Genetisk transformation i planteceller ved hjælp af ultralyd

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) er en effektiv metode til at inficere planteceller med fremmede gener ved hjælp af Agrobacterium som transportør. Ultralydskavitation forårsager sonoporation, som kan beskrives som målrettet mikrosår af plantevæv. Via disse ultralydsskaber mikrosår, DNA og DNA-vektorer kan effektivt transporteres ind i cellematrixen.

Sonoporation – Ultralydsforbedret celletransformation

Når lavfrekvent ultralyd (ca. 20kHz) påføres cellesuspensioner, forårsager virkningerne af akustisk kavitation en forbigående membranpermeabilisering på cellevæv. Denne ultralydseffekt er kendt som sonoporation og bruges til genoverførsel til celler eller væv.
Fordelene ved ultralydbehandling er baseret på dets ikke-termiske mekaniske arbejdsprincip, hvilket gør sonikering ofte mere alsidig og mindre afhængig af celletyper. Den alsidige anvendelse af sonoporation åbner muligheden for udnyttelse af transgene planter, som har et betydeligt potentiale i bioproduktionen af komplekse humane terapeutiske proteiner. Sådanne plantebaserede bioreaktorer kan let manipuleres genetisk, forhindre potentiel kontaminering med humane patogener, ikke beskadige transformationsmedierende bakterier (f.eks. Agrobacterium) og er en billig og effektiv metode til biosyntese.

Ultralydsassisteret celletransformation

Sonikering er en teknik, der anvender lavfrekvente ultralydbølger til at omrøre partikler i opløsning, til at blande opløsninger og derved øge hastigheden af masseoverførsel og opløsning. Samtidig kan sonikering fjerne opløste gasser fra væsker. Ved plantetransformation vil sonikering forårsage dannelse af mikrosår på plantevæv og forbedre leveringen af nøgent DNA i plantens protoplast.

Til genetisk transformation er Sonication-Assisted Agrobacterium-medieret Transformation (SAAT) den foretrukne metode og har en signifikant højere effektivitet end sonikering, der bruges til at overføre nøgent DNA og DNA-vektorer direkte ind i protoplasten. Talrige undersøgelser har vist, at sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) kan bruges til at inducere mekanisk forstyrrelse og dannelse af sår på planteceller ved ultralydbølger og den resulterende akustiske kavitation. En kort ultralydsbehandling skaber mikrosår på overfladen af eksplantater. Da de sårede celler vil tillade indtrængning af Agrobacterium i den dybere del af plantevæv, hvilket øger sandsynligheden for, at planteceller bliver inficeret. Derudover forbedrer de udskilte phenolforbindelser transformationen. De ultralydsgenererede mikrosår gør eksplantionspenetration af bakterier også mere mulig. SAAT blev med succes brugt til genetisk transformation i plantearter, der især blev betragtet som resistente over for Agrobacterium.
At være en meget enkel og billig metode, såvel som den betydelige forbedring af Agrobacterium-medieret genoverførsel er de største fordele ved SAAT. Ud over vellykket anvendelse af SAAT i transformationen af Chenopodium rubrum L. og Beta vulgaris L. er denne tilgang også blevet anvendt i produktionen af rekombinante Escherichia coli vildtype varmelabilt holotoksin og Escherichia coli mutant LT-vaccineadjuvanser i Nicotiana tabacum, hvor de højeste systemiske LT-B-specifikke IgG-titere blev påvist hos fugle.
(jf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka og R. Baranski, 2014)

Generel procedure for genoverførsel via sonoporation i planteceller

1. Forberedelse af genetisk materiale: Begynd med at forberede det arvemateriale, du vil indføre i plantecellerne. Dette kan være plasmid-DNA, RNA eller andre nukleinsyrer.
2. Isolering af planteceller: Isoler de planteceller, du vil målrette mod. Afhængigt af dit eksperiment kan disse celler isoleres fra plantevæv eller kulturer.
3. Celle suspension: Ophæng plantecellerne i et passende medium eller buffer. Dette er afgørende for at sikre, at cellerne er sunde og i en tilstand, der fremmer genoptagelse.
4. Opsæt din Sonicator: Forbered din sonde-type sonde-type ved at forindstille sonikeringsparametre såsom amplitude, tid, energi og temperatur. Nedsænk ultralydssonden i cellesuspensionen.
5. Sonikering: Start sonikeringsproceduren. Den hurtige svingning af sondespidsen genererer kavitationsbobler i væsken. Disse bobler udvider sig og kollapser på grund af ultralydsbølgerne, hvilket skaber mekaniske kræfter og mikrostreaming i suspensionen.
6. Sonoporation: De mekaniske kræfter og mikrostreaming, der genereres af kavitation, skaber midlertidigt porer og huller i plantecellernes membraner. Det genetiske materiale, der er til stede i suspensionen, kan komme ind i plantecellerne gennem disse porer.
7. Inkubation: Efter sonoporationsbehandlingen inkuberes plantecellerne for at give dem mulighed for at komme sig og stabilisere deres membraner. Dette er et afgørende skridt for at sikre celleoverlevelse og vellykket genoverførsel.

Genoverførsel via Agrobacterium eller liposomer

Der er to almindelige former for at transfektere planteceller. De bruger enten agrobacterium, en slægt af gramnegative bakterier, eller liposomer som bærer af det genetiske materiale.

• Agrobakterie-medieret sonoporation: Agrobacterium tumefaciens er en bakterie, der almindeligvis anvendes i plantegenteknologi. I denne metode introduceres plasmid-DNA, der indeholder det ønskede gen, i Agrobacterium, som derefter blandes med planteceller. Cellesuspensionen udsættes for sonoporation ved hjælp af en sonde-type soniker. Ultralydsenergien forbedrer overførslen af det genetiske materiale fra Agrobacterium til plantecellerne. Denne metode bruges i vid udstrækning til genetisk modifikation af planter.
• Liposom-medieret sonoporation: Liposomer er lipidbaserede vesikler, der kan bære genetisk materiale. I denne metode blandes liposomer fyldt med plasmid-DNA eller andre nukleinsyrer med planteceller. Sonoporation ved hjælp af en sonde-type soniker anvendes til at lette optagelsen af liposomer af planteceller. Ultralyden forstyrrer liposomernes lipid-dobbeltlag og frigiver det genetiske materiale i plantecellerne. Denne tilgang er nyttig til forbigående genekspressionsundersøgelser i planteceller.

Videnskabeligt dokumenterede fordele ved sonikeringsassisteret agrobakteriemedieret transformation (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) er blevet anvendt på adskillige plantearter. En kort og relativt mild ultralydsbehandling af plantecellekulturer forårsager sonoporation, som efterfølgende tillader en dyb penetration af Agrobacterium som gentransportør. Nedenfor kan du læse eksempler på undersøgelser, der viser de gavnlige virkninger af SAAT.

Ultralydsassisteret transformation af Ashwagandha

For at forbedre transformationseffektiviteten i W. somnifera (kendt som ashwagandha eller vinterkirsebær) undersøgte Dehdashti og kolleger (2016) brugen af acetosyringon (AS) og sonikering.
Acetosyringon (AS) blev tilsat i tre faser: Agrobacterium flydende kultur, Agrobacterium-infektion og co-kultur af eksplantater med Agrobacterium. Tilsætningen af 75 μM AS til Agrobacterium flydende kultur viste sig at være optimal til induktion af vir-gener.
Den yderligere anvendelse af sonikering (SAAT) resulterede i højeste genekspression. GusA-genekspressionen i behårede rødder viste sig at være bedst, når bladene og skudspidserne blev sonikeret i henholdsvis 10 og 20'erne. Transformationseffektiviteten af den forbedrede protokol blev registreret 66,5 og 59,5 % i tilfælde af henholdsvis blad- og skudspidseksplanteringer. Sammenlignet med andre protokoller viste transformationseffektiviteten af denne forbedrede protokol sig at være 2,5 gange højere for blade og 3,7 gange mere for skudspidser. Southern blot-analyser bekræftede 1-2 kopier af gusA-transgenet i linjerne W1-W4, mens 1-4 transgenkopier blev påvist i linjen W5 genereret af den forbedrede protokol.

Effekt af varigheden af sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) på transformationsfrekvensen af W. somnifera-blad (a) og skudspids (b) eksplantater
(undersøgelse og grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Ultralydsassisteret transformation af bomuld

Hussain et al. (2007) demonstrerer de gavnlige virkninger af sonikeringsassisteret bomuldstransformation. Akustisk kavitation forårsaget af lavfrekvent ultralyd skaber mikrosår på og under overfladen af plantevæv (sonoporation) og tillader Agrobacterium at rejse dybere og fuldstændigt gennem plantevævet. Denne sårende måde øger sandsynligheden for at inficere planteceller, der ligger dybere i vævet. For at evaluere transformationseffektiviteten af SAAT blev GUS-genekspression målt. GUS-reportersystemet er et reportergensystem, der er særligt nyttigt inden for plantemolekylærbiologi og mikrobiologi. Ved justering af forskellige SAAT-parametre blev GUS forbigående ekspression i bomuld ved brug af modne embryoner som eksplantation signifikant forbedret. GUS blev først påvist 24 timer efter inkubation af eksplanterne og ved 48 timer var GUS-ekspression meget intens, hvilket tjente som en nyttig indikator for vellykket transformation af bomuldseksplanten efter sonikeringsassisteret Agrobacterium medieret transformation (SAAT). Sammenligningen af forskellige transformationsteknikker (nemlig biolistisk, Agro, BAAT, SAAT), sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) viste langt de bedste resultater af transformation.

Valg af transformationsprocedure på grundlag af forbigående ekspression af GUS. Sonikeringsassisteret Agrobacterium-medieret transformation (SAAT) viser en signifikant højere forbigående ekspression.
(undersøgelse og grafik: © Hussain et al., 2007)

Højtydende ultralydsløsninger til sonoporation og SAAT

Hielscher Ultrasonics har lang erfaring med udvikling og fremstilling af højtydende ultralydapparater til laboratorier, forskningsfaciliteter samt industriel produktion med meget høje gennemstrømninger. Til mikrobiologi og biovidenskab tilbyder Hielscher forskellige løsninger til at imødekomme forskellige krav, der er nødvendige for specifikke væv og deres behandlinger. Til samtidig ultralydbehandling af adskillige prøver tilbyder Hielscher UIP400MTP til multiwell-plader, VialTweeter til sonikering af op til 10 hætteglas (f.eks. Eppendorf-rør) eller ultralyd CupHorn. Sonde-type ultralydapparater er tilgængelige fra 50 til 400 watt som laboratoriehomogenisatorer, mens industrielle systemer dækker effektområdet fra 500 watt til 16kW.
Kontakt os og fortæl os om dine ansøgnings- og proceskrav. Vores erfarne personale vil med glæde anbefale den bedst egnede ultralydsapparat til din biologiske proces.
Nedenstående tabel giver dig en indikation af den omtrentlige behandlingskapacitet for vores ultralydapparater: