Sonikace pro lýzu: narušení buněk a extrakce

Rozpad nebo lýza buněk je běžnou součástí každodenní přípravy vzorků v biotechnologických laboratořích. Cílem lýzy je narušit části buněčné stěny nebo celé buňky a uvolnit biologické molekuly. Ultrazvukové homogenizátory jsou široce používány pro úspěšnou lýzu buněk. Hlavní výhodou sofistikovaných ultrasonicators je přesná kontrola nad parametry procesu, jako je intenzita a teplota, což umožňuje jemné, ale vysoce účinné narušení buněk a extrakce.

Lýza buněk pomocí ultrazvuku

Ultrazvuková lýza a extrakce buněk je metoda používaná k rozbití otevřených buněk a extrakci obsahu pomocí vysokofrekvenčních zvukových vln, tj. ultrazvuku. Sonikace je technika lýzy, která je široce používána jako zavedená a spolehlivá metoda narušení buněk a extrakce intracelulárního materiálu. Ultrazvuková lýza je spolehlivá technika pro přípravu lyzátu obsahujícího např. plazmid, receptorové testy, proteiny, DNA, RNA atd. Vzhledem k tomu, že ultrazvuková intenzita může být vyrovnána úpravou parametrů procesu, optimální intenzita sonikace od velmi měkké po intenzivní může být nastavena individuálně pro každou látku a médium, aby splňovala specifické požadavky aplikace. Následující kroky lýzy jsou frakcionace, izolace organel nebo extrakce a purifikace proteinů. Extrahovaný materiál (= lyzát) musí být separován a je předmětem dalších výzkumů nebo aplikací, např. pro proteomický výzkum.

Ve srovnání s jinými metodami lýzy buněk a extrakce má ultrazvuková lýza buněk několik výhod:

1. Rychlost: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk je rychlá metoda, která může rozbít otevřené buňky během několika sekund. To je mnohem rychlejší než jiné metody, jako je homogenizace, zmrazení nebo mletí korálků.
2. Účinnost: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk může být použita k léčbě malých, velkých nebo více vzorků najednou, což je účinnější než jiné metody, které vyžadují individuální zpracování malých vzorků.
3. Bez chemikálií: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk je neinvazivní metoda, která nevyžaduje použití drsných chemikálií nebo enzymů. Díky tomu je ideální pro aplikace, kde je třeba zachovat integritu buněčného obsahu. Lze zabránit nežádoucí kontaminaci vzorků.
4. Vysoký výtěžek: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk může extrahovat vysoký výtěžek buněčného obsahu, včetně DNA, RNA a proteinů. Je to proto, že vysokofrekvenční zvukové vlny rozbíjejí buněčné stěny a uvolňují obsah do okolního roztoku.
5. Regulace teploty: Sofistikované ultrasonciátory umožňují přesnou regulaci teploty vzorku. Hielscher digitální ultrazvuk jsou vybaveny připojitelným teplotním čidlem a softwarem pro monitorování teploty.
6. Reprodukovatelný: Protokoly pro lýzu ultrazvukových buněk lze snadno reprodukovat a dokonce přiřadit k různým větším nebo menším objemům vzorků jednoduchým lineárním škálováním.
7. Všestranný: Ultrazvuková lýza a extrakce buněk může být použita k extrakci široké škály typů buněk, včetně bakterií, kvasinek, hub, rostlinných a savčích buněk. Může být také použit k extrakci různých typů molekul, včetně proteinů, DNA, RNA a lipidů.
8. Současná příprava četných vzorků: Hielscher Ultrasonics nabízí několik řešení pro pohodlné zpracování mnoha vzorků za přesně stejných podmínek procesu. Díky tomu je krok přípravy vzorků lýzy a extrakce vysoce efektivní a časově úsporný.
9. Snadné použití: Zařízení pro lýzu a extrakci ultrazvukových buněk se snadno používá a vyžaduje minimální školení. Zařízení je také úsporné, protože se jedná o jednorázovou investici bez požadavku na zpětný odkup likvidace. Díky tomu je atraktivní pro širokou škálu výzkumných pracovníků a laboratoří.

Celkově je ultrazvuková lýza a extrakce buněk rychlá, účinná, přesně kontrolovatelná a všestranná metoda pro extrakci buněčného obsahu. Jeho výhody oproti alternativním metodám z něj činí atraktivní volbu pro širokou škálu výzkumných a průmyslových aplikací.

Pracovní princip lýzy ultrazvukových buněk

Ultrazvuková lýza a extrakce buněk používá vysokofrekvenční zvukové vlny k narušení buněk a extrahování jejich obsahu. Zvukové vlny vytvářejí změny tlaku v okolní kapalině, což způsobuje tvorbu malých bublin a kolaps v procesu známém jako kavitace. Tyto bubliny vytvářejí lokalizované vysoce intenzivní mechanické síly, které mohou rozbít otevřené buňky a uvolnit jejich obsah do okolního roztoku.

Lýza buněk pomocí ultrazvuku obvykle zahrnuje následující kroky:

• Vzorek se umístí do zkumavky nebo nádoby s kapalným pufrem.
• Do vzorku se vloží ultrazvuková sonda a aplikují se vysokofrekvenční zvukové vlny s cca 20-30 kHz.
• Ultrazvukové vlny způsobují oscilaci a kavitaci v okolní kapalině, generují lokalizované síly, které rozbíjejí otevřené buňky a uvolňují jejich obsah.
• Vzorek se odstředí nebo přefiltruje, aby se odstranily veškeré buněčné zbytky, a extrahovaný obsah se shromáždí pro následnou analýzu.

Silné ultrazvukové vlny narušují buněčnou matrici biologických struktur a uvolňují bioaktivní sloučeniny. Přenos hmoty mezi rostlinným materiálem a rozpouštědlem (např. pufrem) se zintenzivňuje. (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)

Nevýhody běžných metod lýzy

Během své práce v laboratořích jste již možná zažili potíže s lýzou buněk pomocí tradičních protokolů mechanické nebo chemické lýzy.

• Mechanická lýza: Metody mechanické lýzy, jako je broušení maltou a tloučkem nebo homogenizace pomocí french pressu, mlýnku na korálky nebo systému rotor-stator, často postrádají přesné možnosti řízení a nastavení. To znamená, že použití frézování a broušení může rychle vytvářet tepelné a smykové síly, které mohou poškodit vzorek a denaturovat proteiny. Mohou být také časově náročné a vyžadují velké množství výchozího materiálu.
• Chemická lýza: Metody chemické lýzy, jako je lýza na bázi detergentů, mohou poškodit vzorek narušením lipidové dvojvrstvy a denaturací proteinů. Mohou také vyžadovat více kroků a mohou zanechat zbytkové nečistoty, které narušují následné aplikace. Nalezení optimální dávky pracího prostředku je další výzvou.
• Cykly zmrazení a rozmrazení: Cykly zmrazení a rozmrazení mohou způsobit prasknutí buněčných membrán, ale opakované cykly mohou také způsobit denaturaci a degradaci bílkovin. Tato metoda může také vyžadovat více cyklů, což může být časově náročné a často vede k nižším výnosům.
• Enzymatická lýza: Metody enzymatické lýzy mohou být specifické pro určité typy buněk a vyžadují více kroků, což je činí časově náročnými. Vznikají také v odpadech a vyžadují pečlivou optimalizaci, aby nedošlo k degradaci vzorku. Soupravy pro enzymatickou lýzu jsou často drahé. Pokud váš současný postup enzymatické lýzy neposkytuje dostatečné výsledky, může být použita sonikace jako synergická metoda k zesílení narušení buněk.

Na rozdíl od konvenčních mechanických a chemických metod lýzy buněk je sonikace velmi účinným a spolehlivým nástrojem pro rozpad buněk, který umožňuje úplnou kontrolu nad parametry sonikace. Tím je zajištěna vysoká selektivita při uvolňování materiálů a čistotě produktu. [srov. Balasundaram et al., 2009]
Je vhodný pro všechny typy buněk a snadno použitelný v malém i velkém měřítku – vždy za kontrolovaných podmínek. Ultrasonicators se snadno čistí. Ultrazvukový homogenizátor vždy obsahuje funkci clean-in-place (CIP) a sterilizace na místě (SIP). Sonotroda se skládá z masivního titanového rohu, který lze otřít nebo propláchnout vodou nebo rozpouštědlem (v závislosti na pracovním médiu). Údržba ultrasonicators je vzhledem k jejich robustnosti téměř zanedbatelná.

