Sonikace pro buněčnou lýzu: Narušení a extrakce buněk
Ultrazvuková lýza buněk je postup přípravy vzorků v biotechnologických laboratořích. Cílem je narušit buněčné stěny nebo celé buňky, aby se uvolnily biologické molekuly. Sonikace se běžně používá pro lýzu buněk, narušení buněk a extrakci. Hlavní výhoda sonikátorů pro lýzu buněk spočívá v přesném řízení parametrů procesu, jako je intenzita a teplota, což umožňuje jemné, ale účinné narušení a extrakci buněk.
Lýza buněk pomocí ultrazvuku
Ultrazvuková lýza buněk využívá vysokofrekvenční zvukové vlny k rozbití buněk a extrakci jejich obsahu. Sonikace je zavedená a spolehlivá pro narušení buněk a extrakci intracelulárního materiálu, jako jsou plazmidy, receptorové testy, proteiny, DNA a RNA. Úpravou procesních parametrů lze ultrazvukovou intenzitu jemně doladit tak, aby splňovala specifické požadavky aplikace, od jemné až po intenzivní sonikaci. Kroky následující po lýze zahrnují frakcionaci, izolaci organel a extrakci a purifikaci proteinů. Výsledný lyzát musí být oddělen pro další zkoumání nebo aplikace, jako je proteomický výzkum.
Pokud se chcete dozvědět více o sonikaci pro lýzu, narušení buněk a extrakci, kontaktujte nás. Náš technický tým s vámi bude rád spolupracovat na vašem projektu lýzy buněk.
Ultrazvukové homogenizátory UP100H (100 wattů) a UP400St (400 wattů): Sonikace pro lýzu a extrakci buněk.
Výhody použití sonikace pro lýzu buněk
Ve srovnání s jinými metodami lýzy a extrakce buněk má ultrazvuková lýza buněk několik výhod:
- Rychlost: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk je rychlá metoda, která může rozbít otevřené buňky během několika sekund. To je mnohem rychlejší než jiné metody, jako je homogenizace, zmrazení a rozmrazení nebo mletí kuliček.
- Efektivita: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk může být použita k léčbě malých, velkých nebo více vzorků najednou, takže je efektivnější než jiné metody, které vyžadují individuální zpracování malých vzorků.
- Bez chemikálií: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk je neinvazivní metoda, která nevyžaduje použití drsných chemikálií nebo enzymů. Díky tomu je ideální pro aplikace, kde je třeba zachovat integritu obsahu buněk. Lze tak zabránit nežádoucí kontaminaci vzorků.
- Vysoký výnos: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk může extrahovat vysoký výtěžek buněčného obsahu, včetně DNA, RNA a proteinů. Je to proto, že vysokofrekvenční zvukové vlny rozbíjejí buněčné stěny a uvolňují obsah do okolního roztoku.
- Regulace teploty: Sofistikované ultrazvuky umožňují přesnou regulaci teploty vzorku. Hielscher digitální sonikátory jsou vybaveny zásuvným teplotním senzorem a softwarem pro sledování teploty.
- Reprodukovatelný: Protokoly pro ultrazvukovou lýzu buněk lze snadno reprodukovat a dokonce přizpůsobit různým větším nebo menším objemům vzorků jednoduchým lineárním zvětšením.
- Všestranný: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk může být použita k extrakci široké škály buněčných typů, včetně bakterií, kvasinek, hub, rostlinných a savčích buněk. Může být také použit k extrakci různých typů molekul, včetně proteinů, DNA, RNA a lipidů.
- Současná příprava mnoha vzorků: Hielscher Ultrasonics nabízí několik řešení pro pohodlné zpracování mnoha vzorků za přesně stejných procesních podmínek. Díky tomu je krok přípravy vzorku lýzy a extrakce vysoce efektivní a časově nenáročný.
- Snadné použití: Ultrazvukové zařízení pro lýzu a extrakci buněk se snadno používá a vyžaduje minimální školení. Zařízení je také ekonomické, protože se jedná o jednorázovou investici bez nutnosti zpětného odkupu likvidace. Díky tomu je atraktivní pro širokou škálu výzkumných pracovníků a laboratoří.
Celkově je ultrazvuková lýza a extrakce buněk rychlá, účinná, přesně kontrolovatelná a všestranná metoda extrakce buněčného obsahu. Jeho výhody oproti alternativním metodám z něj činí atraktivní volbu pro širokou škálu výzkumných a průmyslových aplikací.
Princip činnosti ultrazvukové lýzy buněk
Ultrazvuková lýza a extrakce buněk využívá vysokofrekvenční zvukové vlny k narušení buněk a extrakci jejich obsahu. Zvukové vlny vytvářejí změny tlaku v okolní kapalině, což způsobuje, že se tvoří a kolabuje malé bubliny v procesu známém jako kavitace. Tyto bubliny generují lokalizované vysoce intenzivní mechanické síly, které mohou rozbít otevřené buňky a uvolnit jejich obsah do okolního roztoku.
Lýza buněk pomocí ultrazvuku běžně zahrnuje následující kroky:
- Vzorek se umístí do zkumavky nebo nádoby s kapalným pufrem.
- Do vzorku se vloží ultrazvuková sonda a aplikují se vysokofrekvenční zvukové vlny o frekvenci cca 20-30 kHz.
- Ultrazvukové vlny způsobují oscilaci a kavitaci v okolní kapalině a generují lokalizované síly, které rozbíjejí buňky a uvolňují jejich obsah.
- Vzorek se odstředí nebo filtruje, aby se odstranily veškeré buněčné zbytky, a extrahovaný obsah se shromáždí pro následnou analýzu.
Silné ultrazvukové vlny narušují buněčnou matrici biologických struktur a uvolňují bioaktivní sloučeniny. Přenos hmoty mezi rostlinným materiálem a rozpouštědlem (např. pufrem) se zintenzivňuje. (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)
Nevýhody běžných metod lýzy
Během své práce v laboratořích jste již možná zažili potíže s lýzou buněk pomocí tradičních protokolů mechanické nebo chemické lýzy.
- Mechanická lýza: Metody mechanické lýzy, jako je mletí v hmoždíři nebo homogenizace pomocí french pressu, korálkového mlýna nebo systému rotor-stator, často postrádají možnosti ovládání a nastavení přesnosti. To znamená, že použití frézování a mletí může rychle generovat teplo a smykové síly, které mohou poškodit vzorek a denaturovat proteiny. Mohou být také časově náročné a vyžadují velké množství výchozího materiálu.
- Chemická lýza: Metody chemické lýzy, jako je lýza na bázi detergentů, mohou poškodit vzorek narušením lipidové dvojvrstvy a denaturací proteinů. Mohou také vyžadovat více kroků a mohou zanechávat zbytkové nečistoty, které narušují následné aplikace. Další výzvou je nalezení optimálního dávkování pracího prostředku.
- Cykly zmrazování a rozmrazování: Cykly zmrazování a rozmrazování mohou způsobit prasknutí buněčných membrán, ale opakované cykly mohou také způsobit denaturaci a degradaci proteinů. Tato metoda může také vyžadovat více cyklů, což může být časově náročné a často vede k nižším výnosům.
- Enzymatická lýza: Metody enzymatické lýzy mohou být specifické pro určité typy buněk a vyžadují více kroků, což je činí časově náročnými. Vytvářejí také odpad a vyžadují pečlivou optimalizaci, aby se zabránilo degradaci vzorku. Soupravy pro enzymatickou lýzu jsou často drahé. Pokud váš současný postup enzymatické lýzy nedává dostatečné výsledky, lze použít sonikaci jako synergickou metodu k zesílení narušení buněk.
Na rozdíl od konvenčních mechanických a chemických metod lýzy buněk je sonikace velmi účinným a spolehlivým nástrojem pro rozpad buněk, který umožňuje úplnou kontrolu nad parametry sonikace. Tím je zajištěna vysoká selektivita uvolňování materiálů a čistota produktu. [srov. Balasundaram et al., 2009]
Je vhodný pro všechny typy článků a snadno aplikovatelný v malém i velkém měřítku – Vždy za kontrolovaných podmínek. Ultrasonicators se snadno čistí. Ultrazvukový homogenizátor je vždy vybaven funkcí čištění na místě (CIP) a sterilizace na místě (SIP). Sonotroda se skládá z masivního titanového rohu, který lze otřít nebo propláchnout vodou nebo rozpouštědlem (v závislosti na pracovním médiu). Údržba ultrazvukových přístrojů je díky své robustnosti téměř zanedbatelná.
Ultrazvuková lýza a narušení buněk
Obecně platí, že lýza vzorků v laboratoři bude trvat mezi 15 sekundami a 2 minutami. Vzhledem k tomu, že intenzita sonikace je velmi snadno nastavitelná nastavením amplitudy doby sonikace a výběrem správného zařízení, je možné narušit buněčné membrány velmi jemně nebo velmi náhle, v závislosti na buněčné struktuře a na účelu lýzy (např. extrakce DNA vyžaduje měkčí sonikaci, úplná extrakce proteinů bakterií vyžaduje intenzivnější ultrazvukovou léčbu). Teplota během procesu může být monitorována integrovaným teplotním senzorem a může být snadno řízena chlazením (ledová lázeň nebo průtokové buňky s chladicími plášti) nebo sonikací v pulzním režimu. Během pulzního režimu sonikace umožňují krátké cykly sonikace v délce 1-15 sekund odvod tepla a chlazení během delších přerušovaných období.
Všechny ultrazvukem řízené procesy jsou zcela reprodukovatelné a lineárně škálovatelné.
Lahvička Tweeter je ultrazvukový homogenizátor pro simultánní, rovnoměrnou a rychlou sterilní přípravu mnoha vzorků.
Ultrazvukové homogenizátory pro lýzu a extrakci buněk
Různé typy ultrazvukových přístrojů umožňují přizpůsobit cíl přípravy vzorku a zajistit uživatelskou přívětivost a komfort obsluhy. Ultrazvukové přístroje typu sondy jsou nejběžnějšími zařízeními v laboratoři. Jsou nejvhodnější pro přípravu malých a středně velkých vzorků o objemech 0,1 ml až 1000 ml. Různé velikosti výkonu a sonotrody umožňují přizpůsobit ultrasonicator objemu vzorku a nádobě pro nejúčinnější a nejefektivnější sonikační výsledky. Ultrazvuková sonda je nejlepší volbou, když je třeba připravit jednotlivé vzorky.
Pokud je třeba připravit více vzorků, např. 8-10 lahviček s buněčným roztokem, je nejvhodnější homogenizační metodou pro účinnou lýzu intenzivní nepřímá sonikace pomocí ultrazvukových systémů, jako je VialTweeter nebo ultrazvukový cuphorn. Několik lahviček je sonikováno současně, se stejnou intenzitou. To šetří nejen čas, ale zajišťuje také stejné zpracování všech vzorků, díky čemuž jsou výsledky mezi vzorky spolehlivé a srovnatelné. Kromě toho je během nepřímé sonikace zabráněno křížové kontaminaci ponořením ultrazvukové sonotrody (známé také jako ultrazvuková sonda, roh, špička nebo prst). Vzhledem k tomu, že se používají individuálně přizpůsobené velikosti vzorku, jsou vynechány časově náročné čištění a ztráta vzorku v důsledku dekantace nádob. Pro jednotnou sonikaci vícejamkových nebo mikrotitračních destiček, Hielscher nabízí UIP400MTP.
Pro větší objemy, např. pro komerční výrobu buněčných extraktů, jsou nejvhodnější kontinuální ultrazvukové systémy s reaktorem s průtokovými články. Nepřetržitý a rovnoměrný tok zpracovávaného materiálu zajišťuje rovnoměrnou sonikaci. Všechny parametry procesu ultrazvukové dezintegrace lze optimalizovat a přizpůsobit požadavkům aplikace a konkrétnímu buněčnému materiálu.
Ukázkový postup ultrazvukové lýzy bakteriálních buněk:
- Příprava buněčné suspenze: Buněčné pelety musí být zcela suspendovány v tlumivém roztoku homogenizací (vyberte si tlumivý roztok kompatibilní s následující analýzou, např. specifickou metodou chromatografie). V případě potřeby přidejte lysozymy a/nebo jiné přísady (musí být také kompatibilní se separačními/čisticími prostředky). Roztok jemně promíchejte / homogenizujte za mírné sonikace, dokud nedosáhnete úplné suspenze.
- Ultrazvuková lýza: Umístěte vzorek do ledové lázně. V případě narušení buněk sonikujte suspenzi v 60-90 sekundových dávkách (pomocí pulzního režimu vašeho sonikátoru).
- Separace: Lyzát se odstředí (např. 10 min. při 10 000 x g; při 4 °C). Opatrně oddělte supernatant od buněčné pelety. Supernatant je celkový buněčný lyzát. Po filtraci supernatantu získáte vyčištěnou tekutinu rozpustného buněčného proteinu.
Nejběžnější aplikace ultrazvuku v biologii a biotechnologii jsou:
- Příprava buněčného extraktu
- Narušení kvasinek, bakterií, rostlinných buněk, měkkých nebo tvrdých buněčných tkání, nukleového materiálu
- extrakce bílkovin
- Příprava a izolace enzymů
- Produkce antigenů
- Extrakce DNA a/nebo cílená fragmentace
- Příprava lipozomu
Narušení buněk pomocí ultrazvuku typu sondy je účinná metoda přípravy vzorků.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přehled o našich ultrazvukových zařízeních pro narušení a extrakci buněk. Kliknutím na typ zařízení získáte další informace o každém ultrazvukovém homogenizátoru. Náš dobře vyškolený technický personál s dlouholetými zkušenostmi vám rád pomůže vybrat nejvhodnější ultrazvukový přístroj pro vaše vzorky!
| Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
|---|---|---|
| až 10 lahviček nebo zkumavek | Není k dispozici | VialTweeter |
| vícejamkové / mikrotitrační destičky | Není k dispozici | UIP400MTP |
| více trubic / nádob | Není k dispozici | Roh Poháru |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
| 10 až 1000 ml | 20 až 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP400St |
Rozmanité aplikace ultrazvuku se rozvětvují do sektorů biotechnologie, bioinženýrství, mikrobiologie, molekulární biologie, biochemie, imunologie, bakteriologie, virologie, proteomiky, genetiky, fyziologie, buněčné biologie, hematologie a botaniky.
Lýza: Rozbíjení buněčných struktur
Buňky jsou chráněny polopropustnou plazmatickou membránou, která se skládá z fosfolipidové dvojvrstvy (také protein-lipidové dvojvrstvy; tvořené hydrofobními lipidy a hydrofilními molekulami fosforu s vloženými molekulami proteinů) a vytváří bariéru mezi buněčným vnitřkem (cytoplazmou) a extracelulárním prostředím. Rostlinné buňky a prokaryotické buňky jsou obklopeny buněčnou stěnou. Vzhledem k více vrstvám silné buněčné stěny celulózy se rostlinné buňky louhují obtížněji než živočišné buňky. Vnitřek buňky, jako jsou organely, jádro, mitochondrie, je stabilizován cytoskeletem.
Lýzou buněk je zaměřena na extrakci a oddělení organel, proteinů, DNA, mRNA nebo jiných biomolekul.
Konvenční metody lýzy buněk a jejich nevýhody
Existuje několik metod lyzátových buněk, které lze rozdělit na mechanické a chemické metody, které zahrnují použití detergentů nebo rozpouštědel, použití vysokého tlaku nebo použití korálkového mlýna nebo french pressu. Nejproblematičtější nevýhodou těchto metod je obtížná kontrola a nastavení procesních parametrů a tím i dopadu.
V následující tabulce jsou uvedeny hlavní nevýhody běžných metod lýzy:
Tabulka: Konvenční metody lýzy buněk mají zásadní nevýhody
Postup lýzy
Lýza je citlivý proces. Během lýzy je narušena ochrana buněčné membrány, je však třeba zabránit inaktivaci, denaturaci a degradaci extrahovaných proteinů nefyziologickým prostředím (odchylka od hodnoty pH). Proto se obecně lýza provádí v tlumivém roztoku. Většina obtíží vzniká z nekontrolovaného narušení buněk, které vede k necílenému uvolňování veškerého intracelulárního materiálu a/nebo k denaturaci cílového produktu.
Často kladené otázky o sonikaci a lýze buněk
- Můžete lyzovat buňky sonikací? Ano, sonikace účinně lyzuje buňky pomocí vysokofrekvenčních ultrazvukových vln, které vyvolávají kavitaci, což je jev, kdy se tvoří drobné bubliny páry a prudce se zhroutí v buněčné suspenzi. Výsledné mechanické síly narušují buněčné membrány a usnadňují uvolňování intracelulárních složek do kapaliny.
- Jak používat sonikátor pro lýzu buněk? Využití sonikátoru pro buněčnou lýzu zahrnuje ponoření sondy sonikátoru do buněčné suspenze a úpravu parametrů, jako je amplituda a doba trvání pulzu. Tento proces by měl být pečlivě sledován, aby se optimalizovalo narušení buněk a zároveň se minimalizovala denaturace proteinů a inaktivace enzymů.
- Jaký je princip sonikace pro lýzu buněk? Sonikace funguje na principu akustické kavitace. Ultrazvuková energie se přenáší do kapalného média, což způsobuje rychlé kolísání tlaku, které vede k tvorbě a implozi mikrobublin. Tyto imploze generují intenzivní smykové síly a lokalizované vysoké teploty, narušují buněčné struktury a zvyšují homogenitu lyzátu.
- Jak dlouho trvá sonikace lýzy buněk? Doba trvání sonikace pro lýzu buněk se může výrazně lišit v závislosti na faktorech, jako je typ buňky, hustota buněk, síla sonikátoru a konkrétní použitý protokol. Typické postupy se mohou pohybovat od několika sekund do několika minut, často prováděné v cyklech, aby se řídila tvorba tepla a zajistilo rovnoměrné narušení buněk.
- Jaký je účel sonikace při extrakci proteinů? Při extrakci proteinů slouží sonikace k účinnému prasknutí buněčných membrán a solubilizaci proteinů. Tato metoda je zvláště užitečná pro uvolňování proteinů z buněčných kompartmentů, takže je nezbytná pro přípravu lyzátů, ze kterých mají být proteiny čištěny nebo analyzovány.
- Proč se k extrakci používá sonikace? Sonikace je upřednostňována pro extrakci díky svému rychlému působení a schopnosti aplikovat cílenou energii, rozkládat buněčné struktury a uvolňovat bioaktivní molekuly bez použití drsných chemických úprav, čímž zachovává funkční integritu extrahovaných sloučenin.
- Narušuje sonikace interakce protein-protein? Zatímco sonikace může účinně narušit buněčné membrány, může také narušit protein-proteinové interakce. Úroveň narušení závisí na intenzitě sonikace a délce expozice, což může vést k denaturaci nebo disociaci proteinových komplexů, což může ovlivnit následné analytické nebo funkční studie.
- Lze sonikaci použít k lýze E. coli? Hielscher sonikátory jsou zvláště účinné pro lýzu bakteriálních buněk, jako je E. coli, které mají robustní buněčné stěny. Tato technika poskytuje fyzikální metodu střihu buněčné stěny a membrány, což z ní činí preferovanou metodu pro přípravu bakteriálních lyzátů v laboratořích molekulární biologie a biochemie.
Literatura/Odkazy
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.