การสลาย Sonication: การหยุดชะงักของเซลล์ & การสกัด

การสลายตัวของเซลล์หรือสลายเป็นส่วนที่พบบ่อยของการเตรียมความพร้อมประจำวันในห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ เป้าหมายของการสลายคือการทำลายส่วนของผนังเซลล์หรือเซลล์ที่สมบูรณ์เพื่อปล่อยโมเลกุลทางชีวภาพ ที่เรียกว่า lysate สามารถประกอบด้วยในตัวเช่นพลาสม่ากลาง, รับ assays, โปรตีน, ดีเอ็นเอ, RNA ฯลฯ. ขั้นตอนต่อไปของการสลายมีการทำให้เป็น fractionation แยกออร์แกนิกหรือการสกัดโปรตีนและการทำให้บริสุทธิ์ วัสดุที่สกัด (= lysate) จะต้องแยกออกและอยู่ภายใต้การสืบสวนหรือการใช้งานเพิ่มเติมเช่นสำหรับการวิจัย proteomic Homogenizers อัลตราโซนิกเป็นเครื่องมือทั่วไปสำหรับการสลายเซลล์ที่ประสบความสำเร็จ ในฐานะที่เป็นความเข้มข้นล้ำสามารถปรับระดับได้โดยการเปลี่ยนพารามิเตอร์กระบวนการความเข้ม sonication ที่ดีที่สุดจากนุ่มมากที่จะยากมากสามารถตั้งค่าเป็นรายบุคคลสำหรับแต่ละสารและสื่อเพื่อตอบสนองความต้องการของโปรแกรมที่เฉพาะเจาะจง

โครงสร้างของเซลล์

เซลล์มีการป้องกันโดยเยื่อหุ้มพลาสม่ากึ่งดูดซึมซึ่งประกอบด้วยใน bilayer phospho-ไขมัน (เช่นโปรตีนไขมัน bilayer; เกิดขึ้นจากไขมันไม่ชอบน้ำและโมเลกุลฟอสฟอรัสกับน้ำด้วยการฝังตัวโมเลกุลของโปรตีน) และสร้างอุปสรรคระหว่างการตกแต่งภายในเซลล์ (พลาสซึม) และ สภาพแวดล้อม extracellular เซลล์พืชและเซลล์โปรคาริโอถูกล้อมรอบด้วยผนังเซลล์ เนื่องจากหลายชั้นผนังเซลล์หนาของเซลลูโลสเซลล์พืชยากที่จะ Lyse กว่าเซลล์สัตว์ การตกแต่งภายในเซลล์เช่น organelles นิวเคลียส, mitochondrion มีเสถียรภาพโดยโครงร่าง
โดย lysing เซลล์ก็จะมุ่งเป้าไปที่การสกัดและแยก organelles โปรตีนดีเอ็นเอ mRNA หรือสารชีวโมเลกุลอื่น ๆ

สกัดอัลตราโซนิกในเซลล์พืช: ส่วนกล้องจุลทรรศน์ขวาง (TS) แสดงให้เห็นถึงกลไกของการกระทำในระหว่างการสกัดล้ำจากเซลล์ (ขยาย 2000x) [ทรัพยากร: Vilkhu et al. ๒๐๑๑]

วิธีการ

มีหลายวิธีที่จะ lysate เซลล์ซึ่งสามารถแบ่งออกเป็นวิธีทางกลและทางเคมีซึ่งรวมถึงการใช้ผงซักฟอกหรือตัวทำละลาย, การประยุกต์ใช้ความดันสูงหรือการใช้งานของโรงสีลูกปัดหรือกดฝรั่งเศสที่มี ข้อเสียที่มีปัญหามากที่สุดของวิธีการเหล่านี้คือการควบคุมยากและการปรับตัวของพารามิเตอร์กระบวนการและจึงส่งผลกระทบต่อ
ข้อเสียที่สำคัญของวิธีการสลายการร่วมกัน:

ตาราง: วิธีการทั่วไปของการสลายเซลล์มีข้อเสียที่สำคัญ

ในทางตรงกันข้าม sonication เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพและเชื่อถือได้สำหรับการสลายตัวมือถือที่ช่วยให้การควบคุมที่สมบูรณ์มากกว่าพารามิเตอร์ sonication ซึ่งจะทำให้การคัดสรรวัสดุที่สูงในการเปิดตัวผลิตภัณฑ์และความบริสุทธิ์ [Balasundaram et al, 2009] มันเหมาะกับเซลล์ทุกประเภทได้อย่างง่ายดายและบังคับใช้ในขนาดเล็กและขนาดใหญ่ Ultrasonicators จะง่ายต่อการทำความสะอาด homogenizer ล้ำเสมอให้บริการ (SIP) ฟังก์ชั่นการทำความสะอาดในสถานที่ (CIP) และฆ่าเชื้อในสถานที่ sonotrode ประกอบด้วยในฮอร์นไททาเนียมขนาดใหญ่ซึ่งสามารถเช็ดหรือล้างน้ำหรือตัวทำละลาย (ขึ้นอยู่กับขนาดกลางที่ทำงาน) การบำรุงรักษาของ ultrasonicators เป็นเพราะความแข็งแกร่งของพวกเขาเกือบ neglectable

สลาย

สลายเป็นกระบวนการที่มีความละเอียดอ่อน ในระหว่างการสลายการป้องกันของเยื่อหุ้มเซลล์ถูกทำลาย แต่การใช้งาน, สูญเสียสภาพธรรมชาติและการย่อยสลายของโปรตีนที่สกัดจากสภาพแวดล้อมที่ร่างกายอย่างผิดปกติ (การเบี่ยงเบนจากค่า pH) จะต้องได้รับการป้องกัน ดังนั้นในการสลายทั่วไปจะดำเนินการในการแก้ปัญหาบัฟเฟอร์ ปัญหาส่วนใหญ่เกิดขึ้นจากการหยุดชะงักของเซลล์ที่ไม่สามารถควบคุมผลในการเปิดตัวที่ไม่ตรงเป้าหมายของวัสดุภายในเซลล์ทั้งหมดและ / หรือสูญเสียสภาพธรรมชาติของผลิตภัณฑ์เป้าหมาย

อัลตราโซนิกสลาย

โดยทั่วไปการสลายตัวอย่างในห้องปฏิบัติการจะใช้เวลาระหว่าง15วินาทีและ2นาที ในฐานะที่เป็นความรุนแรงของ sonication เป็นเรื่องง่ายมากที่จะปรับโดยการตั้งค่าความกว้างเวลา sonication เช่นเดียวกับการเลือกอุปกรณ์ที่เหมาะสมก็เป็นไปได้ที่จะทำลายเยื่อหุ้มเซลล์อย่างอ่อนโยนหรือกะทันหันขึ้นอยู่กับโครงสร้างของเซลล์และวัตถุประสงค์ของการสลาย ( เช่นการสกัดดีเอ็นเอต้อง sonication นุ่มการสกัดโปรตีนที่สมบูรณ์ของแบคทีเรียต้องมีการรักษาอัลตราซาวนด์ที่รุนแรงมากขึ้น) อุณหภูมิในระหว่างกระบวนการสามารถตรวจสอบได้โดยเซ็นเซอร์อุณหภูมิแบบบูรณาการและสามารถควบคุมได้อย่างง่ายดายโดยการระบายความร้อน (น้ำแข็งหรือเซลล์ไหลด้วยแจ็คเก็ตระบายความร้อน) หรือ sonication ในโหมดการทำงาน ในระหว่าง sonication โหมดชีพจร sonication สั้นระเบิดรอบของระยะเวลา1-15 วินาทีช่วยให้การกระจายความร้อนและเย็นในช่วงระยะเวลานาน
ทุกกระบวนการอัลตราซาวนด์ที่ขับเคลื่อนด้วยจะสมบูรณ์ทำซ้ำและปรับขนาดได้เป็นเส้นตรง

อัลตราโซนิก Homogenizers

ประเภทต่างๆของ อุปกรณ์อัลตราโซนิก อนุญาตให้มีการจับคู่เป้าหมายการเตรียมสารตัวอย่างและเพื่อให้มั่นใจง่ายดายในการใช้การดำเนินงานและความสะดวกสบาย Probe ชนิด ultrasonicators เป็นอุปกรณ์ที่พบมากที่สุดในห้องปฏิบัติการ พวกเขาจะเหมาะที่สุดสำหรับการเตรียมความพร้อมของกลุ่มตัวอย่างขนาดเล็กและขนาดกลางที่มีปริมาณ 0.1ml ถึง 1000ml ขนาดพลังงานที่แตกต่างและ sonotrodes อนุญาตให้มีการปรับตัวเพื่อ ultrasonicator ปริมาณตัวอย่างและเรือเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ sonicating มีประสิทธิภาพมากที่สุดและมีประสิทธิภาพ อุปกรณ์การสอบสวนอัลตราโซนิกเป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดเมื่อตัวอย่างเดียวจะต้องมีการจัดทำ

หากตัวอย่างเพิ่มเติมจะต้องเตรียมตัวเช่น8ขวดของการแก้ปัญหาเซลล์อุปกรณ์เช่น VialTweeter หรือ cuphorn อัลตราโซนิกเป็นที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการสลาย หลายขวดจะ sonicated มีในเวลาเดียวกัน, ที่ความเข้มเดียวกัน. นี้ช่วยประหยัดเวลาเท่านั้นแต่ยังมั่นใจได้ในการรักษาตัวอย่างทั้งหมดเช่นเดียวกันซึ่งทำให้ผลลัพธ์ในหมู่ตัวอย่างที่เชื่อถือได้และเปรียบเทียบได้ นอกจากนี้การปนเปื้อนข้ามโดยนำ sonotrode อัลตราโซนิก (หรือที่เรียกว่าการสอบสวนอัลตราโซนิกฮอร์นปลายหรือนิ้ว) จะหลีกเลี่ยง เนื่องจากขวดจะใช้, การทำความสะอาดเวลานานและการสูญเสียตัวอย่างเนื่องจากการผุของเรือจะถูกละเว้น.
สำหรับปริมาณที่เพิ่มขึ้นเช่น สำหรับการผลิตในเชิงพาณิชย์ของสารสกัดจากเซลล์ระบบอัลตราโซนิกอย่างต่อเนื่องกับเครื่องปฏิกรณ์เซลล์ไหลมีความเหมาะสมมากที่สุด อย่างต่อเนื่องและแม้กระทั่งการไหลของวัสดุแปรรูปมั่นใจแม้ sonication พารามิเตอร์ทั้งหมดของกระบวนการสลายตัวอัลตราโซนิกสามารถเพิ่มประสิทธิภาพและปรับปรุงความต้องการของการประยุกต์ใช้และวัสดุเซลล์ที่เฉพาะเจาะจง
ขั้นตอนที่เป็นแบบอย่างสำหรับ lysing ล้ำของเซลล์แบคทีเรีย

• การเตรียมเซลล์ระงับ: เม็ดมือถือจะต้องถูกระงับอย่างสมบูรณ์ในสารละลายบัฟเฟอร์โดยการผสมยาง (เลือกสารละลายบัฟเฟอร์ของคุณเข้ากันได้กับการวิเคราะห์ต่อไปนี้วิธีโครมาโตที่เฉพาะเจาะจงเช่น) เพิ่ม lysozymes และ / หรือสารอื่น ๆ ถ้าจำเป็น (พวกเขาจะต้องยังเข้ากันได้กับการแยก / บริสุทธิ์หมายถึง) ผสม / เนื้อเดียวกันวิธีการแก้เบา ๆ ภายใต้ sonication อ่อนจนระงับสมบูรณ์จะประสบความสำเร็จ
• อัลตราโซนิกสลาย: วางตัวอย่างในอ่างน้ำแข็ง สำหรับการหยุดชะงักของเซลล์ sonicate ระงับที่ 60-90 ระเบิดสอง (ใช้โหมดการเต้นของชีพจร ultrasonicator ของคุณ)
• แยก: แปะ lysate (. เช่น 10 นาทีที่ 10,000 x กรัมที่ 4degC) เฉพาะกิจใสจากตะกอนเซลล์อย่างระมัดระวัง ใสเป็น lysate มือถือทั้งหมด หลังจากการกรองสารละลายที่คุณได้รับของเหลวชี้แจงของโปรตีนของเซลล์ที่ละลายน้ำได้

การใช้งานที่พบมากที่สุดสำหรับ ultrasonicators ในทางชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ ได้แก่ :

• การเตรียมสารสกัดจากเซลล์
• การหยุดชะงัก ของยีสต์แบคทีเรียเซลล์พืชนุ่ม & เซลล์เนื้อเยื่อแข็งวัสดุนิวคลีอิก
• การสกัดโปรตีน
• การเตรียมและการแยกของเอนไซม์
• การผลิตแอนติเจน
• สกัดดีเอ็นเอและ / หรือการกำหนดเป้าหมายการกระจายตัว
• เตรียมไลโปโซม