Ekstraktion af beta-glucaner fra svampe ved hjælp af ultralydbehandling
Materialer og udstyr
- Svampe (f.eks. 100 g hakkede eller skivede svampe)
- Koldt destilleret vand (f.eks. 500 ml)
- Blender eller kværn
- Bægerglas eller glaskolber
- Filterpapir eller en vakuumfiltreringsopsætning
- Centrifuge (valgfrit)
- Alkohol (f.eks. ethanol) til udfældning
- Køleskab
- Tørring ovn
Beta-glucan ekstraktionsprotokol
- Mal eller knus svampene (f.eks. Chaga eller Lion’ Mankesvamp) til grove partikler på ca. 1 til 3 millimeter. Brug for eksempel 100 g tørrede svampepartikler.
- Derefter tilsættes svampepartiklerne til et glasbægerglas eller kolbe.
- Derefter tilsættes 500 ml destilleret vand til bægerglasset, der indeholder svampepartiklerne, der skal ekstraheres. Vand-til-svampe-forholdet kan variere afhængigt af den specifikke svampetype og partikelstørrelse.
- Når du har omrørt opslæmningen, sonikere blandingen ved hjælp af en ultralyd lab homogenisator (fx UP400St med 22mm sonotrode ved 100% amplitude eller UP200Ht med 14mm sonotrode ved 100% amplitude) og opretholde en temperatur på under 90 ° C. Lavere temperaturer hjælper med at bevare varmefølsomme forbindelser, såsom beta-glucaner under ekstraktion. Sonikere i ca. 5 til 10 minutter, når du bruger UP400St og i 10 til minutter, når du bruger UP200Ht, henholdsvis. Bemærk, at temperaturen og ekstraktionstiden kan variere afhængigt af den anvendte ultralydseffekt. Selvfølgelig vil større mængder kræve længere sonikeringstider.
- Filtrer den sonikerede blanding gennem filterpapir eller brug en vakuumfiltreringsopsætning til at adskille væsken (indeholdende de ekstraherede beta-glucaner) fra den faste svamperest.
- Derefter udfældes beta-glucanerne fra væsken ved tilsætning af alkohol (f.eks. ethanol). Typisk kan du bruge 2-3 volumener alkohol til nedbør.
- Derefter opbevares blandingen i køleskab i flere timer for at lade beta-glucanerne udfælde.
- Efter nedbør kan du dekantere væsken omhyggeligt og opsamle beta-glucan-bundfaldet.
- Til sidst tørres beta-glucanerne i en ovn ved lav temperatur (f.eks. 40-50 °C), indtil al alkohol er fjernet, og du får et tørt pulver.
Svampe udviser variationer i deres egenskaber. Derfor kan beta-glucan-ekstraktionsprocessen variere baseret på faktorer som den specifikke svampeart, svampens tilstand (tørret eller frisk), partikelstørrelse og ekstraktionstemperaturen. For at optimere din ekstraktionsprocedure kan du overveje at eksperimentere med forskellige parametre, herunder at variere faststof-til-væske-forholdene, justere temperaturer, udforske forskellige opløsningsmidler og teste forskellige sonikeringsvarigheder og amplitudeindstillinger.
Ultralydassisteret enzymatisk ekstraktion af beta-glucan
Ultralydassisteret enzymatisk ekstraktion er en metode, der anvendes til at ekstrahere beta-glucaner fra svampe ved hjælp af en kombination af enzymer og ultralydbølger. Denne proces forbedrer ekstraktionens effektivitet ved at nedbryde svampens cellevægge og lette frigivelsen af beta-glucaner.
Opskalering af beta-glucan-ekstraktion fra svampe
Når du har etableret en beta-glucan-ekstraktionsprotokol, der opfylder dine krav, kan opskalering af ekstraktionsprocessen være en ligetil indsats.
Opskalering af batchekstraktion
Hvis du planlægger at skalere op ved hjælp af en batchudtrækningsmetode, anbefaler vi, at du øger batchvolumenet, samtidig med at faststof-til-væske-forholdet og alle andre parametre holdes konstante. Hvis du fortsætter med at bruge den samme ultralydhomogenisator, skal du sørge for at øge sonikeringstiden proportionalt. For partier, der overstiger 1 liter, kan du overveje at inkorporere en langsom omrører for at opretholde partikelsuspension og forbedre ekstraktionens ensartethed. Billedet nedenfor viser en 8-liters batchekstraktionsopsætning ved hjælp af en UP400St ultralydhomogenisator i kombination med en laboratorieomrører.
8L Batch champignon ekstraktion opsætning med UP400St Sonicator
Vakuumfiltrering af beta-glucanekstrakt efter sonikering
Inline champignon ekstraktion
For dem, der er interesseret i løbende at udvinde større mængder beta-glucaner fra svampe, Hielscher Ultrasonics tilbyder flow cellereaktorer designet til botanisk materiale ekstraktion. Hvis dette gælder for dig, opfordrer vi dig til at kontakte os direkte for at få flere oplysninger. Vores tekniske team hjælper gerne med at bestemme den bedst egnede opsætning til dine specifikke behov. Imidlertid kan udførelse af laboratorieskalaeksperimentet, der er nævnt tidligere med dine specifikke svampearter, være uvurderligt for at forstå de præcise proceskrav. Billedet nedenfor viser en stor flowcellereaktor med en UIP4000hdT ultralydhomogenisator til ekstraktion af beta-glucaner ved ca. 50 til 200 liter svampeopløsningsmiddelopslæmning i timen.
UIP4000hdT ultralydhomogenisator til 50 til 200L svampeopløsningsmiddelopslæmning i timen
Empirisk beta-glucankoncentration af svampearter
Nedenfor finder du en liste over empirisk beta-glucankoncentration, der blev ekstraheret fra forskellige svampearter.
| Svampe arter | Indhold af betaglucan (vægtprocent) |
|---|---|
| Termitomyces fuliginosus R. Heim | 1% |
| Boletus kolos R. Heim | 3% |
| Russula densifolia Secr. ex Gillet | 25% |
| Russula cyanoxantha (Schaeff.) Fr. | 29% |
| Russula alboareolata Hongo | 42% |
| Russula emetica (Schaeff.) Pers. | 10% |
| Russula delica Fr. | 38% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Amanita princeps hjørne & Bas | 9% |
| Amanita caesarea (Scop.) Pers. | 4% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Baker) Boedijn | 19% |
| Cortinarius claricolor var. turmalis (Fr.) Quadr | 13% |
| Termitomyces tylerianus Otieno | 12% |
| Termitomyces microcarpus (Berk. & Broome) R. Heim | 8% |
| Termitomyces eurhizus (Berk.) R. Heim | 7% |
| Polyporellus varius (Pers.) P. Karst. | 2% |
| Pycnoporus coccineus (Fr.) Bondartsev & Sanger | 45% |
| Lentinus squarrosulus Mont. | 2% |
| Daedaleopsis confragosa (Bolton) J. Schröt | 3% |
| Pycnoporus sanguineus (L.) Fr. | 35% |
| Amanita hemibapha (Berk. & Broome) Sacc. | 5% |
| Amanita virgineoides Bas | 1% |
| Agaricus silvaticus Schaeff. | 3% |
| Klorofyllum molybdites (G. Mey.) Massee | 3% |
| Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. | 33% |
| Amauroderma rugosum (Blume & T. Nees) Torrend | 4% |
| Suillus bovinus var. bovinus (Pers.) Kuntze | 1% |
| Clitocybe suaveolens (Schumach.) P. Kumm. S | 9% |
| Klerodermi verrucosum (Bull.) Pers. | 9% |
| Heimiella retispora (Pat. & C.F. Bager) | 19% |
| Lentinula edodes (Berk.) Pegler | 34% |
| Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst. | 35% |
beta-glucankoncentration af vilde svampearter Kilde: Boonyanuphap, Jaruntorn & Hansawasdi, Chanida. (2010). Rumlig fordeling af betaglucan indeholdende vilde svampesamfund i subtropisk tør skov, Thailand. Svampe mangfoldighed. 46. 29-42. 10.1007/s13225-010-0067-8.
Kvantificering af beta-glucanekstraktkoncentration af svampe
Beta-glucankoncentrationen efter ekstraktion kan kvantificeres ved hjælp af forskellige metoder afhængigt af typen af beta-glucan og analysens specifikke krav. Almindelige metoder til kvantificering af beta-glucankoncentrationen er anført nedenfor. Selvfølgelig afhænger valget af metode af faktorer som den krævede nøjagtighed og tilgængeligt udstyr.
-
Gravimetrisk metode
- Princip: Denne metode er baseret på udfældning af beta-glucaner med ethanol efterfulgt af tørring og vejning af bundfaldet.
- Fremgangsmåde: Prøven opløses i vand, behandles med ethanol for at udfælde beta-glucaner, hvorefter bundfaldet opsamles, tørres og vejes.
- Fordele: Enkel og udbredt.
- Begrænsninger: Mindre præcis sammenlignet med andre metoder.
-
kolorimetriske metoder
- Princip: Disse metoder involverer farvereaktioner med specifikke reagenser, der producerer en farveændring, der er proportional med beta-glucankoncentrationen.
-
Eksempler:
- Phenol-svovlsyremetode: Denne metode involverer behandling af prøven med koncentreret svovlsyre og phenol, som gør opløsningen orange. Farveintensiteten er proportional med beta-glucankoncentrationen.
- Anthrone-metode: Anthrone-reagens reagerer med beta-glucaner for at producere en blågrøn farve, og farveintensiteten måles.
- Fordele: Følsom og velegnet til analyse med høj kapacitet.
- Begrænsninger: Interferens fra andre forbindelser og behovet for specifikke reagenser.
-
Enzymatiske analyser
- Princip: Enzymatiske assays bruger enzymer som β-glucanase til at nedbryde beta-glucaner til enklere sukkerarter, og de frigivne sukkerarter kvantificeres.
- Fordele: Meget specifik og præcis.
- Begrænsninger: Kræver specialudstyr og reagenser.
-
Højtydende væskekromatografi (HPLC)
- Princip: HPLC separerer og kvantificerer forbindelser baseret på deres interaktioner med en kromatografisk søjle.
- Fremgangsmåde: Beta-glucaner hydrolyseres til monosaccharider, og de resulterende sukkerarter separeres og kvantificeres med HPLC.
- Fordele: Meget nøjagtig og velegnet til komplekse prøver.
- Begrænsninger: Kræver specialudstyr og ekspertise.
-
Specifikke immunoassays
- Princip: Immunoassays bruger antistoffer, der er specifikke for beta-glucaner, til at kvantificere deres koncentration.
-
Eksempler:
- ELISA (enzymbundet immunosorbentassay): I denne metode producerer et enzymbundet antistof en farveændring, når det binder til beta-glucaner.
- Lateral Flow Assays: Dette er hurtige tests, der giver et synligt resultat på en teststrimmel.
- Fordele: Høj specificitet og følsomhed.
- Begrænsninger: Kræver specifikke antistoffer og kan være dyrere.