Ultraljudsassisterad proteinextraktion från tumörvävnad – protokoll

Detta protokoll beskriver en metod för ultraljudsassisterad proteinextraktion från tumörvävnad som vidareutvecklar CPTAC:s standardarbetsflöde för ureabaserad lys genom att lägga till ett kontrollerat steg med sondultraljud under vävnadssönderdelningen. Modifieringen bygger på den etablerade CPTAC-strategin för provberedning inför djupgående proteom- och fosfoproteomanalys och förbättrar sönderdelningen av celler och subcellulära strukturer, minskar provets viskositet och förbättrar frisättningen av proteiner som vanligtvis är svårare att utvinna med enbart ureabaserad lys, särskilt membranbundna och DNA-bindande eller cellkärneassocierade proteiner. I den bakomliggande studien ökade det ultraljudsassisterade arbetsflödet detektionen av både proteiner och fosfopeptider, samtidigt som kompatibiliteten bibehölls med den efterföljande analyskedjan enligt CPTAC-modellen med digestion, TMT-märkning, fraktionering, fosfopeptidanrikning och LC-MS/MS-analys.

Ultraljudsassisterad proteinextraktion från tumörvävnad för djupgående proteomisk och fosfoproteomisk analys

Följande protokoll är optimerat för extraktion av proteiner från kryopulveriserad tumörvävnad i lysbuffert med 8 M urea: Ett tillagt steg med sondultraljud förbättrar utbytet av svårextraherade proteinklasser, särskilt membranassocierade och DNA-/cellkärneassocierade proteiner, före digestion och efterföljande LC-MS/MS-analys. I den bakomliggande studien av Li et al. (2025) ökade tillägget av ultraljudsbehandling detektionen av membran- och cellkärneassocierade proteiner och möjliggjorde en djupgående täckning av >12 000 proteiner och >25 000 fosfopeptider inom deras arbetsflöde.

Protokollets tillämpningsområde

Använd denna procedur för:

• färskfryst, kryopulveriserad tumörvävnad
• cellpelletar eller andra biologiska prover där ureabaserad extraktion redan är etablerad
• arbetsflöden för global proteomik och fosfoproteomik med trypsindigestion och valfri TMT-märkning

Studien av Li et al. (2025) anger att arbetsflödet även kan tillämpas på andra provtyper såsom cellinjer, blod och urin, men att optimering kan krävas beroende på provtyp.

Optimerat arbetsflöde för provberedning med infört ultraljudssteg. Det optimerade arbetsflödet och försöksupplägget bygger på CPTAC:s provberedningsprotokoll för global proteomisk och fosfoproteomisk analys.
Studie och schema: ©Li et al., 2025

Funktionsprincip

I den ursprungliga studien lades ultraljudsbehandling till i CPTAC:s standardarbetsflöde för ureabaserad lys, och förbättrad detektion av membran- och cellkärneassocierade proteiner konstaterades. Författarna anger att ultraljudsparametrarna måste finjusteras med avseende på provstorlek/koncentration – genom val av sonotrodstorlek, tillförd energi och pulstider.

För Hielscher UP200Ht och UP200St innebär detta exempelvis:

• använd amplitud och pulsläge som huvudsakliga styrvariabler
• håll proverna kalla hela tiden (dvs. på is)
• börja med försiktiga inställningar
• optimera med avseende på provets klarhet, temperatur, proteinutbyte och peptidkvalitet i efterföljande steg

 
Hielschers båda ultraljudsapparater på 200 watt, modellerna UP200Ht och UP200St, är konstruerade för små och medelstora provvolymer och har justerbara amplitud- och pulsinställningar; båda ultraljudshomogenisatorerna erbjuder digital pekskärmsstyrning för exakt parameterjustering, automatisk dataregistrering, anslutningsbar temperatursensor, fjärrstyrning och provbelysning.
 

Reagenser för ultraljudsassisterad proteinextraktion

Lysbuffert med urea

Bered färsk omedelbart före användning:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urea måste vara fullständigt upplöst innan tillsatserna tillsätts; hämmare bör tillsättas omedelbart före användning; bufferten bör hållas på is; och efter att tillsatserna har tillsatts rekommenderas försiktig cirkelrörelse snarare än kraftig vortexblandning.
 

Ytterligare reagenser:

• Reagenser för BCA-proteinbestämning
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodacetamid
• LysC
• Trypsin
• Myrsyra
• TMT-reagenser, om multiplex kvantitativ proteomik används
• IMAC-reagenser, om fosfopeptidanrikning utförs

Utrustning för ultraljudsassisterad proteinextraktion

Obligatorisk utrustning

Rekommenderat val av sond

För prover på omkring 200–1000 µL används en sonotrod med liten diameter som är lämplig för direkt högintensiv behandling av små volymer. Hielscher erbjuder flera sonotrodiametrar, och mindre spetsdiametrar ger högre intensitet vid spetsen.

Praktisk anmärkning: Använd den minsta sond som ger effektiv blandning utan överdriven skumbildning eller kontakt med kärlväggen.

Om du arbetar med flera prover samtidigt kan du överväga ultraljudsapparaten VialTweeter för flera provrör eller ultraljudsapparaten UIP400MTP för mikroplattor!

Stegvisa instruktioner: Förfarande för ultraljudsassisterad proteinextraktion

A. Förkyl och förbered

1. Kyl centrifugen till 4°C.
2. Bered färsk urealyseringsbuffert och håll den på is.
3. Montera UP200Ht eller UP200St på ett stativ i en ljudskyddskapsling.
4. Förbered ett isbad som är tillräckligt stort för att hålla provrören upprätt och stabilt.

Det är avgörande att bereda färsk buffert och hålla proverna kalla under hanteringen.

B. Inledande ureaextraktion

1. Håll den kryopulveriserade vävnaden på is.
2. Tillsätt 200 µL kyld urealyseringsbuffert per 50 mg våt vävnad.
3. Vortexblanda i 5–10 s vid hög hastighet.
4. Inkubera i 15 min vid 4°C.
5. Upprepa steget med vortexblandning följt av inkubation ytterligare en gång.
6. Centrifugera vid 20 000g i 10 min vid 4°C.
7. Överför lysatet/supernatanten till ett rent rör med låg proteinbindning.

C. Ultraljudsbehandling med UP200Ht eller UP200St

Startbetingelser för ultraljudsbehandling

• Amplitud: börja vid 20–30%
• Pulslängd: 5 s PÅ
• Kylning: 2 min på is mellan pulserna
• Antal cykler: 4 cykler
• Total aktiv ultraljudsbehandlingstid: 20 s
• Total processtid inklusive kylning: cirka 8–10 min

Steg för ultraljudsbehandling

1. Överför lysatet till ett rör som är lämpligt för ultraljudsbehandling. Använd ett smalt, tunnväggigt rör som möjliggör god värmeöverföring och säker nedsänkning av sonden.
2. Placera röret i ett isbad. I artikeln anges att kylning under ultraljudsbehandlingen är avgörande för att förhindra värmeskador.
3. Sänk ned sondspetsen i provet. Håll spetsen tillräckligt djupt nedsänkt för stabil kavitation, men låt den inte vidröra rörets vägg eller botten.
4. Kör en puls på 5 s vid startamplituden.
5. Placera omedelbart hela provet på is igen i 2 min.
6. Upprepa tills 4 cykler har slutförts.
7. Inspektera lysatet efter cykeln.
8. Fortsätt endast vid behov med ytterligare en puls på 5 s åt gången, alltid följd av fullständig kylning.
9. Avsluta när lysatet blir mer homogent och mindre trådigt/visköst.
   Slutpunkten är ett mer genomskinligt lysat som bildar droppar i stället för ett kontinuerligt visköst flöde.
10. Centrifugera vid cirka 16 000g i 15 min vid 4°C.
11. Överför den klarade supernatanten till ett nytt rör och mät proteinkoncentrationen.

Jämförelse av global proteomik och fosfoproteomik mellan ultraljudsbehandlade och icke ultraljudsbehandlade prover.
a. Antal identifierade proteiner (global proteomik) i alla PDX-tumörvävnader med eller utan ultraljudsbehandling. b. Antal identifierade fosfopeptider (IMAC-anrikning) i alla PDX-tumörvävnader med eller utan ultraljudsbehandling. Endast proteiner och fosfopeptider med en abundanskvot större än eller lika med den 25:e percentilen räknades. Abundanskvoten beräknades mellan prover av samma typ.
Studie och diagram: ©Li et al., 2025

Efterföljande digerering och analys

Efter ultraljudsbehandling och klarning fortsätter du enligt beskrivningen i det ursprungliga arbetsflödet av CPTAC-typ:

1. Späd lysatet 1:3 (v/v) med 50 mM Tris-HCl pH 8,0 för att sänka ureakoncentrationen till <2 M.
2. Tillsätt LysC i mängden 1 mAU per 50 µg protein och inkubera i 2 h vid 25°C.
3. Tillsätt trypsin i förhållandet 1:49 enzym:substrat (w/w) och digerera över natten vid 25°C.
4. Avbryt reaktionen med myrsyra till en slutkoncentration på 1%.
5. Fortsätt med avsaltning, TMT-märkning, fraktionering, anrikning av fosfopeptider och LC-MS/MS efter behov.

Differentiellt uttryck av fosfopeptider från TMT-märkt MS.
a. Den basala subtypen, med några humana fosfopeptider (proteinsekvensens början och slut) som är uppreglerade i ultraljudsbehandlade prover jämfört med prover som inte ultraljudsbehandlats. b. Den luminala subtypen, med några humana fosfopeptider (proteinsekvensens början och slut) som är uppreglerade i ultraljudsbehandlade prover jämfört med prover som inte ultraljudsbehandlats. c. Anrikade KEGG-signalvägar baserade på proteinerna för uppreglerade fosfopeptider i ultraljudsbehandlade tumörer av basal subtyp. d. Anrikade KEGG-signalvägar baserade på proteinerna för uppreglerade fosfopeptider i ultraljudsbehandlade tumörer av luminal subtyp.
Studie och diagram: ©Li et al., 2025

Design, tillverkning och rådgivning – kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielschers ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel användning möjliggör smidig integrering av våra ultraljudsapparater i industrianläggningar. Hielschers ultraljudsapparater klarar enkelt tuffa förhållanden och krävande miljöer.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och hög användarvänlighet. Självklart är Hielschers ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.

Litteratur / referenser

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.