Ultralydsdeacetylering af chitin til chitosan
Produktion af chitosan med ultralyd
Chitosan fremstilles ved N-deacetylering af chitin. Ved konventionel deacetylering sættes chitin i blød i vandige alkaliske opløsningsmidler (typisk 40 til 50% (w/w) NaOH). Iblødsætningsprocessen kræver høje temperaturer på 100 til 120ºC og er meget tidskrævende, mens udbyttet af chitosan pr. iblødsætningstrin er lavt. Anvendelsen af ultralyd med høj effekt intensiverer deacetyleringen af chitin betydeligt og giver et højt udbytte af chitosan med lav molekylvægt ved en hurtig behandling ved lavere temperatur. Ultralydsdeacetylering giver chitosan af overlegen kvalitet, som anvendes som ingrediens i fødevarer og lægemidler, som gødning og i mange andre industrielle anvendelser.
Ultralydsbehandling giver en exceptionel acetyleringsgrad (DA) for chitin ved at sænke acetyleringsgraden fra chitin med DA≥90 til chitosan med DA≤10.
Mange forskningsstudier bekræfter effektiviteten af ultralydsdeacetylering af chitin til chitosan. Weiss J. et al. (2008) fandt, at sonikering forbedrer omdannelsen af chitin til chitosan drastisk. Ultralydsbehandlingen af chitin medfører betydelige tidsbesparelser og reducerer den nødvendige procestid fra 12–24 timer til nogle få timer. Desuden kræves der mindre opløsningsmiddel for at opnå fuldstændig omdannelse, hvilket reducerer miljøpåvirkningen ved at skulle kassere og bortskaffe det brugte eller ureagerede opløsningsmiddel, dvs. koncentreret NaOH.
Deacetylering af chitin til chitosan fremmes ved sonikering
UIP4000hdT – ultralydssystem med en effekt på 4kW
Funktionsprincip for ultralydsbehandling af chitosan
Sonikering med høj effekt og lav frekvens (∼20–26kHz) skaber akustisk kavitation i væsker og opslæmninger. Ultralyd med høj effekt fremmer omdannelsen af chitin til chitosan, idet opløsningsmidlet (f.eks. NaOH) fragmenterer og trænger ind i de faste chitinpartikler, hvorved overfladearealet øges, og masseoverførslen mellem den faste og den flydende fase forbedres. Desuden skaber de høje forskydningskræfter fra ultralydskavitation frie radikaler, som øger reagensets (dvs. NaOH) reaktivitet under hydrolysen. Som en ikke-termisk behandlingsteknik forhindrer sonikering termisk nedbrydning og giver chitosan af høj kvalitet. Ultralyd forkorter den behandlingstid, der kræves for at udvinde chitin fra krebsdyr, og giver desuden chitin (og dermed efterfølgende chitosan) med højere renhed sammenlignet med traditionelle behandlingsbetingelser. Ved produktion af chitin og chitosan har ultralyd således potentiale til at sænke produktionsomkostningerne, reducere behandlingstiden, muliggøre bedre kontrol med produktionsprocessen og reducere miljøpåvirkningen fra procesaffaldet.
- Højere chitosanudbytte
- Overlegen kvalitet
- Reduceret tidsforbrug
- Lavere procestemperatur
- Øget effektivitet
- Nem og sikker betjening
- Miljøvenlig
Ultralydsdeacetylering af chitin til chitosan – protokol
1) Klargør chitinen:
Når krabbeskaller anvendes som udgangsmateriale, bør de vaskes grundigt for at fjerne eventuelle opløselige organiske stoffer og vedhæftende urenheder, herunder jord og protein. Derefter skal skalmaterialet tørres fuldstændigt (f.eks. ved 60ºC i 24h i en ovn). De tørrede skaller formales derefter (f.eks. med en hammermølle), deproteiniseres i et alkalisk medium (f.eks. NaOH med en koncentration på 0,125 til 5,0 M) og demineraliseres i syre (f.eks. fortyndet saltsyre).
2) Ultralydsdeacetylering
For at udføre en typisk ultralydsdeacetyleringsreaktion suspenderes beta-chitinpartikler (0,125 mm < d < 0,250 mm) i 40% (w/w) vandig NaOH med et forhold mellem beta-chitin og vandig NaOH-opløsning på 1/10(g mL-1), hvorefter suspensionen overføres til et dobbeltvægget glasbæger og sonikeres med en Hielscher UP400St ultralydshomogenisator. Følgende parametre (jf. Fiamingo et al. 2016) holdes konstante ved udførelse af en ultralydsdeacetyleringsreaktion af chitin: (i) ultralydssonde (sonotrode Hielscher S24d22D, spidsdiameter = 22 mm); (ii) pulstilstand for sonikering (IP = 0,5sec); (iii) ultralydsintensitet ved overfladen
(I = 52,6 W cm-2), (iv) reaktionstemperatur (60ºC ±1ºC), (v) reaktionstid (50 min), (vi) forhold mellem beta-chitinens vægt og volumenet af 40% (w/w) vandig natriumhydroxid (BCHt/NaOH = 1/10 g mL-1); (vii) volumen af beta-chitinsuspension (50mL).
Den første reaktion forløber i 50min under konstant magnetisk omrøring og afbrydes derefter ved hurtigt at afkøle suspensionen til 0ºC. Derefter tilsættes fortyndet saltsyre for at opnå pH 8,5, og prøven CHs1 isoleres ved filtrering, vaskes grundigt med deioniseret vand og tørres under omgivelsesbetingelser. Når den samme ultralydsdeacetylering gentages som et andet trin på CHs1, dannes prøven CHs2.
Scanningelektronmikroskopiske (SEM) billeder ved en forstørrelse på 100× af a) gladius, b) ultralydsbehandlet gladius, c) β-chitin, d) ultralydsbehandlet β-chitin og e) chitosan (kilde: Preto et al. 2017)
Fiamingo et al. fandt, at ultralydsdeacetylering af beta-chitin effektivt producerer chitosan med høj molekylvægt og lav acetyleringsgrad uden brug af tilsætningsstoffer, inert atmosfære eller lange reaktionstider. Selv om ultralydsdeacetyleringsreaktionen udføres under mildere betingelser – dvs. ved lav reaktionstemperatur sammenlignet med de fleste termokemiske deacetyleringer. Ultralydsdeacetylering af beta-chitin muliggør fremstilling af tilfældigt deacetyleret chitosan med varierende acetyleringsgrad (4% ≤ DA ≤ 37%), høj vægtgennemsnitlig molekylvægt (900.000 g mol-1 ≤ Mw ≤ 1.200.000 g mol-1 ) og lav dispersitet (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4) ved at udføre tre på hinanden følgende reaktioner (50 min/trin) ved 60ºC.
Ultralydsprocessorer med høj effekt fra laboratorie- til pilot- og industriskala.
Højtydende ultralydssystemer til produktion af chitosan
Fragmentering af chitin og deacetylering af chitin til chitosan kræver kraftigt og pålideligt ultralydsudstyr, som kan levere høje amplituder, giver præcis kontrol over procesparametrene og kan anvendes 24/7 under høj belastning og i krævende miljøer. Hielscher Ultrasonics’ produktsortiment dækker dine behov og dine proceskrav. Hielschers ultralydsapparater er højtydende systemer, der kan udstyres med tilbehør såsom sonotroder, boostere, reaktorer eller flowceller for optimalt at imødekomme dine procesbehov.
Med digitalt farvedisplay, mulighed for at forudindstille sonikeringsforløb, automatisk dataregistrering på et integreret SD-kort, fjernstyring via browser og mange flere funktioner sikres den højeste proceskontrol og brugervenlighed. Kombineret med robusthed og evnen til at modstå høj belastning er Hielschers ultralydssystemer din pålidelige arbejdshest i produktionen.
Fragmentering og deacetylering af chitin kræver kraftig ultralyd for at opnå den ønskede omdannelse og et chitosanslutprodukt af høj kvalitet. Især ved fragmentering af chitinflager er høje amplituder og forhøjede tryk afgørende. Hielscher Ultrasonics’ industrielle ultralydsprocessorer leverer let meget høje amplituder. Amplituder på op til 200µm kan opretholdes kontinuerligt ved drift 24/7. Til endnu højere amplituder fås specialtilpassede ultralydssonotroder. Hielschers ultralydssystemers effektkapacitet muliggør effektiv og hurtig deacetylering i en sikker og brugervenlig proces.
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet:
| Batchvolumen | Volumenstrøm | Anbefalede apparater |
|---|---|---|
| 1 til 500mL | 10 til 200mL/min | UP100H |
| 10 til 2000mL | 20 til 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 til 20L | 0,2 til 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 til 100L | 2 til 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 til 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | større | gruppe af UIP16000 |
Kontakt os! / Spørg os!
Litteratur/referencer
- Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Chitosanbaserede bionanokompositfilm fremstillet ved emulsionsteknik til konservering af fødevarer. Materials 2019, 12(3), 373.
- Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Omfattende deacetyleret chitosan med høj molekylvægt fra ultralydsassisteret deacetylering af beta-chitin i flere trin. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
- Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Sonokemisk assisteret omdannelse af chitin til chitosan, møde for projektledere under USDA’s nationale forskningsinitiativ, New Orleans, LA, 28. juni.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Temperaturens indflydelse under deacetylering af chitin til chitosan med højintensitetsultralyd som forbehandling, årsmøde for Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, 30. juni, 95-18.
- Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Indflydelsen af højintensitetsultralyd på fremskyndelse af omdannelsen af chitin til chitosan, årsmøde for Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, 30. juni, 95-17.
- Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladius og dets derivater som potentielle biosorbenter til marinedieselolie. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22.932–22.939.
- Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): En metode til fremstilling af chitosannanopartikler og -nanofibre ved nedbrydning af større strukturer. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
- Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Effektiv reduktion af chitosans molekylvægt med højintensitetsultralyd: Underliggende mekanisme og indflydelse af procesparametre. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
- Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Affald fra fisk og skaldyr: en kilde til fremstilling af kommercielt anvendelige chitin-/chitosanmaterialer. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.
Værd at vide
Hvordan fungerer ultralydsdeacetylering af chitin?
Når ultralyd med høj effekt og lav frekvens (f.eks. 20–26kHz) kobles ind i en væske eller opslæmning, udsættes væsken for vekslende højtryks- og lavtrykscyklusser, som skaber kompression og fortynding. Under disse vekslende højtryks- og lavtrykscyklusser dannes små vakuumbobler, som vokser over flere trykcyklusser. Når vakuumboblerne ikke kan absorbere mere energi, kollapser de voldsomt. Under denne bobleimplosion opstår der lokalt meget intense forhold: høje temperaturer på op til 5000K, tryk på op til 2000atm, meget høje opvarmnings-/afkølingshastigheder og trykforskelle. Da dynamikken i boblekollapset er hurtigere end masse- og varmeoverførslen, begrænses energien i det kollapsende hulrum til en meget lille zone, også kaldet et ”hot spot”. Implosionen af kavitationsboblen medfører også mikroturbulens, væskestråler med hastigheder på op til 280m/s og deraf følgende forskydningskræfter. Dette fænomen kaldes ultralydskavitation eller akustisk kavitation.
Dråber og partikler i den sonikerede væske påvirkes af disse kavitationskræfter, og når de accelererede partikler kolliderer med hinanden, knuses de ved indbyrdes partikelkollisioner. Akustisk kavitation er funktionsprincippet bag ultralydsformaling, dispergering, emulgering og sonokemi.
Ved deacetylering af chitin øger højintensitetsultralyd overfladearealet ved at aktivere overfladen og fremme masseoverførslen mellem partikler og reagens.
Chitosan
Chitosan er en modificeret, kationisk, ikke-toksisk kulhydratpolymer med en kompleks kemisk struktur, der består af β-(1,4)-glucosaminenheder som hovedbestanddel (>80%) og N-acetylglucosaminenheder (<20%), tilfældigt fordelt langs kæden. Chitosan fremstilles af chitin gennem kemisk eller enzymatisk deacetylering. Deacetyleringsgraden (DA) bestemmer indholdet af frie aminogrupper i strukturen og bruges til at skelne mellem chitin og chitosan. Chitosan har god opløselighed i moderate opløsningsmidler såsom fortyndet eddikesyre og har flere frie amingrupper som aktive steder. Dette giver chitosan fordele frem for chitin i mange kemiske reaktioner.
Chitosan værdsættes for sin fremragende biokompatibilitet og biologiske nedbrydelighed, sin ikke-toksicitet, gode antimikrobielle aktivitet (mod bakterier og svampe), uigennemtrængelighed for ilt og filmdannende egenskaber. I modsætning til chitin har chitosan den fordel, at det er vandopløseligt og dermed lettere at håndtere og anvende i formuleringer.
Chitin er det næstmest udbredte polysakkarid efter cellulose, og dets store forekomst gør det til et billigt og bæredygtigt råmateriale.
Produktion af chitosan
Chitosan produceres i en proces med to trin. I det første trin deproteiniseres, demineraliseres og renses råmaterialet, såsom krebsdyrskaller (dvs. rejer, krabber og hummere), for at opnå chitin. I det andet trin behandles chitin med en stærk base (f.eks. NaOH) for at fjerne acetylsidekæder og dermed opnå chitosan. Den konventionelle proces til produktion af chitosan er kendt for at være meget tidskrævende og omkostningstung.
Chitin
Chitin (C8H13O5N)n er en ligekædet polymer af β-1,4-N-acetylglucosamin og inddeles i α-, β- og γ-chitin. Som et derivat af glucose er chitin en hovedbestanddel af leddyrs ydre skeletter, såsom hos krebsdyr og insekter, af bløddyrs raspetunger, blæksprutters næb samt skæl hos fisk og lissamfibier, og det findes også i svampes cellevægge. Chitins struktur er sammenlignelig med celluloses og danner krystallinske nanofibriller eller nåleformede krystaller. Cellulose er verdens mest udbredte polysakkarid, efterfulgt af chitin som det næstmest udbredte polysakkarid.
Glucosamin
Glucosamin (C6H13NO5) er et aminosukker og en vigtig forløber i den biokemiske syntese af glykosylerede proteiner og lipider. Glucosamin er en naturligt udbredt forbindelse, der indgår i strukturen af begge polysakkarider, chitosan og chitin, hvilket gør glucosamin til et af de mest udbredte monosakkarider. Størstedelen af det kommercielt tilgængelige glucosamin fremstilles ved hydrolyse af krebsdyrs ydre skeletter, dvs. krabbe- og hummerskaller.
Glucosamin anvendes hovedsageligt som kosttilskud i form af glucosaminsulfat, glucosaminhydrochlorid eller N-acetylglucosamin. Kosttilskud med glucosaminsulfat indtages oralt til behandling af en smertefuld tilstand forårsaget af inflammation, nedbrydning og til sidst tab af brusk (slidgigt).