Ultrazvučne aplikacije u virusu MonkeyPox

Ultrazvuk je važna metoda obrade za izolaciju virusa boginja majmuna (MPXV) iz analitičkih uzoraka, za fragmentaciju virusne DNK, kao i za proizvodnju vakcine protiv majmunskih boginja. Za pripremu uzorka prije dijagnostike i analize (PCR, ELISA itd.) ultrazvuk se koristi za lizu stanica kako bi se virus majmunskih boginja oslobodio iz unutrašnjosti ćelije i/ili fragmentirao DNK. U proizvodnji cjepiva, primjene se kreću od pripreme virusnih čestica / DNK, inkapsulacije u nosače lijekova i formuliranja inokuluma.
U nastavku možete pronaći detaljne informacije o ultrazvučnoj pripremi uzorka virusa majmunskih boginja, kao i ultrazvučno potpomognutoj proizvodnji MPXV vakcine.

Šta ćete naći na ovoj stranici:

• Ultrazvučna liza za ekstrakciju virusa majmunskih boginja
• Ultrazvučna fragmentacija DNK virusa majmunskih boginja
• Ultrazvučne primjene u proizvodnji MPXV vakcina

Ultrazvučna liza i fragmentacija DNK prije lančane reakcije polimeraze (PCR)

Infekcija virusom majmunskih boginja otkriva se testiranjem amplifikacije nukleinske kiseline (NAAT), koristeći u realnom vremenu ili konvencionalnu lančanu reakciju polimeraze (PCR), za detekciju jedinstvenih sekvenci virusne DNK. Uzorak (npr. iz nazofarinksa ili biopsije kože) sadrži virus u ćelijama.
Za analizu, virus mora biti oslobođen iz ćelija, a virusna DNK mora biti fragmentirana za PCR.

Ultrazvučna liza:

Ultrazvučno uništavanje/liza ćelija je pouzdana i efikasna metoda za izolaciju virusa iz ćelijskih uzoraka i time poželjna tehnika u odnosu na hemijske agense, kao što su lizozim, proteinaza K i različiti deterdženti koji se alternativno koriste za postizanje ćelijske lize i oslobađanja DNK.
Međutim, upotreba takvih hemijskih reagensa zahtijeva dugotrajnu pripremu uzorka u nekoliko koraka prije PCR analize kako bi se spriječila inhibicija PCR reakcije. Pošto PCR inhibitori utiču na efikasnost amplifikacije, male varijacije količine inhibitora koji se ne uklanjaju mogu dovesti do velikih varijacija u amplifikaciji PCR proizvoda (Diaco, 1995).
Prednost ultrazvučne obrade za lizu je u tome što je poželjan potpuni poremećaj ćelijskih struktura i oslobađanje DNK bez potrebe za reagensima za lizu i dugotrajnom pripremom uzorka. (usp. Fykse et al., 2003.)

Ultrazvučna fragmentacija DNK:

Ultrazvučna fragmentacija DNK je jednostavna i pouzdana jer proizvodi fragmente DNK podesivih po dužini (bazni parovi, bp). Koristeći ultrazvuk, DNK se može efikasno fragmentirati do ciljane dužine DNK. Precizna kontrola ultrazvučnih parametara i sofisticirane opcije hlađenja sprečavaju degradaciju DNK.
Pročitajte više o ultrazvučnoj fragmentaciji DNK!

Ultrazvučne primjene u vakcini protiv virusa majmunskih boginja

Vakcine koje se koriste protiv virusa majmunskih boginja su trenutno žive virusne vakcine. Novorazvijene vakcine mogu koristiti druge platforme kao što je DNK. Trenutno sadrži modificirani virus Vaccinia Ankara, atenuirani ortopoksvirus koji se ne replicira. Takođe sadrži Tris (tris-aminometan) i natrijum hlorid. Vakcina također može sadržavati male količine DNK i proteina iz ćelija fibroblasta pilećeg embrija, koji se koriste za uzgoj virusa vakcine, benzonaze i jedinjenja antibiotika kao što su gentamicin i ciprofloksacin.

Ultrazvučna homogenizacija se koristi u proizvodnji živih atenuiranih virusnih vakcina, DNK vakcina, multivalentnih DNK koktela, mRNA vakcina, rekombinantnih proteinskih vakcina, vakcina čestica sličnih virusima, itd.

Možete pronaći detaljnije informacije o ultrazvučnim aplikacijama za poboljšanu proizvodnju vakcina!

Protokol za ultrazvučnu izolaciju virusa majmunskih boginja

Istraživački tim Stittelaara (2005.) koristio je ultrazvučnu lizu za oslobađanje virusa majmunskih boginja iz ćelijske kulture domaćina rasta, kao i iz ćelija dobivenih zamjenom grla od inficiranih primata.

Priprema vakcine protiv majmunskih boginja:

Virusi majmunskih boginja uzgajani su na ćelijama fibroblasta pilećih embriona bez specifičnih patogena. Nakon inkubacije od 1 do 2 dana, suspenzija virusnih ćelija je sakupljena jednim ciklusom zamrzavanja-odmrzavanja, a zatim koncentrirana centrifugiranjem. Pelet je resuspendiran i podvrgnut nekoliko rundi ultrazvučne homogenizacije.

Izolacija virusa majmunskih boginja iz vakcinisanih makaka:

Uzorci su tri puta zamrznuti-odmrznuti i sonikirani u ultrazvučnom CupHornu. Dva razrjeđenja (1:10 i 1:100) u transportnom mediju sa dodatkom 1% fetalnog goveđeg seruma korištena su za inokulaciju monoslojeva Vero ćelija u pločama sa šest jažica. Nakon 1 h inkubacije na 37°C, inokula je uklonjena i zamijenjena podlogom za kulturu sa dodatkom 1% fetalnog goveđeg seruma. Monoslojevi su kultivisani 5 dana na 37°C i obojeni kristalno ljubičastim rastvorom.
(usp. Stittelaar et al., 2005.)

Ultrasonikatori za analizu virusa i proizvodnju vakcina

Hielscher Ultrasonics široki portfelj proizvoda nudi idealan ultrasonikator za istraživačke i analitičke laboratorije, kao i za industrijsku proizvodnju cjepiva.
Hielscher Ultrasonics je specijaliziran za dizajn, proizvodnju i distribuciju ultrazvučnih i sono-bioreaktora visokih performansi za upotrebu u istraživačkim i analitičkim laboratorijama, kao i za implementaciju u industrijskoj proizvodnji cjepiva (npr. vakcine, API-ji).
Sonikacija se može primijeniti na otvorene posude, zatvorene reaktore s kontinuiranim miješanjem i reaktore s kontinuiranim protokom. Svi delovi ultrazvučnih sistema koji dolaze u kontakt sa tečnim medijumom izrađeni su od nerđajućeg čelika, titanijuma ili stakla. Autoklavirajući dijelovi i sanitarni elementi osiguravaju proizvodnju pod farmaceutski uslovi.
Automatsko snimanje podataka: Inteligentni softver automatski bilježi parametre procesa sonikacije na integriranu SD memorijsku karticu. Precizna kontrola svih parametara procesa osigurava reproduktivnost, standardizacija proizvodnje, te olakšava ispunjavanje sigurnosnih standarda farmaceutskih proizvoda.
Hielscher Ultrasonics’ ultrazvučni procesori su vrlo pouzdani i mogu se precizno kontrolisati. Svi industrijski ultrasonikatori mogu se podesiti da isporuče cijeli raspon od nižih do vrlo visokih amplituda. Robusnost Hielscherovih ultrazvučnih sistema omogućava 24/7 rad u teškim uslovima iu zahtjevnim okruženjima.

Tabela ispod daje vam indikaciju približnih kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata: