Ултразвукова дезагрегация на клетките в бактериални проби
Бактериалните проби рядко постъпват като истински суспензии от единични клетки. Културите растат във вериги и флокули, изолатите от околната среда образуват агрегати, свързани с извънклетъчни полимерни вещества, а утайките след центрофугиране често трудно се ресуспендират въпреки щателното разбъркване с вортекс. Преброяването на жизнеспособните клетки, оптичната плътност, проточната цитометрия и профилирането на микробиома предполагат, че една частица съответства на една клетка. Ултразвуковата дезагрегация на клетките разрешава това противоречие: кратки, контролирани импулси на ултразвукова обработка разделят агрегатите на единични клетки, без да ги лизират.
Защо клетъчната агрегация компрометира вашите резултати
Агрегацията е биологична особеност, а не грешка при подготовката. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces и много видове от околната среда растат във вериги, струпвания или фрагменти от биофилм, а извънклетъчната ДНК и полизахаридите слепват клетките в утайките и елуатите от тампони. Последиците за анализа са систематични:
- Броят на колониите се подценява, защото едно струпване образува една колония независимо колко клетки съдържа.
- Измерванията на оптичната плътност и броячите на частици отчитат агрегати вместо клетки, което изкривява кривите на растеж.
- Проточната цитометрия и сортирането на клетки преброяват неправилно събитията, съответстващи на клетъчни струпвания, и ги изключват от анализа.
- Екстракциите на ДНК и протеини представят само клетките на повърхността на агрегата, което изкривява данните за микробиома и омикс данните.
Конвенционалните подходи са бавни, непълни или водят до химични изменения. Енергичното пипетиране и разбъркването с вортекс оставят микроагрегати. Диспергирането с ензими или хелатори променя клетъчната повърхност, която може да възнамерявате да анализирате. Механичната дезагрегация чрез контролирана кавитация действа за секунди и не изисква добавки.
Един агрегат означава една колония – и един неправилен резултат. Вижте как ултразвуковата дезагрегация създава истински суспензии от единични клетки без лизис, аерозоли или манипулиране със сонда. Поискайте повече информация!
Ултразвуков апарат за множество епруветки VialTweeter за безконтактна подготовка на проби: дезагрегирайте клетъчните струпвания в запечатани епруветки
Как ултразвуковата обработка дезагрегира клетките, без да ги лизира
Ултразвуковата дезагрегация на клетките използва разликата в механичната якост. Бактериалните агрегати се поддържат от сравнително слаби междуклетъчни връзки и извънклетъчен матрикс, докато неповредената клетъчна обвивка издържа на значително по-силно срязване. Когато калибрираният ултразвук навлезе в суспензията, акустичната кавитация генерира микропотоци, импулси на налягане и сили на срязване, които действат първо на границите между компонентите на агрегата. Струпванията, веригите и фрагментите от биофилм се разделят чрез срязване (деагломерация), преди да бъде достигнато енергийното ниво, при което мембраните се разкъсват (лизис).
Ултразвукова дезагрегация на струпвания от бактериални клетки
Дезагрегация или лизис – какво значение имат параметрите на ултразвуковата обработка
Практически това означава, че дезагрегацията и лизисът се извършват с един и същ апарат, работещ при различни параметри. При умерена амплитуда, кратки импулсни цикли и контролирана температура получавате суспензия от жизнеспособни единични клетки. Повишаването на амплитудата, времето на въздействие или температурата на пробата насочва процеса към пълно разрушаване на клетките за извличане на вътреклетъчни целеви компоненти. Генераторите на Hielscher ви позволяват да задавате точно амплитудата, мощността, импулсите и вложената енергия и да запазвате метода, така че етапът на дезагрегация да е възпроизводим при различни проби, оператори и цикли на обработка.
Ефективна безконтактна ултразвукова обработка
Ултразвуковата обработка във вана не може да осигури такъв контрол. Ултразвуковите почистващи вани и резервоари осигуряват само ниска ултразвукова енергия, което води до непълна подготовка, а кавитацията възниква неравномерно, така че всяка епруветка се обработва според положението си във ваната. VialTweeter предава интензивни, фокусирани ултразвукови сили директно през стената на съда едновременно към до 10 запечатани проби. Обработките, които изискват продължително въздействие с променлива продължителност във вана, се изпълняват по стандартизирана импулсна схема.
Безконтактните ултразвукови апарати на Hielscher прилагат интензивен, фокусиран ултразвук през стените на затворени флакони. VialTweeter обработва до 10 флакона едновременно с еднакъв интензитет, без сонда в пробата, без кръстосано замърсяване и без отделяне на аерозоли. Когато изискванията за капацитет за обработка го налагат, ултразвуковите апарати за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP разширяват същото контролирано предаване на енергия към многоямкови плаки.
VialTweeter обработва с ултразвук до 10 по-малки флакона и до 5 по-големи епруветки едновременно.
Предимства на безконтактната ултразвукова дезагрегация
- Нулево кръстосано замърсяване: Тъй като флаконите остават постоянно затворени и в пробата не се потапя сонда, кръстосаното замърсяване и загубата на проба се избягват напълно. Няма нищо за стерилизиране между пробите и един цикъл на обработка не може да повлияе на следващия.
- Защита от аерозоли: Ултразвуковата обработка със сонда в отворен съд генерира инфекциозни аерозоли и замърсява повърхностите на апарата. Ултразвуковата обработка в запечатан флакон задържа пробата в собствената ѝ епруветка, което е съществено при работа с патогенни бактерии като Mycobacterium tuberculosis и други агенти от нива BSL-2 или BSL-3.
- Без ерозия на върха: Титановите сонди могат да отделят малко количество микрочастици в пробата по време на работа. Тези частици променят оптичната плътност и броя на частиците при последващите измервания. Непряката ултразвукова обработка през стената на съда премахва изцяло този източник на твърди частици.
- Равномерен капацитет за обработка: VialTweeter подава ултразвук с еднакъв интензитет към всеки от до 10 флакона, така че резултатите от ултразвуковата обработка са еднородни и възпроизводими. Ефектите от положението, които затрудняват работата с вани и обработката на единични проби със сонда, изчезват, а базовите ви стойности остават сравними между повторенията.
- Цялост на пробата: епруветките остават затворени през цялата обработка, така че пробата не може да бъде замърсена, развалена или изпарена. Малките обеми могат да се обработват без разреждане, включително ценни клинични утайки, които не позволяват допълнителна стъпка на прехвърляне.
- Контрол на процеса: Амплитудата се регулира от 20 до 100%, импулсният режим – от 0 до 100%, а системите поддържат наблюдение на температурата, така че термочувствителните щамове и протеини да остават под праговете на увреждане.
Типични приложения
- Анализ на микробиома и чревното съдържимо: диспергиране на Lactobacillus, Bifidobacterium и фекални проби преди посявка върху плаки или секвениране, така че струпванията да не водят до занижени резултати от преброяването.
- Микробиология на храни и вода: дезагрегация на флокули в проби от тампони, промивни течности и обогатителни бульони за точно определяне на броя на колониите и жизнеспособността.
- Изследване на биофилми: извличане на клетки от носители и повърхности като суспензии от единични клетки, без ензимна обработка, която би отстранила повърхностните протеини.
- Клинична диагностика: ресуспендиране на храчки, гной и елуати от тампони при условия на изолиране на пробата.
- Клетъчни култури: разделяне на струпани агрегати от клетки на бозайници, насекоми и CHO преди преброяване и пасажиране.
- Подготовка за целия работен процес: същият апарат, който дезагрегира при ниска амплитуда, извършва пълно разрушаване на клетките при по-високи настройки, така че лизисът, екстракцията на протеини и фрагментацията на ДНК следват без прехвърляне между епруветки.
Ултразвуков апарат за многоямкови плаки UIP400MTP за деагломерация на клетъчни струпвания с висок капацитет за обработка
Освен многоямкови плаки моделите ултразвукови апарати за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP обработват и стативи с епруветки.
Намерете подходящия ултразвуков апарат за вашия работен процес за дезагрегация
Ултразвуков апарат за множество епруветки VialTweeter
Предпочитаният метод за стерилна дезагрегация в запечатани флакони. Задвижван от 200-ватовия процесор UP200St при 26 kHz с автоматична настройка, VialTweeter предава ултразвук непряко през стените на до 10 затворени флакона едновременно, с до 10 W на епруветка, за еднородни и възпроизводими резултати без кръстосано замърсяване и без загуба на проба. Титановият сонотрод VialTweeter може да се автоклавира, а амплитудата и импулсите могат да се регулират и запазват, което осигурява диапазона на контрол, необходим за протокол за деагломерация. Стандартният сонотрод с 10 позиции побира флакони за автоматичен пробовземач, микроцентрофужни епруветки и епруветки Eppendorf или Nunc с обем от 1 до 5 mL. Затягащото устройство VialPress побира до 5 по-големи съда с диаметър до 20 mm.
Предлагат се специализирани модели VialTweeter за единична епруветка Falcon и за единични флакони, адаптирани към размера на съда. Демонтирайте блоковия сонотрод и основният модул UP200St работи като конвенционален ултразвуков апарат със сонда за директна обработка на малки до средни проби.
Ултразвукови апарати за микроплаки
Мащабиране към подготовка на проби с висок капацитет за обработка чрез ултразвукова обработка на многоямкови плаки: за работни процеси с плаки ултразвуковите апарати за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP разширяват безконтактната, равномерна ултразвукова обработка от десет епруветки до цяла плака.
400-ватовият UIP400MTP обработва стандартни микротитърни и многоямкови плаки, включително формати с 96 ямки, с прецизен контрол на амплитудата, мощността и импулсите, както и с таймер, температурна сонда и охлаждане с водна баня. Отделянето на биофилми и обработката на бактериални култури са утвърдени приложения на ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP.
550-ватовият UIP550MTP е по-мощният вариант – идеален за по-взискателни приложения.
И двете системи за безконтактна ултразвукова обработка надеждно обработват плаки с 6, 12, 24, 48, 96 и 384 ямки, както и стативи с епруветки и петриеви панички. Ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher работят с всяка стандартна плака, като избягват скъпите консумативи, специфични за производителя. С програмируеми температурни граници ултразвуковата обработка спира автоматично при максималната температура на пробата и се възобновява след охлаждане, като запазва жизнеспособността при повтарящи се цикли. Интелигентна и надеждна подготовка на проби с висок капацитет за обработка за повторяеми резултати.
Таблицата по-долу представя общ преглед на приблизителния капацитет за обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати за проби, използвани в науките за живота, геномиката, протеомиката и диагностиката:
| Препоръчителни устройства | Обем на партидата | Дебит |
|---|---|---|
| Ултразвуков апарат за множество епруветки VialTweeter | флакони от 0,5 до 1,5mL | n.a. |
| Ултразвуков апарат за многоямкови плаки UIP400MTP (440 вата) | многоямкови / микротитърни плаки | n.a. |
| Ултразвуков апарат за многоямкови плаки UIP550MTP (550 вата) | многоямкови / микротитърни плаки | n.a. |
| Ултразвуков CupHorn | CupHorn за флакони или бехерова чаша | n.a. |
| Ултразвуков апарат със сонда UP100H с мощност 100 вата | от 1 до 500mL | от 10 до 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St модели ултразвукови апарати със сонда с мощност 200 вата | от 10 до 1000mL | от 20 до 200mL/min |
| Ултразвуков апарат със сонда UP400St с мощност 400 вата | от 10 до 2000mL | от 20 до 400mL/min |
| GDmini2 | стерилен ултразвуков микропроточен реактор | n.a. |
| Ултразвуков ситов вибратор | n.a. | n.a. |
Често задавани въпроси за ултразвуковата дезагрегация на клетките
Каква е разликата между клетъчна дезагрегация и клетъчен лизис?
Дезагрегацията, наричана още деагломерация, разделя струпаните клетки в суспензия от единични клетки, като клетките остават неповредени и жизнеспособни. Лизисът разкъсва клетъчната обвивка и освобождава вътреклетъчното съдържимо. И двата процеса се задвижват от кавитационно срязване, а разликата е във вложената енергия. С оптимизирани настройки за амплитуда, импулси и температура ултразвуковата обработка постига дезагрегация под прага на лизис.
Защо ултразвуковите вани не са подходящи за стандартизирана дезагрегация?
Ваните осигуряват само ниска ултразвукова енергия, което води до непълна подготовка, а кавитацията се развива много неравномерно в резервоара, така че всяка проба получава различна обработка в зависимост от положението си. Микробиологичните преброявания и сравнителните изследвания зависят от сравнимостта. Безконтактните ултразвукови апарати като апарата за множество епруветки VialTweeter, както и моделите за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP, обработват всички съдове при регулирани ултразвукови условия, което подобрява възпроизводимостта между повторенията.
Може ли ултразвуковата обработка да увреди клетките?
Да, ако параметрите не се контролират. Прекомерната ултразвукова обработка или неконтролираното нагряване могат да увредят клетките, а освободената ДНК прави пробите вискозни и подпомага повторната агрегация. Затова процесът трябва да бъде разработен целенасочено: умерената амплитуда, импулсните цикли, охлаждането и апаратите с ограничаване на температурата поддържат обработката в областта на дезагрегацията по кривата.
Всички цифрови ултразвукови апарати на Hielscher предлагат прецизно контролируеми параметри, включваеми температурни сензори, програмируеми настройки и автоматично регистриране на данни за надеждна подготовка на проби.
Трябва ли пробата да се прехвърли в друг съд?
Не. Флаконите и плаките се обработват в оригиналните си затворени съдове. Непряката ултразвукова обработка избягва както загубите при прехвърляне, така и пренасянето на остатъци, свързано с манипулирането със сонда.
Какви формати флакони може да обработва VialTweeter?
Стандартният сонотрод с 10 позиции побира флакони за автоматичен пробовземач, микроцентрофужни епруветки и епруветки Eppendorf или Nunc с обем от 1 до 5 mL. Принадлежността VialPress побира до 5 по-големи съда с диаметър до 20 mm. Предлагат се специализирани модели VialTweeter за единична епруветка Falcon и за персонализирани формати за единичен флакон или по-големи съдове.
Мога ли да извършвам дезагрегация и лизис с един апарат?
Да. Същата конфигурация, която дезагрегира при умерена амплитуда, извършва пълно разрушаване на клетките при по-висока амплитуда и по-продължително въздействие, така че получаването на суспензия от единични клетки и последващата екстракция могат да се изпълняват последователно без смяна на платформата.
Използва ли се ултразвукова обработка в MBEC анализи?
Ултразвуковата обработка е утвърден и до голяма степен стандартен компонент. При MBEC анализа с капак с щифтове, след като биофилмите бъдат отгледани върху полистиренови щифтове и изложени на антибиотик, щифтовете се прехвърлят в прясна среда и се подлагат на разбъркване с вортекс и ултразвукова обработка, за да се отделят и дезагрегират прилепналите клетки от биофилма в планктонна суспензия преди серийно разреждане и преброяване на жизнеспособните клетки (MBEC се отчита като най-ниската концентрация, която намалява броя на извлечените клетки с ≥3 log10 спрямо нетретиран биофилм). Ултразвуковата обработка значително подобрява качеството на диспергирането: непълното освобождаване на клетките, вградени в EPS матрикса, води до подценяване на ерадикацията и завишава стойностите на MBEC. Целенасочената ултразвукова обработка на ямките, в които се поставят щифтовете, във всички плаки за анализа с ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP преодолява традиционните слабости на ултразвуковата обработка във вана – а именно неравномерното разпределение на енергията, нагряването и риска от аерозоли/кръстосано замърсяване.
Научете как безконтактният ултразвуков апарат за микроплаки UIP400MTP улеснява MBEC анализите!
Използва ли се ултразвукова обработка в MIC анализи?
Ултразвуковата обработка се прилага в различни работни процеси, свързани с MIC, за подобряване на ефективността и възпроизводимостта:
- микобактериология, където храчките и други вискозни проби рутинно се деконтаминират и хомогенизират, понякога с ултразвукова обработка, преди изследване на чувствителността, а краткото диспергиране на микобактериални инокулуми, образуващи струпвания, спомага за точно определяне на MIC;
- организми, склонни към агрегация (напр. стрептококи, стафилококи в утайки), при които микроагрегатите изкривяват плътността на инокулума; и
- комбинирана диагностика, като култивиране на течност от ултразвукова обработка на импланти, последвано от изследване на чувствителността при инфекция на протезна става (приложение, подобно на MBEC, а не класически MIC анализ).
Открийте приложението на ултразвуковата обработка за MIC анализи!
Литература / Източници
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Изберете своя плака! Ултразвуковият апарат за микроплаки UIP550MTP дезагрегира бактериални проби във всяка стандартна многоямкова плака.
Моделите ултразвукови апарати за множество проби на Hielscher UIP400MTP за микроплаки, VialTweeter и CupHorn: подготовка на проби с висока скорост и висок капацитет за обработка