Hielscher ultrazvuková technologie

Sonzace lysis: přerušení buněk & těžba

Rozpuštění nebo lýza buněk je běžnou součástí každodenního přípravy vzorků v biotechnologických laboratořích. Cílem lýzy je narušit části buněčné stěny nebo úplné buňky, aby se uvolnily biologické molekuly. Takzvaný lyzát může sestávat například z plazmidu, receptorových testů, proteinů, DNA, RNA atd. Následujícími kroky lýzy jsou frakcionace, izolování organelů a / nebo extrakce a čištění proteinů. Extrahovaný materiál (= lyzát) musí být oddělen a je předmětem dalších výzkumů nebo aplikací, např. Pro proteomický výzkum. Ultrazvukové homogenizátory jsou běžným nástrojem pro úspěšnou lýzu buněk. Vzhledem k tomu, že intenzita ultrazvuku může být vyrovnána úpravou parametrů procesu, optimální intenzita sonikace od velmi měkké až po velmi tvrdou lze nastavit jednotlivě pro každou látku a médium tak, aby vyhovovala požadavkům specifické aplikace.

struktura buněk

Buňky jsou chráněny polopropustnou plazmatické membráně, který spočívá ve fosfo-lipidové dvojvrstvy (dvouvrstvé také protein-lipid; tvořené hydrofobními lipidů a hydrofilních molekul fosforu s vloženými molekul proteinu) a vytváří bariéru mezi buněčnými interiérů (cytoplazmatickou) a extracelulární prostředí. Rostlinné buňky a prokaryotické buňky jsou obklopeny buněčné stěny. Vzhledem k mnoha vrstev o tloušťce buněčné stěny z celulózy, rostlinné buňky jsou těžší než Lyse zvířecí buňky. Vnitřní buňka, jako je organel, jádra, mitochondrií, je stabilizována cytoskeletu.
Lýzou buněk, je zaměřen na extrakci a oddělení organely, bílkoviny, DNA, mRNA nebo jiných biomolekul.

Pro přípravu vzorku buněčné hmoty se běžně používá sonikace.

Na obr. 1: Ultrazvukový extrakci z buněk: mikroskopický příčný řez (TS), apikální stonku z máty (Mentha piperita) ukazuje mechanismus akce během ultrazvukového extrakcí z buněk (zvětšení 2000x) [zdroj: Vilkhu kol. 2011]

Metody

Existuje několik metod pro lyzátu buněk, které lze rozdělit do mechanických a chemických metod, které zahrnují použití detergentů nebo rozpouštědel, použití vysokého tlaku, nebo použití perlovém mlýnu nebo ve francouzském lisu. Nejproblematičtější Nevýhodou těchto metod je obtížná kontrola a přizpůsobení parametrů procesu a tím i vliv.
Hlavní nevýhody běžných metod lýzy:

Různé techniky lýzy

Tabulka: Konvenční metody buněčné lýze mají zásadní nevýhody

Naopak, použití ultrazvuku je velmi účinný a spolehlivý nástroj pro buněčnou dezintegraci, která umožňuje úplnou kontrolu nad parametry ultrazvuku. To zaručuje vysokou selektivitu na materiály uvolnění a čistotu produktu. [Balasundaram a kol. 2009] Je vhodný pro všechny typy buněk a snadno použitelné v malém i velkém měřítku. Ultrasonicators se snadno čistí. Ultrazvukový homogenizér vždy k dispozici clean-in-place (CIP) a funkce sterilizovat-in-place (SIP). Sonotroda spočívá v masivním titanu roh, který může být vymazán nebo ztracených ve vodě nebo v rozpouštědle (v závislosti na pracovní médium). Udržování ultrasonicators je vzhledem k jejich robustnosti téměř zanedbatelné.

lýza

Lýza je citlivý proces. Během lýzy je zničen ochrana buněčné membrány, avšak inaktivace, denaturace a degradace proteinů extrahovaných pomocí nefyziologické prostředí (odchylka od hodnoty pH), musí být zabráněno. Proto se obecně lýza se provádí v roztoku pufru. Většina obtíží, nekontrolované rozrušení buněk, což vede ke necíleného propuštění všech intracelulární materiálu nebo / a k denaturaci cílového produktu.

Ultrazvukový lýza buněk mohou být použity pro přípravu vzorků v laboratoři a pro výrobu velkých objemů. Klikni pro zvětšení!

Na obr. 1: 200 wattů silný ultrazvukový homogenizér Uf200 ः t s digitálním ovládáním a automatickým záznamem dat pro spolehlivé a opakovatelné lyži buněk.

ultrazvukové Lysis

Obecně platí, že lýza vzorků v laboratoři trvá od 15 sekund do 2 minut. Vzhledem k tomu, že intenzita ultrazvuku je velmi snadná pro nastavení amplitudy, nastavením doby sonikace a výběrem správného vybavení, je možné buněčné membrány velmi jemně nebo velmi náhle narušit v závislosti na struktuře buněk a na účelu lýzy např. extrakce DNA vyžaduje jemnější sonikaci, úplná extrakce proteinů bakterií vyžaduje intenzivnější ultrazvukovou léčbu). Teplota během procesu může být monitorována integrovaným teplotním čidlem a může být snadno řízena chlazením (ledová lázeň nebo průtokové články s chladícími plášti) nebo sonikací v impulsním režimu. Během ultrazvuku v pulzním režimu krátké sonikační cykly trvání 1 až 15 sekund umožňují odvod tepla a chlazení během delších přerušovaných období.
Všechny ultrazvukové řízené procesy jsou zcela reprodukovatelné a lineárně škálovatelné.

Ultrazvuková homogenizátor VialTweeter pro simultánní přípravu vzorku až 10 zkumavek. (Klikni pro zvětšení!)

Ultrazvukový přístroj VialTweeter umožňuje současné přípravu vzorků do 10 lahviček za stejných podmínek.

ultrazvukové Homogenizátory

Různé typy ultrazvukové přístroje umožňují odpovídající přípravu cíl vzorku a zajistit uživatelské přívětivosti a komfort obsluhy. Sondy typu ultrasonicators jsou nejběžnější zařízení v laboratoři. Jsou nejvhodnější pro výrobu malých a středně velkých vzorků s objemem 0,1 ml až 1000 ml. Různé velikosti elektrárny a sonotrody umožňují přizpůsobit ultrasonicator objemu vzorku a nádoby pro nejúčinnějších a efektivních výsledků Sonikací. Zařízení ultrazvuková sonda je nejlepší volbou, když mají jednotlivé vzorky, které mají být připraveny.

Pokud je třeba připravit více vzorků, např. 8 lahviček buněčného roztoku, nejvhodnější homogenizátor pro lýzu jsou přístroje jako je VialTweeter nebo ultrazvukový cuporn. Několik lahviček je sonikováno ve stejnou dobu, při stejné intenzitě. To nejen šetří čas, ale zajišťuje stejné zacházení se všemi vzorky, což činí výsledky mezi vzorky spolehlivé a srovnatelné. Kromě toho se zabrání zkřížené kontaminaci ponořením ultrazvukové sonotrody (známé také jako ultrazvukové sondy, houkačka, špička nebo prst). Vzhledem k tomu, že jsou použity lahvičky, je vynecháno časově náročné vyčištění a ztráta vzorku v důsledku dekantace nádob.
Pro vyšší objemy, např. pro komerční výrobu buněčných extraktů, kontinuální ultrazvukové systémy s reaktorem průtokovou buňkou, jsou nejvhodnější. Kontinuální a dokonce tok zpracovávaného materiálu zajišťuje rovnoměrné sonikace. Všechny parametry ultrazvukového procesu desintegrace lze optimalizovat a nastavit podle požadavků aplikace a konkrétního buněčného materiálu.

Příkladný postup pro ultrazvukové lýze bakteriálních buněk:

  • Příprava buněčné suspenze: Buněčné pelety se musí zcela suspenduje v roztoku pufru homogenizací (vybrat tlumivého roztoku v souladu s následující analýzou, např. Konkrétní metodou chromatografie). Přidat lysozymu a / nebo jiných přísad, v případě potřeby (musí být také kompatibilní s separaci / přečištění prostředky). Mix / homogenizovat Roztok se mírně za mírného sonikací až do úplného zastavení.
  • Ultrazvukové lýze: Vzorek se umístí do ledové lázně. Pro rozrušení buněk, sonikuje suspenze na 60-90 druhých dávkách (při použití módu pulsní vašeho ultrasonicator podmínek).
  • (., Například 10 minut při 10000 x g, při 4degC): Separace se odstřeďuje lyzát. Oddělte supernatant z buněčné pelety opatrně. Supernatant je celkový buněčný lyzát. Po filtraci supernatantu, získáte přečištěné kapaliny rozpustné buněčného proteinu.

Mezi nejčastější aplikace pro ultrasonicators biologie a biotechnologie jsou:

  • Příprava buněčného extraktu
  • Narušení kvasinek, bakterií, rostlinných buněk, měkké & tvrdý buněčná tkáň, nukleová materiál
  • extrakce bílkovin
  • Příprava a izolace enzymů
  • Výroba antigenů
  • Extrakce DNA a / nebo cílená fragmentace
  • příprava liposomu
Vysoký výkon ultrazvukové homogenizátory, jako je UIP1000hd se používají pro rozrušení buněk a extrakci v režimu s kontinuálním tokem, ačkoli dávky nebo. (Klikni pro zvětšení!)

Ultrazvukové stacionární systémy, takový jak UIP1000hd (1kW) může zpracovávat větší objemy biologického materiálu.

Rozmanité aplikace ultrazvuku se větví v odvětvích biotechnologie, biotechnologie, mikrobiologie, molekulární biologie, biochemie, imunologie, virologie, bakteriologii, proteomika, genetiky, fyziologie, buněčné biologie, hematologie, a botaniky.

Pro vyhodnocení a optimalizaci aplikací zákazníků, Hielscher Ultrazvuk nabízí plně vybavenou Ultrazvukové technologické laboratoře, Prosím, kontaktujte nás pro další informace!

Literatura / Reference

  • Balasundaram, B .; Harrison S .; Bracewell, D. G. (2009): Pokroky v strategií uvolňování produktů a vlivu na bioprocess designu. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. str. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manasseh, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): Ultrazvukové Obnova a změna složek potravin. In: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Ultrazvukové technologie pro výživu a bioprocessing. New York: Springer, 2011. str 345-368..

Kontakt / požádat o další informace

Promluvte si s námi o vaše požadavky na zpracování. Doporučíme nejvhodnější nastavení a zpracování parametrů pro váš projekt.





Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,