Sonikering-assisteret Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) er en effektiv metode til at inficere planteceller med fremmede gener ved hjælp af Agrobacterium som transportør. Ultralydkavitation forårsager sonoporation, som kan beskrives som målrettet mikro-såring af plantevæv. Via disse ultralyd skaber mikrosår, DNA og DNA vektorer kan effektivt transporteres ind i cellematrixen.

Sonoporation – Ultralyd forbedret celletransformation

Når lavfrekvent ultralyd (ca. 20 kHz) påføres cellesuspensioner, forårsager virkningerne af akustisk kavitation en forbigående membranpermeabilisering på cellevæv. Denne ultralydseffekt er kendt som sonoporation og bruges til genoverførsel til celler eller væv.
Fordele ved ultralydbehandling er baseret på dets ikke-termiske mekaniske arbejdsprincip, hvilket gør sonikering ofte mere alsidig og mindre afhængig af celletyper. Den alsidige anvendelse af sonoporation åbner mulighed for udnyttelse af transgene planter, som har et betydeligt potentiale i bioproduktionen af komplekse humane terapeutiske proteiner. Sådanne plantebaserede bioreaktorer kan let manipuleres genetisk, forhindre potentiel forurening med humane patogener, ikke beskadige transformationsmedierende bakterier (f.eks. Agrobacterium) og er en billig, effektiv metode til biosyntese.

Ultralyd-assisteret celletransformation

Sonikering er en teknik, der anvender lavfrekvente ultralydbølger til at agitere partikler i opløsning, for at blande opløsninger og derved øge hastigheden af masseoverførsel og opløsning. Samtidig kan sonikering fjerne opløste gasser fra væsker. I plantetransformation vil sonikering forårsage dannelse af mikrovæv på plantevæv og forbedre leveringen af nøgent DNA i plantens protoplast.

Til genetisk transformation er Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) den foretrukne metode og har en signifikant højere effektivitet end sonikering, der bruges til at overføre nøgne DNA- og DNA-vektorer direkte ind i protoplasten. Talrige undersøgelser har vist, at sonikering assisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) kan bruges til at fremkalde mekanisk forstyrrelse og dannelse af sår på planteceller ved hjælp af ultralydbølger og den resulterende akustiske kavitation. En kort ultralydsbehandling skaber mikrosår på overfladen af eksplanter. Da de sårede celler vil tillade agrobakteriens indtrængning i den dybere del af plantevæv, hvilket øger sandsynligheden for, at planteceller bliver inficeret. Derudover forbedrer de udskillede phenolforbindelser transformationen. De ultralydsgenererede mikrosår gør eksplantindtrængning af bakterier også mere gennemførlig. SAAT blev med succes anvendt til genetisk transformation i plantearter, der især betragtes som resistente over for Agrobacterium.
At være en meget enkel og billig metode samt den betydelige forbedring af Agrobacterium-medieret genoverførsel er de største fordele ved SAAT. Bortset fra en vellykket anvendelse af SAAT i omdannelsen af Chenopodium rubrum L. og Beta vulgaris L. er denne tilgang også blevet anvendt i produktionen af rekombinante Escherichia coli vildtype varmelabil holotoksin og Escherichia coli mutant LT-vaccineadjuvanser i Nicotiana tabacum, hvor de højeste systemiske LT-B-specifikke IgG-titre blev påvist hos fugle.
(jf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka og R. Baranski, 2014)

Generel procedure for genoverførsel via sonoporation i planteceller

1. Fremstilling af genetisk materiale: Begynd med at forberede det genetiske materiale, du vil introducere i plantecellerne. Dette kan være plasmid-DNA, RNA eller andre nukleinsyrer.
2. Isolering af planteceller: Isoler de planteceller, du vil målrette mod. Afhængigt af dit eksperiment kan disse celler isoleres fra plantevæv eller kulturer.
3. Celle suspension: Suspender plantecellerne i et passende medium eller buffer. Dette er afgørende for at sikre, at cellerne er sunde og i en tilstand, der fremmer genoptagelse.
4. Opsæt din Sonicator: Forbered din sonde-type sonikator ved sonikering forudindstillede parametre som amplitude, tid, energi og temperatur. Dyp ultralydssonden i cellesuspensionen.
5. Lydbehandling: Start sonikeringsproceduren. Den hurtige svingning af sondespidsen genererer kavitationsbobler i væsken. Disse bobler udvides og kollapser på grund af ultralydbølgerne, hvilket skaber mekaniske kræfter og mikrostreaming i suspensionen.
6. Sonoporation: De mekaniske kræfter og mikrostreaming, der genereres ved kavitation, skaber midlertidigt porer og huller i membranerne i plantecellerne. Det genetiske materiale, der er til stede i suspensionen, kan komme ind i plantecellerne gennem disse porer.
7. Inkubation: Efter sonoporationsbehandlingen inkuberes plantecellerne for at give dem mulighed for at genvinde og stabilisere deres membraner. Dette er et afgørende skridt for at sikre celleoverlevelse og vellykket genoverførsel.

Genoverførsel via agrobakterier eller liposomer

Der er to almindelige former for transfektering af plantecelle. De bruger enten agrobacterium, en slægt af gramnegative bakterier, eller liposomer som bærer af det genetiske materiale.

• Agrobacterium-medieret sonoporation: Agrobacterium tumefaciens er en bakterie, der almindeligvis anvendes i plantegenteknologi. I denne metode indføres plasmid-DNA indeholdende det ønskede gen i Agrobacterium, som derefter blandes med planteceller. Cellesuspensionen udsættes for sonoporation ved anvendelse af en sonde-type sonikator. Ultralydsenergien forbedrer overførslen af det genetiske materiale fra Agrobacterium til plantecellerne. Denne metode anvendes i vid udstrækning til genetisk modifikation af planter.
• Liposom-medieret sonoporation: Liposomer er lipidbaserede vesikler, der kan bære genetisk materiale. I denne metode blandes liposomer fyldt med plasmid-DNA eller andre nukleinsyrer med planteceller. Sonoporation ved hjælp af en sonde-type sonikator er ansat til at lette optagelsen af liposomer af planteceller. Ultralydet forstyrrer lipiddobbeltlagene i liposomerne og frigiver det genetiske materiale i plantecellerne. Denne fremgangsmåde er nyttig til forbigående genekspressionsundersøgelser i planteceller.

Videnskabeligt bevist fordele ved sonikering-assisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT)

Sonikering-assisteret Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) er blevet anvendt på adskillige plantearter. En kort og relativt mild ultralydsbehandling af plantecellekulturer forårsager sonoporation, som efterfølgende tillader en dyb penetration af Agrobacterium som gentransportør. Nedenfor kan du læse eksemplariske undersøgelser, der viser de gavnlige virkninger af SAAT.

Ultralydassisteret transformation af Ashwagandha

For at forbedre transformationseffektiviteten i W. somnifera (kendt som ashwagandha eller vinterkirsebær) undersøgte Dehdashti og kolleger (2016) brugen af acetosyringon (AS) og sonikering.
Acetosyringon (AS) blev tilsat i tre faser: Agrobacterium flydende kultur, Agrobacterium infektion og co-kultur af eksplanter med Agrobacterium. Tilsætningen af 75 μM AS til Agrobacterium flydende kultur viste sig at være optimal til induktion af vir-gener.
Den yderligere anvendelse af sonikering (SAAT) resulterede i højeste genekspression. GusA genekspression i behårede rødder viste sig at være bedst, når bladene og skudspidserne blev sonikeret i henholdsvis 10 og 20'erne. Transformationseffektiviteten af den forbedrede protokol blev registreret henholdsvis 66,5 og 59,5% i tilfælde af blad- og skudspidsforplantninger. Sammenlignet med andre protokoller viste transformationseffektiviteten af denne forbedrede protokol sig at være 2,5 gange højere for blade og 3,7 gange mere for skudspidser. Southern blot-analyser bekræftede 1-2 kopier af gusA-transgenet i linjerne W1-W4, mens 1-4 transgene kopier blev påvist i linjen W5 genereret af den forbedrede protokol.

Effekt af varigheden af sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) på transformationsfrekvensen af W. somnifera blad (a) og skudspids (b) eksplanter
(undersøgelse og grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultralydassisteret transformation af bomuld

Hussain et al. (2007) demonstrere de gavnlige virkninger af sonikering-assisteret bomuldstransformation. Akustisk kavitation forårsaget af lavfrekvent ultralyd skaber mikrosår på og under overfladen af plantevæv (sonoporation) og gør det muligt for Agrobacterium at rejse dybere og fuldstændigt gennem plantevævet. Denne sårende måde øger sandsynligheden for at inficere planteceller, der ligger dybere i vævet. For at evaluere transformationseffektiviteten af SAAT blev GUS-genekspression målt. GUS-reportersystemet er et reportergensystem, der især er nyttigt inden for plantemolekylærbiologi og mikrobiologi. Justering af forskellige SAAT-parametre blev GUS forbigående ekspression i bomuld ved hjælp af modne embryoner som eksplantation signifikant forbedret. GUS blev først påvist 24 timer efter inkubation af eksplantationerne, og ved 48 timer var GUS-ekspression meget intens, hvilket tjente som en nyttig indikator for en vellykket transformation af bomuldseksplanterne efter sonikering assisteret Agrobacterium medieret transformation (SAAT). Sammenligningen af forskellige transformationsteknikker (nemlig biolistisk, Agro, BAAT, SAAT), sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) viste langt de bedste resultater af transformation.

Valg af transformationsprocedure på grundlag af forbigående ekspression af GUS. Sonikering-assisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) viser en signifikant højere forbigående ekspression.
(undersøgelse og grafik: © Hussain et al., 2007)

Højtydende ultralydsløsninger til sonoporation og SAAT

Hielscher Ultrasonics har lang tid erfaring med udvikling og fremstilling af højtydende ultralydapparater til laboratorier, forskningsfaciliteter samt industriel produktion med meget høje gennemstrømninger. Inden for mikrobiologi og life science tilbyder Hielscher forskellige løsninger til at imødekomme forskellige krav, der er nødvendige for specifikke væv og deres behandlinger. Til samtidig ultralydbehandling af adskillige prøver tilbyder Hielscher UIP400MTP til multiwell plader, VialTweeter til sonikering af op til 10 hætteglas (f.eks. Eppendorf rør) eller ultralyd CupHorn. Probe-type ultralydapparater er tilgængelige fra 50 til 400 watt som lab homogenisatorer, mens industrielle systemer dækker effektområdet fra 500 watt til 16kW.
Kontakt os venligst og fortæl os om dine ansøgnings- og proceskrav. Vores velerfarne personale vil med glæde anbefale den mest egnede ultralydsapparat til din biologiske proces.
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af den omtrentlige forarbejdningskapacitet hos vores ultralydapparater: