendes på kommerciel storproduktion.
Hielscher ultralydapparater er højtydende systemer, der kan udstyres med tilbehør som sonotroder, boostere, reaktorer eller flowceller for at matche dine procesbehov på en optimal måde. Parret med robusthed og tung bæreevne, Hielscher ultralyd systemer er din pålidelige arbejdshest i produktion. Reduktionen af molekylvægt af β glukannødder såsom schizophyllan kræver kraftig ultralyd for at opnå den målrettede kavalergang og en endelig schizophyllan produkt af høj kvalitet, som kan bruges til farmaceutiske applikationer.
 
Find mere information om ultralyd beta-glucan ekstraktion fra svampe, herunder trinvise instruktioner her!
 
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige forarbejdningskapacitet hos vores ultralydapparater: