Ултразвуково раздробяване на клетките в бактериални проби
Бактериалните проби рядко се получават като истински едноклетъчни суспензии. Културите растат във вериги и флокули, изолатите от околната среда образуват агрегати, свързани с извънклетъчни полимерни вещества, а центрофугираните утайки често не се ресуспендират дори при интензивно разбъркване с вортекс. При измерването на жизнеспособните клетки, оптичната плътност, проточната цитометрия и профилирането на микробиома се приема, че една частица е равна на една клетка. Ултразвуковото разграждане на клетките разрешава този конфликт: кратки, контролирани ултразвукови импулси разделят агрегатите на единични клетки, без да ги лизират.
Защо агрегацията на клетките влияе негативно на резултатите ви
Агрегацията е биологична особеност, а не грешка при подготовката. Стафилококите, стрептококите, лактобацилите, актиномицетите и много други видове от околната среда растат под формата на вериги, клъстери или фрагменти от биофилм, а екстрацелуларната ДНК и полизахаридите свързват клетките помежду им в утайки и елуати от тампони. Аналитичните последствия са систематични:
- Броят на колониите се подценява, тъй като всяка група образува една колония, независимо колко клетки съдържа.
- Оптичната плътност и броячите на частици отчитат агрегати, а не клетки, което води до изкривяване на кривите на растеж.
- При флоуцитометрията и сортирането на клетки събитията, при които клетките са се слепили, се отчитат неправилно и се изключват от анализа.
- Извличането на ДНК и протеини обхваща само клетките по повърхността на агрегата, което води до изкривяване на данните за микробиома и омичните данни.
Традиционните методи са бавни, непълни или водят до химически промени. Интензивното пипетиране и вихровото разбъркване оставят микроагрегати. Ензимното или хелаторното диспергиране променя повърхността на клетките, които може би възнамерявате да анализирате. Механичното дезагрегиране чрез контролирана кавитация действа за секунди и не изисква добавки.
Един агрегат се равнява на една колония – и един грешен резултат. Вижте как ултразвуковото раздробяване създава истински едноклетъчни суспензии без лизис, аерозоли или работа със сонди. Поискайте повече информация!
Многотръбен сонатор VialTweeter за безконтактна подготовка на пробите: Разделете клетъчните агрегати в запечатани епруветки
Как ултразвуковото въздействие разгражда клетките, без да ги лизира
Ултразвуковото раздробяване на клетките се основава на разликата в механичната якост. Бактериалните агрегати се държат заедно чрез относително слаби междуклетъчни връзки и екстрацелуларна матрица, докато непокътнатата клетъчна обвивка издържа на значително по-голямо срязване. Когато калибрираният ултразвук навлезе в суспензията, акустичната кавитация генерира микротечения, импулси на налягане и срязващи сили, които действат първо върху границите на агрегатите. Агрегати, вериги и фрагменти от биофилм се разкъсват (деагломерация), преди да бъде достигнато енергийното ниво, при което мембраните се разкъсват (лизис).
Ултразвуково раздробяване на бактериални клетъчни агрегати
Разграждане или лизис – Защо параметрите на ултразвуковата обработка са от значение
Практическата последица е, че дезагрегацията и лизисът представляват един и същ инструмент, работещ при различни параметри. При умерена амплитуда, къси импулсни цикли и контролирана температура се получава жизнеспособна суспензия от единични клетки. Увеличаването на амплитудата, времето на експозиция или температурата на пробата измества процеса към пълно разрушаване на клетките за достигане на вътреклетъчни цели. Генераторите на Hielscher ви позволяват да настроите с прецизност амплитудата, мощността, импулса и енергийния приток, както и да запаметите метода, така че етапът на дезагрегация да е възпроизводим при различни проби, оператори и цикли.
Ефективна безконтактна ултразвукова обработка
Ултразвуковото почистване във вана не може да се сравни с този контрол. Ултразвуковите почистващи вани и резервоари осигуряват само ниска ултразвукова енергия, което води до непълна подготовка, а кавитацията протича неравномерно, така че всяка епруветка се обработва според положението ѝ във ваната. VialTweeter предава интензивни, фокусирани ултразвукови сили директно през стената на съда към до 10 запечатани проби едновременно. Процедурите, които изискват продължително и променливо въздействие във вана, се извършват по стандартизиран импулсен модел.
Безконтактните ултразвукови апарати на Hielscher прилагат интензивен, фокусиран ултразвук през стените на затворени флакони. VialTweeter обработва до 10 флакона едновременно с еднаква интензивност, без сонда в пробата, без кръстосано замърсяване и без отделяне на аерозол. Когато производителността го изисква, соникаторите за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP осигуряват същия контролиран пренос на енергия към плаки с множество лунки.
Флаконът за високоговорители Едновременно сонира до 10 по-малки флакона и до 5 по-големи епруветки.
Предимства на безконтактното ултразвуково раздробяване
- Напълно липса на кръстосано замърсяване: Тъй като епруветките остават постоянно затворени и в пробата не се потапя никаква сонда, напълно се избягват кръстосаното замърсяване и загубата на проба. Между отделните проби не се налага стерилизиране на нищо, а един цикъл не може да повлияе на следващия.
- Защита срещу аерозоли: Ултразвуковата обработка с отворена сонда генерира инфекциозни аерозоли и замърсява повърхностите на апаратурата. При ултразвуковата обработка в затворена епруветка пробата остава в собствената си епруветка, което е от значение при работа с патогенни бактерии като Mycobacterium tuberculosis и други агенти от нива BSL-2 или BSL-3.
- Без загуба на върха: Титановите сонди могат да отделят малко количество микрочастици в пробата по време на работа. Тези частици променят оптичната плътност и броя на частиците по-нататък по веригата. Непрякото ултразвуково третиране през стената на съда напълно елиминира този източник на твърди частици.
- Равномерна производителност: VialTweeter осигурява еднаква интензивност на ултразвука за всяка от до 10 епруветки, което гарантира равномерни и възпроизводими резултати от ултразвуковата обработка. Ефектите от позиционирането, които са проблем при ултразвуковите вани и сондирането на единични проби, изчезват, а базовите линии остават съпоставими при всички повторения.
- Целостност на пробата: Епруветките остават затворени през целия процес на обработка, така че пробата не може да бъде замърсена, повредена или да се изпари. Малките обеми се обработват без разреждане, включително ценните клинични утайки, при които не може да се допусне допълнителна стъпка по прехвърляне.
- Контрол на процеса: Амплитудата се регулира в диапазона от 20 до 100 %, импулсният режим – от 0 до 100 %, а системите поддържат мониторинг на температурата, така че термочувствителните щамове и протеини да остават под праговете, при които възникват увреждания.
Типични приложения
- Анализ на микробиома и съдържанието на червата: разпръскване на Lactobacillus, Bifidobacterium и фекални проби преди посяване или секвениране, за да не се понижат броят им поради образуването на агрегати.
- Микробиология на храните и водата: разграждане на флокули в тампони, проби от изплакване и обогатителни бульони за точно определяне на броя на колониите и жизнеспособността.
- Изследвания върху биофилмите: извличане на клетки от носители и повърхности под формата на суспензии от единични клетки, без ензимна обработка, която би отстранила повърхностните протеини.
- Клинична диагностика: ресуспендиране на храчки, гной и елуати от тампони при условия за биологична изолация.
- Клетъчна култура: разделяне на слепени агрегати от клетки на бозайници, насекоми и CHO преди преброяване и пресаждане.
- Подготовка на целия работен процес: същият уред, който разгражда при ниска амплитуда, извършва пълно разбиване на клетките при по-високи настройки, така че лизисът, екстракцията на протеини и фрагментирането на ДНК протичат без прехвърляне в други епруветки.
Многоямков сонатор UIP400MTP за деагломерация на клетъчни агрегати с висока производителност
Моделите соникатори за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP обработват не само плаки с множество лунки, но и стойки за епруветки.
Намерете подходящия соникатор за вашия работен процес по раздробяване
Многотръбен соникатор за високи честоти VialTweeter
Предпочитаният метод за раздробяване в стерилни, запечатани флакони. Задвижван от 200-ватов процесор UP200St при 26 kHz с автоматично настройване, VialTweeter предава ултразвук индиректно през стените на до 10 затворени флакона едновременно, с мощност до 10 W на флакон, за равномерни и възпроизводими резултати без кръстосано замърсяване и загуба на проба. Титановият сонотрод на VialTweeter може да се автоклавира, а амплитудата и импулсът са регулируеми и могат да се запаметяват, което представлява необходимия диапазон на регулиране за протокол за деагломерация. Стандартният сонотрод с 10 позиции е съвместим с флакони за автоматичен пробовземач, епруветки за микроцентрифуга и епруветки Eppendorf или Nunc с обем от 1 до 5 mL. Захващащото устройство VialPress може да обработва до 5 по-големи съда с диаметър до 20 mm.
Предлагат се специализирани модели VialTweeter с една тръба, подходящи за тръбите Falcon, както и за единични флакони, адаптирани към размера на съда. При разглобяване на блоковия сонотрод основният модул на UP200St функционира като конвенционален соникатор със сонда за директна обработка на малки до средни по размер проби.
Ултразвукови апарати за микроплаки
Преминаване към подготовка на проби с висока производителност чрез ултразвукова обработка на плаки с множество лунки: При работните процеси, базирани на плаки, ултразвуковите апарати за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP разширяват обхвата на безконтактната и равномерна ултразвукова обработка от десет епруветки до цяла плака.
400-ватовият UIP400MTP обработва стандартни микротитърни и мулти-лункови плаки, включително формати с 96 лунки, с прецизен контрол на амплитудата, мощността и импулсите, както и с таймер, температурен датчик и охлаждане във водна баня. Отстраняването на биофилми и обработката на бактериални култури са утвърдени приложения на ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP.
Моделът UIP550MTP с мощност 550 вата е по-мощният вариант – идеален за по-взискателни приложения.
И двете системи за безконтактна ултразвукова обработка надеждно обработват плаки с 6, 12, 24, 48, 96 и 384 лунки, както и стойки за епруветки и чашки на Петри. Устройствата за ултразвукова обработка на микроплаки на Hielscher работят с всякакви стандартни плаки, като по този начин се избягват скъпите патентовани консумативи. Благодарение на програмируемите температурни граници ултразвуковата обработка автоматично спира при достигане на максималната температура на пробата и се възобновява след охлаждане, като по този начин се запазва жизнеспособността на клетките при многократни цикли. Интелигентна и надеждна подготовка на проби с висока производителност за повторяеми резултати.
В таблицата по-долу е представен обзор на приблизителния капацитет на обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати, използвани в биологичните науки, геномиката, протеомиката и диагностиката:
| Препоръчителни устройства | Обем на партидата | Дебит |
|---|---|---|
| Многотръбен соникатор за високи честоти VialTweeter | 0флакони с обем от 0,5 до 1,5 мл | Н.А. |
| Ултразвуков апарат за мулти-лункови плаки UIP400MTP (440 вата) | многоямкови / микротитрни плаки | Н.А. |
| Ултразвуков апарат за многолункови плаки UIP550MTP (550 вата) | многоямкови / микротитрни плаки | Н.А. |
| Ултразвуков CupHorn | CupHorn за флакони или чаша | Н.А. |
| UP100H – ултразвуков апарат със сонда, 100 вата | 1 до 500 мл | 10 до 200 мл/мин |
| UP200Ht, UP200St Модели ултразвукови апарати със сонда с мощност 200 вата | 10 до 1000 мл | 20 до 200 мл/мин |
| UP400St – ултразвуков апарат със сонда, 400 вата | 10 до 2000 мл | 20 до 400 мл/мин |
| GDmini2 | стерилен ултразвуков реактор с микропоток | Н.А. |
| Ултразвуков шейкър за сито | Н.А. | Н.А. |
Често задавани въпроси относно ултразвуковото раздробяване на клетки
Каква е разликата между разграждането на клетките и лизиса на клетките?
Деагрегацията, наричана още деагломерация, разделя слепналите клетки в суспензия от единични клетки, като клетките остават непокътнати и жизнеспособни. Лизисът разрушава клетъчната обвивка и освобождава вътреклетъчното съдържание. И двата процеса се задвижват от кавитационно срязване, като разликата е в прилаганата енергия. С оптимизирани настройки на амплитудата, импулсите и температурата, ултразвуковата обработка постига дезагрегация под прага на лизиса.
Защо ултразвуковите вани не са подходящи за стандартизирано раздробяване?
Баните осигуряват само ниска ултразвукова енергия, което води до непълна обработка, а кавитацията се развива много неравномерно в резервоара, така че всяка проба се подлага на различна обработка в зависимост от местоположението си. Микробиологичните изследвания и сравнителните проучвания зависят от съпоставимостта. Безконтактните ултразвукови апарати, като например Multi-Tube Sonicator VialTweeter, както и моделите ултразвукови апарати за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP, обработват всички съдове при настроени ултразвукови условия, което подобрява възпроизводимостта при повторенията.
Може ли ултразвуковата обработка да увреди клетките?
Да, ако параметрите не се контролират. Прекомерната ултразвукова обработка или неконтролираното нагряване могат да увредят клетките, а освободената ДНК прави пробите вискозни и способства за повторното им агрегиране. Ето защо процесът трябва да се разработва обмислено: умерена амплитуда, импулсни цикли, охлаждане и апаратура с ограничение на температурата поддържат обработката в частта на кривата, отговаряща на дезагрегацията.
Всички цифрови ултразвукови апарати на Hielscher предлагат прецизно регулируеми параметри, сменяеми температурни сензори, програмируеми настройки и автоматично записване на данни за надеждна подготовка на пробите.
Трябва ли пробата да се прехвърли в друг съд?
Не. Флаконите и плаките се обработват в оригиналните им, затворени опаковки. Непрякото ултразвуково третиране предотвратява както загубите при прехвърлянето, така и пренасянето на материали, свързано с манипулирането на сондата.
Какви формати на флакони може да обработва VialTweeter?
Стандартният 10-позиционен сонотрод е съвместим с флакони за автоматичен пробовземач, епруветки за микроцентрифуга и епруветки „Eppendorf“ или „Nunc“ с обем от 1 до 5 мл. Аксесоарът „VialPress“ побира до 5 по-големи съда с диаметър до 20 мм. Предлагат се специализирани модели VialTweeter за единични епруветки, подходящи за епруветки Falcon, както и за персонализирани единични епруветки или по-големи формати.
Мога ли да извърша разграждане и лизис с един и същ апарат?
Да. Същата система, която извършва деагрегация при умерена амплитуда, осигурява пълно разрушаване на клетките при по-висока амплитуда и по-дълго излагане, което позволява последователно провеждане на процесите по получаване на суспензия от единични клетки и последваща екстракция, без да се налага смяна на платформите.
Използва ли се ултразвукова обработка при MBEC тестовете?
Ултразвуковата обработка е утвърден и до голяма степен стандартен компонент. При MBEC-теста с колчета и капачки, след като биофилмите се отгледат върху полистиренови колчета и бъдат изложени на антибиотик, колчетата се прехвърлят в свежа среда и се подлагат на въртене във вихров миксер и ултразвукова обработка, за да се откъснат и дезагрегират прилепналите клетки от биофилма в планктонна суспензия преди серийното разреждане и преброяването на жизнеспособните клетки (MBEC се определя като най-ниската концентрация, при която броят на възстановените жизнеспособни клетки намалява с ≥3 log10 в сравнение с необработения биофилм). Ултразвуковата обработка значително подобрява качеството на дисперсията: непълното освобождаване на вградените клетки от EPS матрицата води до подценяване на ерадикацията и до завишаване на стойностите на MBEC. Целенасоченото ултразвуково третиране на лунките с държачи за пети по цялата повърхност на плаките за анализ с помощта на ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP преодолява традиционните недостатъци на ултразвуковото третиране в баня – а именно: неравномерно разпределение на енергията, прегряване и риск от аерозоли/кръстосано замърсяване.
Разберете как безконтактният ултразвуков апарат за микроплаки UIP400MTP улеснява провеждането на MBEC тестове!
Използва ли се ултразвуково обработване при тестовете за минимална инхибиторна концентрация (MIC)?
Ултразвуковата обработка се прилага в различни работни процеси, свързани с MIC, с цел подобряване на ефективността и възпроизводимостта:
- микобактериологията, където храчките и другите вискозни проби обикновено се деконтаминират и хомогенизират, понякога чрез ултразвукова обработка, преди тестването за чувствителност, а микобактериалните инокулати, образуващи агрегати, се облагодетелстват от краткотрайно разпръскване за получаване на точни стойности на МИК;
- организми, склонни към образуване на агрегати (например стрептококи, стафилококи под формата на гранули), при които микроагрегатите изкривяват плътността на инокулума; и
- комбинирана диагностика, като например ултразвуково изследване на импланта, култура на течност, последвано от тест за чувствителност при инфекция на протезиран ставен имплант (приложение от типа MBEC, а не класически MIC).
Литература / Препратки
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Изберете си чиния! Устройството за ултразвукова обработка на микроплаки UIP550MTP разделя бактериалните проби във всяка стандартна плака с множество лунки.
Модели на Hielscher Multi-Sample Sonicator UIP400MTP за микроплаки, ФлаконВисокоговорител за високи честоти и Cuphorn: високоскоростна и високопроизводителна подготовка на пробите