Ultrazvukový lýza a narušení buněk

Obecně platí, že lýza vzorků v laboratoři trvá od 15 sekund do 2 minut. Vzhledem k tomu, že intenzita ultrazvuku je velmi snadná pro nastavení amplitudy, nastavením doby sonikace a výběrem správného vybavení, je možné buněčné membrány velmi jemně nebo velmi náhle narušit v závislosti na struktuře buněk a na účelu lýzy např. extrakce DNA vyžaduje jemnější sonikaci, úplná extrakce proteinů bakterií vyžaduje intenzivnější ultrazvukovou léčbu). Teplota během procesu může být monitorována integrovaným teplotním čidlem a může být snadno řízena chlazením (ledová lázeň nebo průtokové články s chladícími plášti) nebo sonikací v impulsním režimu. Během ultrazvuku v pulzním režimu krátké sonikační cykly trvání 1 až 15 sekund umožňují odvod tepla a chlazení během delších přerušovaných období.
Všechny ultrazvukové řízené procesy jsou zcela reprodukovatelné a lineárně škálovatelné.

Ultrazvukové homogenizátory pro lýzu a extrakci buněk

Různé typy ultrazvukových zařízení umožňují přizpůsobit cíl přípravy vzorků a zajistit uživatelskou přívětivost a provozní komfort. Sonda typu ultrasonicators jsou nejběžnější zařízení v laboratoři. Jsou nejvhodnější pro přípravu malých a středně velkých vzorků o objemu 0,1 ml až 1000 ml. Různé velikosti výkonu a sonotrody umožňují přizpůsobit ultrasonicator objemu vzorku a plavidlu pro nejúčinnější a nejúčinnější výsledky sonikace. Zařízení ultrazvukové sondy je nejlepší volbou, když je třeba připravit jednotlivé vzorky.

Pokud je třeba připravit více vzorků, např. 8-10 lahviček buněčného roztoku, intenzivní nepřímá sonikace s ultrazvukovými systémy, jako je VialTweeter nebo ultrazvukový cuphorn, jsou nejvhodnější homogenizační metodou pro účinnou lýzu. Několik lahviček je sonikováno současně ve stejné intenzitě. To šetří nejen čas, ale také zajišťuje stejné zpracování všech vzorků, díky čemuž jsou výsledky mezi vzorky spolehlivé a srovnatelné. Kromě toho se během nepřímé sonikace křížovou kontaminací ponořením ultrazvukové sonotrody (známé také jako ultrazvuková sonda, roh, špička nebo prst) vyhýbá. Vzhledem k tomu, že se používají lahvičky přizpůsobené velikosti vzorku, je vynecháno časově náročné čištění a ztráta vzorku v důsledku dekantace nádob. Pro rovnoměrné sonikace multiwell nebo mikrotitrových destiček nabízí Hielscher UIP400MTP.
Pro vyšší objemy, např. pro komerční výrobu buněčných extraktů, kontinuální ultrazvukové systémy s reaktorem průtokovou buňkou, jsou nejvhodnější. Kontinuální a dokonce tok zpracovávaného materiálu zajišťuje rovnoměrné sonikace. Všechny parametry ultrazvukového procesu desintegrace lze optimalizovat a nastavit podle požadavků aplikace a konkrétního buněčného materiálu.
 
 
Příkladný postup pro ultrazvukové lýze bakteriálních buněk:

• Příprava buněčné suspenze: Buněčné pelety se musí zcela suspenduje v roztoku pufru homogenizací (vybrat tlumivého roztoku v souladu s následující analýzou, např. Konkrétní metodou chromatografie). Přidat lysozymu a / nebo jiných přísad, v případě potřeby (musí být také kompatibilní s separaci / přečištění prostředky). Mix / homogenizovat Roztok se mírně za mírného sonikací až do úplného zastavení.
• Ultrazvukové lýze: Vzorek se umístí do ledové lázně. Pro rozrušení buněk, sonikuje suspenze na 60-90 druhých dávkách (při použití módu pulsní vašeho ultrasonicator podmínek).
• (., Například 10 minut při 10000 x g, při 4degC): Separace se odstřeďuje lyzát. Oddělte supernatant z buněčné pelety opatrně. Supernatant je celkový buněčný lyzát. Po filtraci supernatantu, získáte přečištěné kapaliny rozpustné buněčného proteinu.

 
 
Mezi nejčastější aplikace pro ultrasonicators biologie a biotechnologie jsou:

• Příprava buněčného extraktu
• Narušení kvasinek, bakterií, rostlinných buněk, měkké nebo tvrdé buněčné tkáně, nukleového materiálu
• extrakce bílkovin
• Příprava a izolace enzymů
• Výroba antigenů
• Extrakce DNA a / nebo cílená fragmentace
• příprava liposomu