การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์: การทำลายเซลล์และการสกัด
การสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์เป็นเทคนิคการเตรียมตัวอย่างที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่ วัตถุประสงค์หลักคือการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์หรือเซลล์ทั้งเซลล์เพื่อปลดปล่อยองค์ประกอบภายในเซลล์ เช่น โปรตีน กรดนิวคลีอิก หรือออร์แกเนลล์ ในงานห้องปฏิบัติการประจำวัน การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์จึงเป็นวิธีมาตรฐานสำหรับการทำลายเซลล์อย่างควบคุมได้และการสกัดชีวโมเลกุลอย่างมีประสิทธิภาพ ข้อได้เปรียบสำคัญของเครื่องอัลตราซาวนด์อยู่ที่ความสามารถในการปรับพารามิเตอร์สำคัญของกระบวนการได้อย่างแม่นยำ รวมถึงความเข้มของอัลตราซาวนด์ การทำงานแบบพัลส์ และการควบคุมอุณหภูมิ การควบคุมนี้ช่วยให้นักวิจัยสลายเซลล์ได้อย่างเชื่อถือได้ พร้อมลดความเสียหายจากความร้อนหรือแรงเชิงกลต่อชีวโมเลกุลที่ไวต่อความเสียหายให้น้อยที่สุด ส่งผลให้กระบวนการสกัดมีความอ่อนโยนและมีประสิทธิภาพสูง
การสลายเซลล์โดยใช้เครื่องอัลตราซาวนด์
การสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์ใช้คาวิเทชันทางเสียงเพื่อทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และปลดปล่อยโมเลกุลภายในเซลล์ Hielscher Ultrasonics มีทั้งเครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบทั่วไปและเครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับหลายตัวอย่างเพื่อการประมวลผลในสภาวะปลอดเชื้อ ได้แก่ VialTweeter สำหรับหลอดและขวดตัวอย่างหลายใบ และเครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับเพลต 96 หลุม UIP400MTP สำหรับไมโครเพลตมาตรฐาน
Hielscher Ultrasonics จัดหาเครื่องอัลตราซาวนด์แบบไม่สัมผัสที่มีกำลังสูงสำหรับการเตรียมตัวอย่างและการวิเคราะห์ทางคลินิก เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับเพลตหลายหลุม UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn และเครื่องอัลตราซาวนด์แบบไหล GDmini2 ประมวลผลตัวอย่างภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ
เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์ UP100H (100 วัตต์) และ UP400St (400 วัตต์): การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์และสกัด
เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์สำหรับการสลายเซลล์และการสกัด
| ประเภทอุปกรณ์อัลตราซาวนด์ | การใช้งานหลัก | ปริมาตรตัวอย่าง | กรณีใช้งานทั่วไป | ข้อได้เปรียบ | ตัวอย่างรุ่น |
|---|---|---|---|---|---|
| เครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบ | การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับตัวอย่างเดี่ยว | 0.1 mL ถึง ~1000 mL | การสลายเซลล์ การสกัดโปรตีน การตัด DNA/RNA เป็นชิ้นส่วน | ควบคุมพลังงานได้อย่างแม่นยำ; มีโซโนโทรดหลากหลายแบบ; เหมาะสมที่สุดสำหรับตัวอย่างขนาดเล็กถึงปานกลาง | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | การประมวลผลขวดตัวอย่างที่ปิดผนึกหลายใบแบบขนาน | ขวดตัวอย่าง 8–10 ใบ (ใบละ ~1–20 mL) | การสลายสารแขวนลอยเซลล์หลายตัวอย่างตามมาตรฐานเดียวกัน | ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์อย่างสม่ำเสมอ; หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามตัวอย่าง; ให้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้ | VialTweeter, CupHorn |
| เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับเพลต 96 หลุม | การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับเพลตหลายหลุมและไมโครไทเทอร์เพลต | รูปแบบไมโครเพลต | การคัดกรองตัวอย่างจำนวนมาก โปรตีโอมิกส์ การทดสอบเซลล์ | ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์พร้อมกันอย่างสม่ำเสมอทั่วทุกหลุม; เหมาะอย่างยิ่งสำหรับขั้นตอนการทำงานกับหลายตัวอย่าง | UIP400MTP |
| เครื่องปฏิกรณ์แบบเซลล์ไหล | การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์อย่างต่อเนื่องสำหรับปริมาตรที่มากขึ้น | >1 L, ขยายขนาดได้ | การทำลายเซลล์ในระดับอุตสาหกรรม การผลิตสารสกัด | ประมวลผลอย่างต่อเนื่อง; ขยายขนาดได้; ควบคุมกระบวนการได้อย่างครบถ้วน (แอมพลิจูด ความดัน อุณหภูมิ) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + เซลล์ไหล |
| ระบบอัลตราซาวนด์แบบปลอดเชื้อ / แบบทางอ้อม | การประมวลผลตัวอย่างโดยปราศจากการปนเปื้อน | ขึ้นอยู่กับขวดตัวอย่าง/หลอด/ไมโครเพลต | ตัวอย่างที่ไวต่อความเสียหาย สภาพแวดล้อมปลอดเชื้อ บริบทที่อยู่ภายใต้ข้อกำหนดของหน่วยงานกำกับดูแล | ไม่มีการสัมผัสกับโพรบ; หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนตกค้างจากตัวอย่างก่อนหน้า; ใช้ความพยายามในการทำความสะอาดน้อยที่สุด | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
ข้อได้เปรียบของการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์
เมื่อเทียบกับวิธีสลายเซลล์และสกัดแบบอื่น การสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์มีข้อได้เปรียบหลายประการ:
- ความรวดเร็ว: การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์เป็นวิธีที่รวดเร็ว สามารถทำให้เซลล์แตกออกได้ภายในเวลาเพียงไม่กี่วินาที วิธีนี้เร็วกว่าวิธีอื่นมาก เช่น การโฮโมจีไนซ์ การแช่แข็งและละลาย หรือการบดด้วยเม็ดบีด
- ประสิทธิภาพ: การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์สามารถใช้ประมวลผลตัวอย่างขนาดเล็ก ขนาดใหญ่ หรือหลายตัวอย่างพร้อมกันได้ จึงมีประสิทธิภาพสูงกว่าวิธีอื่นที่ต้องประมวลผลตัวอย่างขนาดเล็กทีละตัวอย่าง
- ปราศจากสารเคมี: การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์เป็นวิธีที่ไม่รุกล้ำ ซึ่งไม่จำเป็นต้องใช้สารเคมีที่รุนแรงหรือเอนไซม์ จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการใช้งานที่ต้องรักษาความสมบูรณ์ของสารภายในเซลล์ สามารถหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนที่ไม่พึงประสงค์ในตัวอย่างได้
- ผลผลิตสูง: การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์สามารถสกัดสารภายในเซลล์ได้ในปริมาณสูง รวมถึง DNA, RNA และโปรตีน เนื่องจากคลื่นเสียงความถี่สูงทำให้ผนังเซลล์แตกออกและปลดปล่อยสารภายในออกสู่สารละลายโดยรอบ
- การควบคุมอุณหภูมิ: เครื่องอัลตราซาวนด์ที่มีระบบการทำงานขั้นสูงช่วยให้ควบคุมอุณหภูมิของตัวอย่างได้อย่างแม่นยำ เครื่องอัลตราซาวนด์ดิจิทัลของ Hielscher มีเซนเซอร์วัดอุณหภูมิแบบเสียบต่อได้และซอฟต์แวร์ติดตามอุณหภูมิ
- ทำซ้ำได้: โพรโทคอลสำหรับการสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์สามารถทำซ้ำได้ง่าย และยังปรับให้เหมาะกับปริมาตรตัวอย่างที่ใหญ่ขึ้นหรือเล็กลงได้ด้วยการขยายขนาดแบบเชิงเส้นอย่างง่าย
- อเนกประสงค์: การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์สามารถใช้สกัดเซลล์ได้หลากหลายชนิด รวมถึงแบคทีเรีย ยีสต์ รา เซลล์พืช และเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม อีกทั้งยังใช้สกัดโมเลกุลได้หลายประเภท รวมถึงโปรตีน DNA, RNA และลิพิด
- การเตรียมตัวอย่างจำนวนมากพร้อมกัน: Hielscher Ultrasonics มีโซลูชันหลายรูปแบบสำหรับการประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากได้อย่างสะดวกภายใต้สภาวะกระบวนการที่เหมือนกันทุกประการ ทำให้ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างด้วยการสลายเซลล์และการสกัดมีประสิทธิภาพสูงและประหยัดเวลา
- ใช้งานง่าย: อุปกรณ์สลายเซลล์และสกัดด้วยอัลตราซาวนด์ใช้งานง่ายและต้องการการฝึกอบรมเพียงเล็กน้อย อุปกรณ์ยังมีความคุ้มค่าทางเศรษฐกิจ เนื่องจากเป็นการลงทุนเพียงครั้งเดียวโดยไม่จำเป็นต้องซื้อวัสดุสิ้นเปลืองแบบใช้แล้วทิ้งมาทดแทน จึงเป็นทางเลือกที่น่าสนใจสำหรับนักวิจัยและห้องปฏิบัติการหลากหลายประเภท
โดยรวมแล้ว การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์เป็นวิธีสกัดสารภายในเซลล์ที่รวดเร็ว มีประสิทธิภาพ ควบคุมได้อย่างแม่นยำ และใช้งานได้หลากหลาย ข้อได้เปรียบเหนือวิธีทางเลือกอื่นทำให้วิธีนี้เป็นทางเลือกที่น่าสนใจสำหรับการใช้งานด้านการวิจัยและอุตสาหกรรมหลากหลายประเภท
หลักการทำงานของการสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์
การสลายเซลล์และการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์ใช้คลื่นเสียงความถี่สูงเพื่อทำลายเซลล์และสกัดสารภายใน คลื่นเสียงทำให้ความดันในของเหลวโดยรอบเปลี่ยนแปลง ส่งผลให้เกิดฟองขนาดเล็กและยุบตัวลงในกระบวนการที่เรียกว่าคาวิเทชัน ฟองเหล่านี้สร้างแรงเชิงกลเฉพาะจุดที่มีความรุนแรงสูงมาก ซึ่งสามารถทำให้เซลล์แตกออกและปลดปล่อยสารภายในออกสู่สารละลายโดยรอบ
การสลายเซลล์โดยใช้เครื่องอัลตราซาวนด์โดยทั่วไปประกอบด้วยขั้นตอนดังต่อไปนี้:
- ใส่ตัวอย่างลงในหลอดหรือภาชนะที่มีสารละลายบัฟเฟอร์
- สอดโพรบอัลตราซาวนด์ลงในตัวอย่าง แล้วใช้คลื่นเสียงความถี่สูงประมาณ 20–30 kHz
- คลื่นอัลตราซาวนด์ทำให้เกิดการสั่นและคาวิเทชันในของเหลวโดยรอบ ก่อให้เกิดแรงเฉพาะจุดที่ทำให้เซลล์แตกออกและปลดปล่อยสารภายใน
- ปั่นเหวี่ยงหรือกรองตัวอย่างเพื่อกำจัดเศษเซลล์ แล้วเก็บสารที่สกัดได้เพื่อนำไปวิเคราะห์ในขั้นตอนถัดไป
ข้อเสียของวิธีสลายเซลล์ที่ใช้กันทั่วไป
ระหว่างการทำงานในห้องปฏิบัติการ ท่านอาจเคยประสบความยุ่งยากในการสลายเซลล์โดยใช้โพรโทคอลการสลายเซลล์ด้วยวิธีเชิงกลหรือทางเคมีแบบดั้งเดิมมาแล้ว
- การสลายเซลล์ด้วยวิธีเชิงกล: วิธีสลายเซลล์เชิงกล เช่น การบดด้วยครกและสาก หรือการโฮโมจีไนซ์โดยใช้เครื่องอัดแบบเฟรนช์เพรส เครื่องบดเม็ดบีด หรือระบบโรเตอร์–สเตเตอร์ มักขาดตัวเลือกในการควบคุมและปรับตั้งอย่างแม่นยำ ซึ่งหมายความว่าการบดและการโม่สามารถก่อให้เกิดความร้อนและแรงเฉือนได้อย่างรวดเร็ว โดยอาจทำให้ตัวอย่างเสียหายและโปรตีนเสียสภาพ นอกจากนี้ วิธีเหล่านี้อาจใช้เวลานานและต้องใช้วัสดุตั้งต้นในปริมาณมาก
- การสลายเซลล์ด้วยวิธีทางเคมี: วิธีสลายเซลล์ทางเคมี เช่น การสลายเซลล์โดยใช้สารซักฟอก สามารถทำให้ตัวอย่างเสียหายจากการทำลายลิพิดสองชั้นและทำให้โปรตีนเสียสภาพ นอกจากนี้ อาจต้องใช้หลายขั้นตอนและอาจมีสารปนเปื้อนตกค้างซึ่งรบกวนการใช้งานในขั้นตอนถัดไป การหาปริมาณสารซักฟอกที่เหมาะสมที่สุดเป็นความท้าทายเพิ่มเติมอีกประการหนึ่ง
- รอบการแช่แข็งและละลาย: รอบการแช่แข็งและละลายสามารถทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตกได้ แต่การทำซ้ำหลายรอบอาจทำให้โปรตีนเสียสภาพและสลายตัวด้วย วิธีนี้อาจต้องทำหลายรอบ ซึ่งอาจใช้เวลานานและมักให้ผลผลิตต่ำลง
- การสลายเซลล์ด้วยเอนไซม์: วิธีสลายเซลล์ด้วยเอนไซม์อาจจำเพาะต่อเซลล์บางชนิดและต้องใช้หลายขั้นตอน จึงใช้เวลานาน อีกทั้งยังก่อให้เกิดของเสียและต้องปรับสภาวะให้เหมาะสมอย่างรอบคอบเพื่อหลีกเลี่ยงการสลายตัวของตัวอย่าง ชุดสลายเซลล์ด้วยเอนไซม์มักมีราคาแพง หากขั้นตอนการสลายเซลล์ด้วยเอนไซม์ที่ท่านใช้อยู่ให้ผลลัพธ์ไม่เพียงพอ สามารถใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เป็นวิธีเสริมฤทธิ์เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของการทำลายเซลล์ได้
เมื่อเทียบกับวิธีสลายเซลล์เชิงกลและทางเคมีแบบดั้งเดิม การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสูงมากและเชื่อถือได้สำหรับการทำให้เซลล์แตกสลาย โดยสามารถควบคุมพารามิเตอร์ของการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ได้อย่างครบถ้วน จึงรับประกันความจำเพาะสูงในการปลดปล่อยสารและความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ [cf. Balasundaram et al., 2009]
วิธีนี้เหมาะสำหรับเซลล์ทุกชนิดและนำไปใช้ได้ง่ายทั้งในขนาดเล็กและขนาดใหญ่ – ภายใต้สภาวะที่ควบคุมได้เสมอ เครื่องอัลตราซาวนด์ทำความสะอาดได้ง่าย เครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์มีฟังก์ชันการทำความสะอาดในที่ (CIP) และการทำให้ปราศจากเชื้อในที่ (SIP) เสมอ โซโนโทรดประกอบด้วยฮอร์นไทเทเนียมตันที่สามารถเช็ดหรือล้างด้วยน้ำหรือตัวทำละลายได้ (ขึ้นอยู่กับตัวกลางที่ใช้ในการทำงาน) เนื่องจากเครื่องอัลตราซาวนด์มีความทนทาน จึงแทบไม่ต้องบำรุงรักษา
การสลายและการทำลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์
โดยทั่วไป การสลายตัวอย่างในห้องปฏิบัติการใช้เวลาระหว่าง 15 วินาทีถึง 2 นาที เนื่องจากความเข้มของการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ปรับได้ง่ายมากด้วยการตั้งค่าแอมพลิจูดและระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ ตลอดจนการเลือกอุปกรณ์ที่เหมาะสม จึงสามารถทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างอ่อนโยนมากหรืออย่างฉับพลันมาก ขึ้นอยู่กับโครงสร้างเซลล์และวัตถุประสงค์ของการสลายเซลล์ (เช่น การสกัด DNA ต้องใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ที่อ่อนโยนกว่า ส่วนการสกัดโปรตีนจากแบคทีเรียอย่างครบถ้วนต้องใช้การประมวลผลด้วยอัลตราซาวนด์ที่เข้มข้นกว่า) สามารถติดตามอุณหภูมิระหว่างกระบวนการด้วยเซนเซอร์วัดอุณหภูมิที่ติดตั้งในเครื่อง และควบคุมได้ง่ายด้วยการทำความเย็น (อ่างน้ำแข็งหรือเซลล์ไหลที่มีแจ็กเก็ตหล่อเย็น) หรือด้วยการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในโหมดพัลส์ ระหว่างการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในโหมดพัลส์ รอบการปล่อยคลื่นช่วงสั้นที่มีระยะเวลา 1–15 วินาทีช่วยให้ระบายความร้อนและทำความเย็นได้ในช่วงหยุดพักระหว่างรอบที่ยาวกว่า
กระบวนการทั้งหมดที่ขับเคลื่อนด้วยอัลตราซาวนด์สามารถทำซ้ำได้อย่างสมบูรณ์และขยายขนาดได้แบบเชิงเส้น
VialTweeter เป็นเครื่องโฮโมจีไนเซอร์อัลตราซาวนด์สำหรับการเตรียมตัวอย่างจำนวนมากในสภาวะปลอดเชื้อพร้อมกันอย่างสม่ำเสมอและรวดเร็ว
- การเตรียมสารแขวนลอยเซลล์: ต้องทำให้ตะกอนเซลล์แขวนลอยอย่างสมบูรณ์ในสารละลายบัฟเฟอร์ด้วยการโฮโมจีไนซ์ (เลือกสารละลายบัฟเฟอร์ที่เข้ากันได้กับการวิเคราะห์ในขั้นตอนถัดไป เช่น วิธีโครมาโทกราฟีเฉพาะแบบ) เติมไลโซไซม์และ/หรือสารเติมแต่งอื่นหากจำเป็น (สารเหล่านี้ต้องเข้ากันได้กับวิธีแยก/ทำให้บริสุทธิ์ด้วย) ผสม/โฮโมจีไนซ์สารละลายอย่างอ่อนโยนภายใต้การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ระดับอ่อนจนได้สารแขวนลอยอย่างสมบูรณ์
อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเสริมฤทธิ์ของไลโซไซม์ร่วมกับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์! - การสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์: วางตัวอย่างในอ่างน้ำแข็ง สำหรับการทำลายเซลล์ ให้ใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับสารแขวนลอยเป็นช่วงละ 60–90 วินาที (โดยใช้โหมดพัลส์ของเครื่องอัลตราซาวนด์)
- การแยก: ปั่นเหวี่ยงไลเสต (เช่น 10 นาที ที่ 10,000 x g; ที่ 4degC) แยกของเหลวส่วนใสออกจากตะกอนเซลล์อย่างระมัดระวัง ของเหลวส่วนใสคือไลเสตเซลล์ทั้งหมด หลังจากกรองของเหลวส่วนใส ท่านจะได้ของเหลวที่ผ่านการทำให้ใสซึ่งมีโปรตีนเซลล์ที่ละลายได้
การใช้งานเครื่องอัลตราซาวนด์ที่พบมากที่สุดในชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพ ได้แก่:
- การเตรียมสารสกัดจากเซลล์
- การทำลายยีสต์ แบคทีเรีย เซลล์พืช เนื้อเยื่อเซลล์ชนิดอ่อนหรือแข็ง และสารนิวคลีอิก
- การสกัดโปรตีน
- การเตรียมและการแยกเอนไซม์
- การผลิตแอนติเจน
- การสกัด DNA และ/หรือการตัดเป็นชิ้นส่วนแบบมุ่งเป้า
- การเตรียมไลโปโซม
การทำลายเซลล์ด้วยเครื่องอัลตราซาวนด์แบบโพรบเป็นวิธีเตรียมตัวอย่างที่มีประสิทธิภาพ
การใช้งานอัลตราซาวนด์ที่หลากหลายครอบคลุมสาขาเทคโนโลยีชีวภาพ วิศวกรรมชีวภาพ จุลชีววิทยา ชีววิทยาระดับโมเลกุล ชีวเคมี ภูมิคุ้มกันวิทยา แบคทีเรียวิทยา ไวรัสวิทยา โปรตีโอมิกส์ พันธุศาสตร์ สรีรวิทยา ชีววิทยาของเซลล์ โลหิตวิทยา และพฤกษศาสตร์
การสลายเซลล์: การทำลายโครงสร้างเซลล์
เซลล์ได้รับการปกป้องด้วยเยื่อหุ้มพลาสมาชนิดเลือกผ่าน ซึ่งประกอบด้วยฟอสโฟลิพิดสองชั้น (หรือโปรตีน–ลิพิดสองชั้นเช่นกัน; เกิดจากลิพิดที่ไม่ชอบน้ำและโมเลกุลฟอสฟอรัสที่ชอบน้ำ โดยมีโมเลกุลโปรตีนฝังอยู่) และสร้างแนวกั้นระหว่างภายในเซลล์ (ไซโทพลาซึม) กับสภาพแวดล้อมภายนอกเซลล์ เซลล์พืชและเซลล์โพรแคริโอตล้อมรอบด้วยผนังเซลล์ เนื่องจากผนังเซลล์เซลลูโลสมีความหนาหลายชั้น เซลล์พืชจึงสลายได้ยากกว่าเซลล์สัตว์ องค์ประกอบภายในเซลล์ เช่น ออร์แกเนลล์ นิวเคลียส และไมโทคอนเดรีย ได้รับการค้ำจุนโดยโครงร่างเซลล์
การสลายเซลล์มีจุดมุ่งหมายเพื่อสกัดและแยกออร์แกเนลล์ โปรตีน DNA, mRNA หรือชีวโมเลกุลอื่น
วิธีสลายเซลล์แบบดั้งเดิมและข้อเสีย
มีวิธีสลายเซลล์หลายวิธี ซึ่งแบ่งได้เป็นวิธีเชิงกลและวิธีทางเคมี โดยรวมถึงการใช้สารซักฟอกหรือตัวทำละลาย การใช้ความดันสูง หรือการใช้เครื่องบดเม็ดบีดหรือเครื่องอัดแบบเฟรนช์เพรส ข้อเสียที่เป็นปัญหามากที่สุดของวิธีเหล่านี้คือความยากในการควบคุมและปรับพารามิเตอร์ของกระบวนการ รวมถึงผลกระทบที่เกิดขึ้นจากพารามิเตอร์เหล่านั้น
ตารางด้านล่างแสดงข้อเสียหลักของวิธีสลายเซลล์ที่ใช้กันทั่วไป:
ตาราง: วิธีสลายเซลล์แบบดั้งเดิมมีข้อเสียที่สำคัญ
ขั้นตอนการสลายเซลล์
การสลายเซลล์เป็นกระบวนการที่ละเอียดอ่อน ระหว่างการสลายเซลล์ การปกป้องจากเยื่อหุ้มเซลล์จะถูกทำลาย แต่ต้องป้องกันการสูญเสียฤทธิ์ การเสียสภาพ และการสลายตัวของโปรตีนที่สกัดได้อันเกิดจากสภาพแวดล้อมที่ไม่เป็นไปตามสภาวะทางสรีรวิทยา (การเบี่ยงเบนจากค่า pH) ดังนั้น โดยทั่วไปจึงสลายเซลล์ในสารละลายบัฟเฟอร์ ความยุ่งยากส่วนใหญ่เกิดจากการทำลายเซลล์ที่ควบคุมไม่ได้ ซึ่งส่งผลให้สารภายในเซลล์ทั้งหมดถูกปลดปล่อยโดยไม่มุ่งเป้า และ/หรือทำให้ผลิตภัณฑ์เป้าหมายเสียสภาพ
คำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์และการสลายเซลล์
- สามารถสลายเซลล์ด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ได้หรือไม่? ได้ การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์สลายเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ความถี่สูงที่เหนี่ยวนำให้เกิดคาวิเทชัน ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่ฟองไอขนาดเล็กก่อตัวและยุบตัวอย่างรุนแรงภายในสารแขวนลอยเซลล์ แรงเชิงกลที่เกิดขึ้นทำลายเยื่อหุ้มเซลล์และช่วยปลดปล่อยองค์ประกอบภายในเซลล์ออกสู่ของเหลว
- ใช้เครื่องอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์อย่างไร? การใช้เครื่องอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์ประกอบด้วยการจุ่มโพรบของเครื่องลงในสารแขวนลอยเซลล์และปรับพารามิเตอร์ เช่น แอมพลิจูดและระยะเวลาพัลส์ ควรติดตามกระบวนการอย่างใกล้ชิดเพื่อให้การทำลายเซลล์เหมาะสมที่สุด พร้อมลดการเสียสภาพของโปรตีนและการสูญเสียฤทธิ์ของเอนไซม์ให้น้อยที่สุด
- หลักการของการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์คืออะไร? การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ทำงานตามหลักการคาวิเทชันทางเสียง พลังงานอัลตราซาวนด์ถูกส่งเข้าสู่ตัวกลางของเหลว ทำให้ความดันผันผวนอย่างรวดเร็วจนเกิดฟองขนาดจิ๋วและการยุบตัวเข้าด้านใน การยุบตัวเหล่านี้ก่อให้เกิดแรงเฉือนรุนแรงและอุณหภูมิสูงเฉพาะจุด ทำลายโครงสร้างเซลล์และเพิ่มความเป็นเนื้อเดียวกันของไลเสต
- การสลายเซลล์ด้วยคลื่นอัลตราซาวนด์ใช้เวลานานเท่าใด? ระยะเวลาการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อสลายเซลล์อาจแตกต่างกันมาก ขึ้นอยู่กับปัจจัยต่าง ๆ เช่น ชนิดเซลล์ ความหนาแน่นของเซลล์ กำลังของเครื่องอัลตราซาวนด์ และโพรโทคอลเฉพาะที่ใช้ ขั้นตอนทั่วไปอาจใช้เวลาตั้งแต่หลายวินาทีถึงไม่กี่นาที โดยมักทำเป็นรอบเพื่อจัดการการเกิดความร้อนและให้เซลล์ถูกทำลายอย่างสม่ำเสมอ
- วัตถุประสงค์ของการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในการสกัดโปรตีนคืออะไร? ในการสกัดโปรตีน การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ทำหน้าที่ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตกและทำให้โปรตีนละลายได้อย่างมีประสิทธิภาพ วิธีนี้มีประโยชน์เป็นพิเศษในการปลดปล่อยโปรตีนจากส่วนต่าง ๆ ภายในเซลล์ จึงจำเป็นสำหรับการเตรียมไลเสตเพื่อนำโปรตีนไปทำให้บริสุทธิ์หรือวิเคราะห์
- เหตุใดจึงใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในการสกัด? การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เป็นวิธีที่นิยมสำหรับการสกัด เนื่องจากออกฤทธิ์รวดเร็วและสามารถใช้พลังงานแบบมุ่งเป้าเพื่อทำลายโครงสร้างเซลล์และปลดปล่อยโมเลกุลที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ โดยไม่ต้องใช้การบำบัดด้วยสารเคมีที่รุนแรง จึงรักษาความสมบูรณ์ด้านการทำงานของสารประกอบที่สกัดได้
- การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์รบกวนปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนหรือไม่? แม้ว่าการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์จะทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่ก็อาจรบกวนปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนด้วย ระดับการรบกวนขึ้นอยู่กับความเข้มและระยะเวลาที่ได้รับคลื่นอัลตราซาวนด์ โดยอาจทำให้โปรตีนเสียสภาพหรือคอมเพล็กซ์โปรตีนแยกตัว ซึ่งอาจส่งผลต่อการวิเคราะห์หรือการศึกษาการทำงานในขั้นตอนถัดไป
- สามารถใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เพื่อสลาย E. coli ได้หรือไม่? เครื่องอัลตราซาวนด์ของ Hielscher มีประสิทธิภาพเป็นพิเศษในการสลายเซลล์แบคทีเรีย เช่น E. coli ซึ่งมีผนังเซลล์ที่แข็งแรง เทคนิคนี้เป็นวิธีทางกายภาพในการเฉือนผนังเซลล์และเยื่อหุ้มเซลล์ จึงเป็นวิธีที่นิยมสำหรับการเตรียมไลเสตแบคทีเรียในห้องปฏิบัติการชีววิทยาระดับโมเลกุลและชีวเคมี
- กระบวนการหลังขั้นตอนการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์มีอะไรบ้าง?
ขั้นตอนถัดจากการสลายเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์โดยทั่วไปประกอบด้วยการแยกไลเสตออกเป็นส่วนต่าง ๆ การแยกออร์แกเนลล์แบบมุ่งเป้า และการสกัดหรือทำให้โปรตีนบริสุทธิ์เพิ่มเติม
จากนั้นจะแยกและเตรียมไลเสตที่ผ่านการประมวลผลแล้วสำหรับการวิเคราะห์หรือการศึกษาการทำงาน เช่น โปรตีโอมิกส์ความละเอียดสูง ทรานสคริปโตมิกส์ หรือการศึกษาการจับกับตัวรับ
เอกสารวิชาการ/เอกสารอ้างอิง
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.