Genetisk transformation af planteceller ved hjælp af ultralyd

Sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) er en effektiv metode til at inficere planteceller med fremmede gener ved at bruge Agrobacterium som transportør. Ultralydskavitation forårsager sonoporation, som kan beskrives som målrettet dannelse af mikrosår i plantevæv. Gennem disse mikrosår, der dannes ved hjælp af ultralyd, kan DNA og DNA-vektorer effektivt transporteres ind i cellematrixen.

Sonoporation – ultralydsforstærket celletransformation

Når lavfrekvent ultralyd (ca. 20kHz) anvendes på cellesuspensioner, medfører virkningerne af akustisk kavitation en midlertidig permeabilisering af membraner i cellevæv. Denne ultralydseffekt kaldes sonoporation og anvendes til genoverførsel til celler eller væv.
Fordelene ved ultralydsbehandling bygger på dens ikke-termiske mekaniske virkemåde, som ofte gør sonikering mere alsidig og mindre afhængig af celletyper. De alsidige anvendelsesmuligheder for sonoporation åbner mulighed for at udnytte transgene planter, som har et betydeligt potentiale inden for bioproduktion af komplekse humane terapeutiske proteiner. Sådanne plantebaserede bioreaktorer kan let manipuleres genetisk, forhindrer potentiel kontaminering med humane patogener, beskadiger ikke transformationsmedierende bakterier (f.eks. Agrobacterium) og er en billig og effektiv metode til biosyntese.

Ultralydsassisteret celletransformation

Sonikering er en teknik, der anvender lavfrekvente ultralydsbølger til at sætte partikler i en opløsning i bevægelse og blande opløsninger, hvorved hastigheden af masseoverførsel og opløsning øges. Samtidig kan sonikering fjerne opløste gasser fra væsker. Ved plantetransformation vil sonikering medføre dannelse af mikrosår i plantevævet og forbedre tilførslen af nøgent DNA til planteprotoplasten.

Til genetisk transformation er sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) den foretrukne metode og har en betydeligt højere effektivitet end sonikering, der anvendes til at overføre nøgent DNA og DNA-vektorer direkte til protoplasten. Talrige undersøgelser har vist, at sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) kan anvendes til at fremkalde mekanisk nedbrydning og dannelse af sår på planteceller ved hjælp af ultralydsbølger og den deraf følgende akustiske kavitation. En kort ultralydsbehandling skaber mikrosår på overfladen af eksplanter. De sårede celler vil tillade Agrobacterium at trænge ind i de dybere dele af plantevævet, hvilket øger sandsynligheden for, at planteceller bliver inficeret. Desuden forbedrer de udskilte fenolforbindelser transformationen. De mikrosår, der dannes ved hjælp af ultralyd, gør det også lettere for bakterier at trænge ind i eksplanter. SAAT er med succes blevet anvendt til genetisk transformation af plantearter, der især anses for at være resistente over for Agrobacterium.
De væsentligste fordele ved SAAT er, at metoden er meget enkel og billig, samt at den forbedrer Agrobacterium-medieret genoverførsel betydeligt. Ud over den vellykkede anvendelse af SAAT til transformation af Chenopodium rubrum L. og Beta vulgaris L. er denne tilgang også blevet anvendt til produktion af rekombinant varmelabilt holotoksin fra vildtype Escherichia coli og LT-vaccineadjuvanser fra mutant Escherichia coli i Nicotiana tabacum, hvor de højeste systemiske LT-B-specifikke IgG-titre blev påvist hos fugle.
(jf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka og R. Baranski, 2014)

Generel fremgangsmåde til genoverførsel via sonoporation i planteceller

1. Forberedelse af genetisk materiale: Begynd med at forberede det genetiske materiale, du ønsker at indføre i plantecellerne. Dette kan være plasmid-DNA, RNA eller andre nukleinsyrer.
2. Isolering af planteceller: Isolér de planteceller, du ønsker at målrette behandlingen mod. Afhængigt af dit forsøg kan disse celler isoleres fra plantevæv eller kulturer.
3. Cellesuspension: Suspendér plantecellerne i et egnet medium eller en egnet buffer. Dette er afgørende for at sikre, at cellerne er sunde og i en tilstand, der fremmer genoptagelse.
4. Opsætning af dit sonikeringsapparat: Klargør dit sonikeringsapparat med sonde ved at forudindstille sonikeringsparametre såsom amplitude, tid, energi og temperatur. Nedsænk ultralydssonden i cellesuspensionen.
5. Sonikering: Start sonikeringsproceduren. Sondespidsens hurtige svingninger danner kavitationsbobler i væsken. Disse bobler udvider sig og kollapser som følge af ultralydsbølgerne og skaber mekaniske kræfter og mikrostrømning i suspensionen.
6. Sonoporation: De mekaniske kræfter og den mikrostrømning, som kavitationen frembringer, skaber midlertidige porer og huller i plantecellernes membraner. Det genetiske materiale, der er til stede i suspensionen, kan trænge ind i plantecellerne gennem disse porer.
7. Inkubation: Efter sonoporationsbehandlingen inkuberes plantecellerne, så de kan komme sig og stabilisere deres membraner. Dette er et afgørende trin for at sikre celleoverlevelse og vellykket genoverførsel.

Genoverførsel via Agrobacterium eller liposomer

Der findes to almindelige metoder til transfektion af planteceller. De anvender enten agrobacterium, en slægt af gramnegative bakterier, eller liposomer som bærer af det genetiske materiale.

• Agrobacterium-medieret sonoporation: Agrobacterium tumefaciens er en bakterie, der almindeligvis anvendes i genteknologi til planter. Ved denne metode indføres plasmid-DNA, der indeholder det ønskede gen, i Agrobacterium, som derefter blandes med planteceller. Cellesuspensionen udsættes for sonoporation ved hjælp af et sonikeringsapparat med sonde. Ultralydsenergien forbedrer overførslen af det genetiske materiale fra Agrobacterium til plantecellerne. Denne metode anvendes i vid udstrækning til genetisk modificering af planter.
• Liposommedieret sonoporation: Liposomer er lipidbaserede vesikler, der kan bære genetisk materiale. Ved denne metode blandes liposomer fyldt med plasmid-DNA eller andre nukleinsyrer med planteceller. Sonoporation med et sonikeringsapparat med sonde anvendes til at lette plantecellernes optagelse af liposomer. Ultralyd nedbryder liposomernes lipid-dobbeltlag og frigiver derved det genetiske materiale til plantecellerne. Denne tilgang er nyttig til undersøgelser af transient genekspression i planteceller.

Videnskabeligt dokumenterede fordele ved sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT)

Sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) er blevet anvendt på talrige plantearter. En kort og relativt mild ultralydsbehandling af plantecellekulturer forårsager sonoporation, som efterfølgende gør det muligt for Agrobacterium at trænge dybt ind som gentransportør. Nedenfor kan du læse eksempler på undersøgelser, der dokumenterer de gavnlige virkninger af SAAT.

Ultralydsassisteret transformation af ashwagandha

For at forbedre transformationseffektiviteten i W. somnifera (kendt som ashwagandha eller vinterkirsebær) undersøgte Dehdashti og kolleger (2016) anvendelsen af acetosyringon (AS) og sonikering.
Acetosyringon (AS) blev tilsat i tre trin: Agrobacterium-væskekultur, Agrobacterium-infektion og samdyrkning af eksplanter med Agrobacterium. Tilsætning af 75 μM AS til Agrobacterium-væskekultur blev fundet at være optimal til induktion af vir-gener.
Den yderligere anvendelse af sonikering (SAAT) resulterede i den højeste genekspression. Ekspressionen af gusA-genet i hårrødder blev fundet at være bedst, når bladene og skudspidserne blev sonikeret i henholdsvis 10 og 20s. Transformationseffektiviteten for den forbedrede protokol blev registreret til henholdsvis 66,5 og 59,5% for blad- og skudspidseksplanter. Sammenlignet med andre protokoller blev transformationseffektiviteten for denne forbedrede protokol fundet at være 2,5 gange højere for blade og 3,7 gange højere for skudspidser. Southern blot-analyser bekræftede 1–2 kopier af gusA-transgenet i linjerne W1-W4, mens der blev påvist 1–4 transgenkopier i linjen W5, som blev dannet ved hjælp af den forbedrede protokol.

Virkningen af varigheden af sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) på transformationsfrekvensen for bladeksplanter (a) og skudspidseksplanter (b) fra W. somnifera
(undersøgelse og grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultralydsassisteret transformation af bomuld

Hussain et al. (2007) dokumenterer de gavnlige virkninger af sonikeringsassisteret transformation af bomuld. Akustisk kavitation forårsaget af lavfrekvent ultralyd skaber mikrosår på og under plantevævets overflade (sonoporation) og gør det muligt for Agrobacterium at trænge dybere ind og helt igennem plantevævet. Denne form for sårdannelse øger sandsynligheden for at inficere planteceller, der ligger dybere i vævet. For at evaluere transformationseffektiviteten af SAAT blev ekspressionen af GUS-genet målt. GUS-reportersystemet er et reportergensystem, som er særligt nyttigt inden for plantemolekylærbiologi og mikrobiologi. Ved at justere forskellige SAAT-parametre blev den transiente GUS-ekspression i bomuld forbedret betydeligt, når modne embryoner blev anvendt som eksplantat. GUS blev først påvist 24h efter inkubation af eksplanterne, og efter 48h var GUS-ekspressionen meget intens, hvilket fungerede som en nyttig indikator for vellykket transformation af bomuldseksplantatet efter sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT). Ved sammenligning af forskellige transformationsteknikker (nemlig biolistisk transformation, Agro, BAAT og SAAT) viste sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) langt de bedste transformationsresultater.

Valg af transformationsprocedure på grundlag af transient GUS-ekspression. Sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) viser en betydeligt højere transient ekspression.
(undersøgelse og grafik: © Hussain et al., 2007)

Højtydende ultralydsløsninger til sonoporation og SAAT

Hielscher Ultrasonics har mange års erfaring med udvikling og fremstilling af højtydende ultralydsapparater til laboratorier, forskningsfaciliteter samt industriel produktion med meget høj gennemstrømning. Til mikrobiologi og biovidenskab tilbyder Hielscher forskellige løsninger, der imødekommer de forskellige krav, som specifikke væv og deres behandlinger stiller. Til samtidig ultralydsbehandling af talrige prøver tilbyder Hielscher UIP400MTP til multibrøndsplader, VialTweeter til sonikering af op til 10 hætteglas (f.eks. Eppendorf-rør) eller ultralydsapparatet CupHorn. Ultralydsapparater med sonde spænder fra 50 til 400 watt til laboratoriehomogenisatorer og fra 500 watt til 16 kW til industrielle systemer.
Kontakt os og fortæl os om din anvendelse og dine proceskrav. Vores erfarne medarbejdere vil med glæde anbefale det bedst egnede ultralydsapparat til din biologiske proces.
Tabellen nedenfor giver dig en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet: