Ultralydsproduktion af højt oprensede Schizophyllan beta-glucaner

Schizophyallan er en svampe β-glucan med immunmodulerende egenskaber. For højaktive medicinske virkninger skal skizofyllan have en lav molekylvægt for at vise forbedret biotilgængelighed. Ultralydbehandling har vist sig at reducere molekylvægten af skizofyllan. Som pålidelig og effektiv metode kan sonikering let anvendes til fremstilling af schizophyllan med lav molekylvægt.

Schizophyllum svampe og ultralyd beta-glucan ekstraktion

Arter af Schizophyllum-svampen vokser i naturen på rådnende træer efter regntiden. Frugtlegemerne opsamles i den følgende tørre sæson. Schizophyllum-arter er rige på biokemiske forbindelser såsom glucaner og indtages derfor især i tropiske lande som mad og medicin. På grund af sine immunmodulerende, svampedræbende, antineoplastiske og antivirale egenskaber har Schizophyllum kommune, også kendt som Splitgill-svampen, tiltrukket biotek- og medicinalvirksomheder.
Polysaccharid schizophyllan, også kendt som sizofiran, sonifilan eller sizofilan, er den vigtigste β-glucan, der findes i Schizophyllum-svampe, som tilbyder den meget effektive bioaktive β-glucan schizophyllan.
Schizophyllum commune svampe vokser i naturen på træer, mycelliet kan også dyrkes i gæringsbouillon. Til farmaceutiske og kosmetiske applikationer er skizofyllan med lav molekylvægt langt mere effektiv end skizofyllan med høj molekylvægt. Dette skyldes det faktum, at skizofyllan med lav molekylvægt viser signifikant bedre biotilgængelighed og absorptionshastigheder. Derudover er schizophyllan med høj molekylvægt ofte problematisk i applikationer, da det resulterer i høj viskositet af dets vandige opløsninger.
Ultralydsstørrelsesreduktion er en yderst effektiv og pålidelig teknik til at sænke molekylvægten af skizofyllan og derved øge kvaliteten af β-glucan-molekylet.

Protokol til produktion af schizophyllan med lav molekylvægt

Da molekylvægt schizophyllan viser drastisk bedre biotilgængelighed og anvendelsesegenskaber, undersøgte forskerholdet af Smirnou ultralydbehandling for spaltning og størrelsesreduktion af β-glucan-molekylet schizophyllan.

Ultralydbehandling af skizofyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) blev produceret ved nedsænket dyrkning af S. commune-svamp i bioreaktor ved hjælp af saccharose som substrat.
Efter afslutningen af dyrkningen blev kulturbouillon fortyndet med demineraliseret vand til skizofyllankoncentration 2 g / L og ultralydiseret med ultralydsprocessor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland) i genbrugstilstand ved følgende parametre og betingelser: medium flow 50 ml/s, frekvens 20 kHz, output 2000 W, sonotrode type BS2d22, booster type B2-1.4 og amplitude 100%. Kulturbouillontemperaturen i begyndelsen af sonikeringen var 25 °C. Den ultralydsbehandlede kulturbouillon (specifik energitilførsel 100 Ws / ml) blev filtreret gennem Seitz HS800 dybdefilter under 1,5 bar tryk ved 40 °C. Den ultralydsbehandlede schizophyllan (uSPG) til kemisk karakterisering blev udfældet fra filtratet med tredobbelt mængde isopropylalkohol ved laboratorietemperatur og tørret ved 60 ° C i 12 timer uSPG-opløsninger til immunologiske undersøgelser blev fremstillet som følger: (1) det ultralydsbehandlede kulturbouillonfiltrat blev diafiltreret gennem 0,1 m2 Pall Centramate T-serie PES-kassette (100 kDa cut-off) ved 0,8 bar og diafiltrering fortsatte, indtil retentatledningsevnen var 20 μS / cm; (2) opløsningen blev koncentreret ved diafiltrering til uSPG-koncentration 1 g/L og steriliseret ved autoklavering ved 120 °C/20 min. Denatureret uSPG blev fremstillet på en lignende måde, bortset fra at NaOH blev tilsat kulturbouillonfiltratet i koncentration 0,2 M, og den alkaliserede opløsning blev inkuberet i 30 minutter ved laboratorietemperatur før diafiltrering.

Analysemetoder

Myceliumudbyttet blev estimeret gravimetrisk: kulturbouillon blev fortyndet med vand 1:4, centrifugeret 10000 × g ved 25 °C i 20 minutter, bundfaldet blev vasket med tredobbelt mængde vand, tørret ved 60 °C og vægtet. Schizophyllan blev udfældet fra supernatant med tredobbelt mængde isopropylalkohol, tørret ved 60 °C i 24 timer, og dets udbytte blev bestemt gravimetrisk. pO2 i kulturbouillonen blev målt med optisk sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Schweiz).
Kulturbouillonens dynamiske viskositet blev målt på HAAKE Visco Tester 6L med spindler 1L og 2L ved 4°C og rotationshastighed på 30 omdr./min. Filtreringshastigheden blev beregnet ud fra filtreringstiden for 500 ml kulturbouillon til 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) dybdefilter ved 1,5 bar tryk og 40 °C.
uSPG-molekylvægt blev målt ved SEC-MALLS på HPLC-system Alliance (Waters) med serieforbundne PL aquagel OH60 og PL aquagel OH40 kolonner, og detektor miniDAWN TREOS (Wyatt) blev koncentreret ved diafiltrering til uSPG-koncentration 1 g/L og steriliseret ved autoklavering ved 120 °C/20 min. Denatureret uSPG blev fremstillet på en lignende måde, bortset fra at NaOH blev tilsat kulturbouillonfiltratet i koncentration 0,2 M, og den alkaliserede opløsning blev inkuberet i 30 minutter ved laboratorietemperatur før diafiltrering.

Resultater:
Ultralydbehandlingen blev anvendt direkte på S. kommune 144-timers kulturbouillon med mycelium for at lette SPG-nedstrømsbehandling.
 
Karakteristika for sonikeret skizofyllan: Ultralydsskizofyllan (uSPG) blev udfældet fra kulturbouillonfiltrat ved alkohol og karakteriseret. SEC-MALLS estimerede Mw uSPG til at være omkring 1 MDa. Den gennemsnitlige molekylvægt af schizophyllan fra flydende gæring er ca. 5 MDa, mens den i faststofdyrkning kan nå op til 10 MDa. Sammenligning af molekylvægten af ultralydsskizofyllan med molekylvægten af naturlig ubehandlet skizofyllan, kan en 5- til 10-dobbelt reduceret molekylvægt observeres på grund af ultralydbehandling.
Det sonikerede polysaccharid uSPG indeholdt 0,7% vægt / vægt protein og 1,0% vægt / w rest efter antændelse. uSPG-hydrolysat bestod af glucose med mere end 99 %. De analytiske resultater indikerer, at sonikering spalter β-glucan-rygraden tilfældigt, og sidegrenene forbliver intakte, hvilket reducerer størrelsen og molekylvægten af schizophyllan. Immunologiske undersøgelser af i det væsentlige protein- og endotoksinfri uSPG viste, at ultralydsbehandlet lav-Mw schizophyllan har udtalt immunmodulerende aktivitet.

 
Reduceret viskositet: Ultralydbehandling resulterede i et signifikant fald i kulturbouillonens viskositet. Under ultralydbehandling ændrede kulturbouillonviskositeten sig ikke-lineært: viskositetsfaldet var hurtigt i begyndelsen af ultralydbehandlingen, men senere bremsede det. Specifik energitilførsel 100 Ws/ml var tilstrækkelig til at reducere kulturbouillonviskositeten næsten 7 gange.

Forbedret filtrering: Den ultralydsbehandlede kulturbouillon strømmede hurtigere gennem filteret end den ubehandlede kulturbouillon (specifik energitilførsel 0 Ws/ml) med højmolekylær SPG. Desuden reducerede ultralydbehandling signifikant produkttab under filtrering. Filtratet af ubehandlet kulturbouillon med højmolekylær SPG (specifik energitilførsel 0 Ws/ml) indeholdt 0,3 ± 0,07 g/L SPG, mens SPG-koncentrationen før dybdefiltrering var 2 g/L. I modsætning hertil indeholdt filtratet på 100 Ws / ml ultralydskultur begge SPG i koncentration 2,2 ± 0,2 g / L, hvilket svarer til næsten nul produkttab.

Konklusion: I deres konklusion genoptager forskerholdet, at ultralydsbehandling er en effektiv teknologi til fremstilling af lavmolekylær schizophyllan, som derefter kan bruges i kosmetik og medicin. Ultralydbehandling, når den påføres på komplet kulturbouillon med mycelium, giver visse fordele for skizofyllanproduktionen. Det reducerer produkttab under downstream-forarbejdning og gør produktion af højt renset polysaccharid mulig på grund af effektiv brug af ultrafiltrering.
Derudover fandt forskerne, at ultralydsbehandling af skizofyllan er let skalerbar. En enhed af pilotanlæggets ultralydsdisintegrator UIP2000hdT behandlede 1 liter kulturbouillon på 110 sekunder i flowtilstand. Systemets produktivitet kan let øges ved sekventiel tilslutning af yderligere ultralydsenheder.

 
Læs mere om den enkle opskalering af svampeekstraktion!
 

Højtydende ultralydsudstyr til svampeglucanbehandling

Fragmenteringen af polysaccharider såsom glucaner såvel som andre bioaktive forbindelser såsom chitin og chitosan kan pålideligt behandles med Hielscher højtydende ultralydsudstyr. Vores ultralydapparater kan levere høje amplituder, tilbyder præcis kontrol over procesparametrene og kan betjenes 24/7 under tung belastning og i krævende miljøer. Hielscher Ultrasonics udstyrssortiment opfylder disse krav pålideligt. Udover fremragende ultralydsydelse kan Hielscher ultralydapparater prale af høj energieffektivitet, hvilket er en betydelig økonomisk fordel – især når de anvendes til kommerciel storskalaproduktion.
Hielscher ultralydapparater er højtydende systemer, der kan udstyres med tilbehør såsom sonotroder, boostere, reaktorer eller flowceller for at matche dine procesbehov på en optimal måde.Med digitalt farvedisplay, mulighed for forudindstillede sonikeringskørsler, automatisk dataoptagelse på et integreret SD-kort, fjernstyring af browser og mange flere funktioner, sikres den højeste proceskontrol og brugervenlighed. Sammen med robusthed og tung bæreevne er Hielscher ultralydssystemer din pålidelige arbejdshest i produktionen.Reduktionen af molekylvægten af β-glucaner såsom schizophyllan kræver kraftig ultralyd for at opnå den målrettede spaltning og et endeligt skizofyllanprodukt af høj kvalitet, som kan bruges til farmaceutiske applikationer.
 
Find mere information om ultralyds beta-glucan-ekstraktion fra svampe, herunder trin-for-trin instruktioner her!
 
Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater: