Produktion af kitin og kitosan fra svampe

Sonikering er en yderst effektiv metode til at frigøre kitin og kitosan fra svampekilder såsom paddehatte. Kitin og kitosan skal depolymeriseres og deacetyleres under den efterfølgende forarbejdning for at opnå en biopolymer af høj kvalitet. Ultralydsassisteret depolymerisering og deacetylering er en yderst virkningsfuld, enkel og hurtig teknik, som resulterer i kitosaner af høj kvalitet med høj molekylvægt og overlegen biotilgængelighed.

Kitin og kitosan fra svampe ved hjælp af sonikering

Spiselige svampe og medicinske svampe såsom Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi eller reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (champignoner), Hericium erinaceus (pindsvinepigsvamp), Cordyceps sinensis (larvesvamp), Grifola frondosa (grifola), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, broget læderporesvamp) og mange andre svampearter anvendes i vid udstrækning som fødevarer og til ekstraktion af bioaktive forbindelser. Disse svampe samt forarbejdningsrester (svampeaffald) kan anvendes til at producere kitosan. Sonikering fremmer ikke kun frigørelsen af kitin fra svampenes cellevægsstruktur, men driver også omdannelsen af kitin til værdifuldt kitosan gennem ultralydsassisteret depolymerisering og deacetylering.

Denne video demonstrerer højeffektiv ekstraktion af pindsvinepigsvamp med ultralydshomogenisatoren Hielscher UP200Ht. Ultralydsekstraktion er den ideelle teknik til at fremstille fuldspektrumekstrakter af høj kvalitet, som indeholder polysakkarider såsom betaglukaner samt hericenoner og erinaciner.

 

Intens sonikering med et ultralydssystem af sondetypen er en teknik, der anvendes til at fremme depolymeriseringen og deacetyleringen af kitin, hvilket fører til dannelse af kitosan. Kitin er et naturligt forekommende polysaccharid, der findes i krebsdyrs og insekters eksoskeletter samt i cellevæggene hos visse svampe. Kitosan fremstilles ud fra kitin ved at fjerne acetylgrupperne fra kitinmolekylet.

Ultralydsprocedure til omdannelse af svampekitin til kitosan

Når intens sonikering anvendes til produktion af kitosan fra kitin, sonikeres en kitinsuspension med ultralydsbølger med høj intensitet og lav frekvens, typisk i området fra 20 kHz til 30 kHz. Processen genererer intens akustisk kavitation, hvilket betegner dannelsen, væksten og kollapset af mikroskopiske vakuumbobler i væsken. Kavitation genererer lokalt ekstremt høje forskydningskræfter, høje temperaturer (op til flere tusinde grader Celsius) og tryk (op til flere hundrede atmosfærer) i væsken omkring kavitationsboblerne. Disse ekstreme forhold bidrager til nedbrydningen af kitinpolymeren og den efterfølgende deacetylering.
 

 

Depolymerisering af kitin med ultralyd

Depolymeriseringen af kitin sker gennem de kombinerede virkninger af mekaniske kræfter, såsom mikrostrømning og væskejetstråler, samt gennem ultralydsinitierede kemiske reaktioner, der fremkaldes af frie radikaler og andre reaktive specier dannet under kavitation. De højtryksbølger, der genereres under kavitation, udsætter kitinkæderne for forskydningsspænding, hvilket resulterer i spaltning af polymeren til mindre fragmenter.

Deacetylering af kitin med ultralyd

Ud over depolymerisering fremmer intens sonikering også deacetyleringen af kitin. Deacetylering indebærer fjernelse af acetylgrupper fra kitinmolekylet, hvilket fører til dannelse af kitosan. Intens ultralydsenergi, især de høje temperaturer og tryk, der genereres under kavitation, accelererer deacetyleringsreaktionen. De reaktive forhold, som kavitation skaber, hjælper med at bryde acetylbindingerne i kitin, hvilket resulterer i frigørelse af eddikesyre og omdannelse af kitin til kitosan.
Samlet set forbedrer intens sonikering både depolymeriserings- og deacetyleringsprocesserne ved at tilføre den nødvendige mekaniske og kemiske energi til at nedbryde kitinpolymeren og lette omdannelsen til kitosan. Denne teknik tilbyder en hurtig og effektiv metode til produktion af kitosan fra kitin med talrige anvendelser i forskellige brancher, herunder lægemiddelindustrien, landbruget og biomedicinsk teknologi.

Industriel produktion af kitosan fra svampe med effektultralyd

Kommerciel produktion af kitin og kitosan er hovedsageligt baseret på affald fra de marine erhverv (dvs. fiskeri, høst af skaldyr osv.). Forskellige råmaterialekilder resulterer i forskellige kitin- og kitosankvaliteter, hvilket medfører udsving i produktion og kvalitet på grund af sæsonbestemte variationer i fiskeriet. Desuden har kitosan fra svampekilder efter sigende overlegne egenskaber såsom ensartet polymerlængde og større opløselighed sammenlignet med kitosan fra marine kilder. (jf. Ghormade et al., 2017) For at kunne levere ensartet kitosan er ekstraktion af kitin fra svampearter blevet et stabilt produktionsalternativ. Produktion af kitin og kitosan fra svampe kan nemt og pålideligt gennemføres ved hjælp af ultralydsteknologi til ekstraktion og deacetylering. Intens sonikering bryder cellestrukturer op for at frigøre kitin og fremmer masseoverførsel i vandige opløsningsmidler for at opnå overlegent kitinudbytte og ekstraktionseffektivitet. Efterfølgende deacetylering med ultralyd omdanner kitinen til det værdifulde kitosan. Både ekstraktion af kitin med ultralyd og deacetylering til kitosan kan skaleres lineært til ethvert kommercielt produktionsniveau.

Forskningsresultater for deacetylering af kitin og kitosan med ultralyd

Zhu et al. (2018) konkluderer i deres undersøgelse, at deacetylering med ultralyd har vist sig at være et afgørende gennembrud, der omdanner β-kitin til kitosan med 83–94% deacetylering ved reducerede reaktionstemperaturer. Billedet til venstre viser et SEM-billede af ultralydsdeacetyleret kitosan (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (billede og undersøgelse: © Zhu et al., 2018)
I deres protokol blev en NaOH-opløsning (20 w/v %) fremstillet ved at opløse NaOH-flager i deioniseret vand. Den alkaliske opløsning blev derefter tilsat GLSP-sediment (0,5 g) ved et forhold mellem faststof og væske på 1:20 (g: mL) i et centrifugerør. Kitosan blev tilsat NaCl (40 mL, 0,2 M) og eddikesyre (0,1 M) ved et volumenforhold mellem opløsningerne på 1:1. Suspensionen blev derefter udsat for ultralyd ved en mild temperatur på 25°C i 60 min med et ultralydsapparat af sondetypen (250W, 20kHz). (jf. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) fandt, at nedbrydningshastigheden for kitosanopløsninger sjældent påvirkes af koncentrationerne af den syre, der anvendes til at opløse polymeren, og i høj grad afhænger af temperaturen, ultralydsbølgernes intensitet og ionstyrken i de medier, der anvendes til at opløse polymeren. (jf. Pandit et al., 2021)
 
I en anden undersøgelse anvendte Zhu et al. (2019) sporepulver fra Ganoderma lucidum som svamperåmateriale og undersøgte ultralydsassisteret deacetylering samt virkningerne af procesparametre såsom sonikeringstid, forholdet mellem faststof og væske, NaOH-koncentration og bestrålingseffekt på kitosans deacetyleringsgrad (DD). Den højeste DD-værdi blev opnået ved følgende ultralydsparametre: 20 min sonikering ved 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Overflademorfologien, de kemiske grupper, den termiske stabilitet og krystalliniteten af det kitosan, der blev fremstillet med ultralyd, blev undersøgt ved hjælp af SEM, FTIR, TG og XRD. Forskerholdet rapporterer en betydelig forøgelse af deacetyleringsgraden (DD), den dynamiske viskositet ([η]) og molekylvægten (Mv¯) af det ultralydsfremstillede kitosan. Resultaterne understregede, at teknikken til deacetylering af svampe med ultralyd er en yderst virkningsfuld produktionsmetode til kitosan, som er egnet til biomedicinske anvendelser. (jf. Zhu et al., 2019)

Overlegen kitosankvalitet med depolymerisering og deacetylering med ultralyd

Ultralydsdrevne processer til ekstraktion og depolymerisering af kitin / kitosan kan styres præcist, og ultralydsprocesparametrene kan tilpasses råmaterialerne og den tilsigtede slutproduktkvalitet (f.eks. molekylvægt og deacetyleringsgrad). Dette gør det muligt at tilpasse ultralydsprocessen til eksterne faktorer og indstille optimale parametre for overlegne resultater og effektivitet.
Ultralydsdeacetyleret kitosan udviser fremragende biotilgængelighed og biokompatibilitet. Når kitosanbiopolymerer fremstillet med ultralyd sammenlignes med termisk fremstillet kitosan med hensyn til biomedicinske egenskaber, udviser det ultralydsfremstillede kitosan betydeligt forbedret levedygtighed af fibroblaster (L929-celler) og øget antibakteriel aktivitet over for både Escherichia coli (E. coli) og Staphylococcus aureus (S. aureus).
(jf. Zhu et al., 2018)
 

Højtydende ultralydsudstyr til forarbejdning af kitin og kitosan

Fragmentering af kitin og deacetylering af kitin til kitosan kræver kraftigt og pålideligt ultralydsudstyr, der kan levere høje amplituder, giver mulighed for præcis styring af procesparametrene og kan drives 24/7 under høj belastning og i krævende miljøer. Hielscher Ultrasonics’ produktsortiment opfylder pålideligt disse krav. Ud over enestående ultralydsydelse har Hielschers ultralydsapparater høj energieffektivitet, hvilket er en betydelig økonomisk fordel – især når de anvendes i kommerciel produktion i stor skala.
Hielschers ultralydsapparater er højtydende systemer, der kan udstyres med tilbehør såsom sonotroder, boostere, reaktorer eller flowceller for at opfylde dine procesbehov optimalt. Med digitalt farvedisplay, mulighed for at forudindstille sonikeringsforløb, automatisk dataregistrering på et integreret SD-kort, fjernstyring via browser og mange flere funktioner sikrer Hielschers ultralydsapparater den højeste proceskontrol og brugervenlighed. Kombineret med robusthed og kapacitet til at håndtere høj belastning er Hielschers ultralydssystemer din pålidelige arbejdshest i produktionen. Fragmentering og deacetylering af kitin kræver kraftig ultralyd for at opnå den tilsigtede omdannelse og et endeligt kitosanprodukt af høj kvalitet. Især til fragmentering af kitinflager og trinene depolymerisering / deacetylering er høje amplituder og forhøjede tryk afgørende. Hielscher Ultrasonics’ industrielle ultralydsprocessorer leverer nemt meget høje amplituder. Amplituder på op til 200µm kan opretholdes kontinuerligt under 24/7-drift. Til endnu højere amplituder fås specialtilpassede ultralydssonotroder. Hielschers ultralydssystemers effektkapacitet muliggør effektiv og hurtig depolymerisering og deacetylering i en sikker og brugervenlig proces.
 

Tabellen nedenfor giver dig en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige forarbejdningskapacitet:

---

---

Synergistisk kitinbehandling forbedret med sonikering

For at overvinde ulemperne (dvs. lav effektivitet, høje energiomkostninger, lang forarbejdningstid og giftige opløsningsmidler) ved traditionel kemisk og enzymatisk deacetylering af kitin er ultralyd med høj intensitet blevet integreret i forarbejdningen af kitin og kitosan. Sonikering med høj intensitet og de deraf følgende virkninger af akustisk kavitation fører til hurtig spaltning af polymerkæder og reducerer polydispersiteten, hvorved syntesen af kitosan fremmes. Desuden intensiverer ultralydens forskydningskræfter masseoverførslen i opløsningen, så kemiske, hydrolytiske eller enzymatiske reaktioner forbedres. Ultralydsbehandling af kitin kan kombineres med eksisterende teknikker til kitinforarbejdning såsom kemiske metoder, hydrolyse eller enzymatiske procedurer.

Ultralydsassisteret kemisk deacetylering og depolymerisering

Da kitin er en ikke-reaktiv og uopløselig biopolymer, skal den gennemgå procestrinene demineralisering, deproteinisering og depolymerisering / deacetylering for at opnå opløseligt og bioaccessibelt kitosan. Disse procestrin omfatter behandling med stærke syrer såsom HCl og stærke baser såsom NaOH og KOH. Da disse konventionelle procestrin er ineffektive, langsomme og kræver store energimængder, forbedrer procesintensivering ved sonikering kitosanproduktionen betydeligt. Anvendelsen af effektultralyd øger kitosanudbyttet og kvaliteten, forkorter processen fra dage til få timer, muliggør mildere opløsningsmidler og gør hele processen mere energieffektiv.

Deproteinisering af kitin forbedret med ultralyd

Vallejo-Dominguez et al. (2021) fandt i deres undersøgelse af deproteinisering af kitin, at “anvendelsen af ultralyd til produktion af biopolymerer reducerede både proteinindholdet og kitins partikelstørrelse. Kitosan med høj deacetyleringsgrad og middelhøj molekylvægt blev fremstillet med ultralydsassistance.”

Ultralydshydrolyse til depolymerisering af kitin

Ved kemisk hydrolyse anvendes enten syrer eller alkalier til at deacetylere kitin, men alkalisk deacetylering (f.eks. natriumhydroxid NaOH) er mere udbredt. Syrehydrolyse er en alternativ metode til traditionel kemisk deacetylering, hvor organiske syreopløsninger anvendes til at depolymerisere kitin og kitosan. Syrehydrolysemetoden anvendes hovedsageligt, når molekylvægten af kitin og kitosan skal være ensartet. Denne konventionelle hydrolyseproces er kendt for at være langsom og energi- og omkostningskrævende. Behovet for stærke syrer, høje temperaturer og tryk er faktorer, der gør den hydrolytiske kitosanproces til en meget dyr og tidskrævende procedure. De anvendte syrer kræver efterfølgende processer såsom neutralisering og afsaltning.
Ved at integrere ultralyd med høj effekt i hydrolyseprocessen kan temperatur- og trykkravene til den hydrolytiske spaltning af kitin og kitosan sænkes betydeligt. Desuden muliggør sonikering lavere syrekoncentrationer eller anvendelse af mildere syrer. Dette gør processen mere bæredygtig, effektiv, omkostningseffektiv og miljøvenlig.

Ultralydsassisteret kemisk deacetylering

Kemisk nedbrydning og deacetylering af kitin og kitosan opnås hovedsageligt ved at behandle kitin eller kitosan med mineralsyrer (f.eks. saltsyre HCl), natriumnitrit (NaNO₂) eller hydrogenperoxid (H₂O₂). Ultralyd øger deacetyleringshastigheden og forkorter dermed den reaktionstid, der kræves for at opnå den tilsigtede deacetyleringsgrad. Dette betyder, at sonikering reducerer den nødvendige forarbejdningstid fra 12–24 timer til få timer. Desuden muliggør sonikering betydeligt lavere kemikaliekoncentrationer, for eksempel 40% (w/w) natriumhydroxid ved brug af sonikering, mens 65% (w/w) er nødvendigt uden brug af ultralyd.

Ultralydsenzymatisk deacetylering

Selvom enzymatisk deacetylering er en mild og miljøvenlig forarbejdningsform, er den urentabel med hensyn til effektivitet og omkostninger. På grund af kompleks, arbejdskrævende og dyr efterfølgende isolering og oprensning af enzymer fra slutproduktet anvendes enzymatisk deacetylering af kitin ikke i kommerciel produktion, men kun i videnskabelige forskningslaboratorier.
Ultralydsforbehandling før enzymatisk deacetylering fragmenterer kitinmolekyler og øger derved overfladearealet, så en større overflade bliver tilgængelig for enzymerne. Højtydende sonikering hjælper med at forbedre enzymatisk deacetylering og gør processen mere økonomisk.