Sonikeringsassisterad proteinextraktion från tumörvävnad – protokoll

Detta protokoll beskriver en ultraljudsassisterad proteinextraktionsmetod för tumörvävnad som förbättrar standardarbetsflödet för CPTAC-urealys genom att lägga till ett kontrollerat sonikeringssteg för sonden under vävnadsdisruption. Denna modifiering bygger på den etablerade djupskaliga CPTAC-strategin för proteom- och fosfoproteompreparering och förbättrar störningen av cell- och subcellulär struktur, minskar provets viskositet och förbättrar frisättningen av proteiner som vanligtvis är svårare att återvinna med enbart urea-lys, särskilt membranbundna och DNA-bindande eller kärnassocierade proteiner. I den underliggande studien ökade det ultraljudsassisterade arbetsflödet detekteringen av både proteiner och fosfopeptider samtidigt som kompatibiliteten med nedströms CPTAC-liknande nedbrytning, TMT-märkning, fraktionering, fosfopeptidberikning och LC-MS/MS-analys bevarades.

Sonikeringsassisterad proteinextraktion från tumörvävnad för djupgående proteomisk och fosfoproteomisk analys

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Tillämpningsområde för protokollet

Använd denna procedur för:

• färskfryst, kryopulveriserad tumörvävnad
• cellpellets eller andra biologiska prover där ureabaserad extraktion redan är etablerad
• globala arbetsflöden för proteomik och fosfoproteomik med tryptisk nedbrytning och TMT-märkning som tillval

I studien av Li et al (2025) anges att arbetsflödet även är tillämpligt på andra provtyper som cellinjer, blod och urin, men att optimering kan krävas beroende på provtyp.

Optimerat arbetsflöde för provberedning med implementerat ultraljudssteg. Det optimerade arbetsflödet och den experimentella designen baseras på CPTAC:s provberedningsprotokoll för global proteomisk och fosfoproteomisk analys.
Studie och schema: ©Li et al., 2025

Arbetssätt

I den ursprungliga studien lades ultraljudsbehandling till i standardarbetsflödet för CPTAC urea lysis och man fann förbättrad detektering av proteiner associerade med membran och kärnor. Författarna anger att sonikeringsparametrarna måste finjusteras med avseende på provstorlek/koncentration – genom att välja sonotrodens storlek, energitillförsel och pulstidpunkt.

Exempelvis, för Hielscher UP200Ht och UP200St, betyder detta:

• använda amplitud och pulsläge som de viktigaste styrvariablerna
• Håll proverna kalla under hela processen (t.ex. på is).
• börja med konservativa inställningar
• optimera mot provets klarhet, temperatur, proteinutbyte och peptidkvalitet nedströms

 
Både Hielscher 200 watt sonicatormodeller UP200Ht och UP200St är utformade för små och medelstora provvolymer, med justerbara amplitud- och pulsinställningar; båda ultraljudshomogenisatorerna har digital pekskärmskontroll för exakt parameterjustering, automatiserad datainspelning, pluggbar temperatursensor, fjärrkontroll, provbelysning.
 

Reagenser för sonikeringsassisterad proteinextraktion

Urea lysisbuffert

Förbered färskt omedelbart före användning:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfatasinhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Fosfatasinhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urea måste vara helt upplöst innan tillsatser tillsätts, inhibitorer ska tillsättas omedelbart före användning, bufferten ska förvaras på is och virvlande snarare än kraftig vortexning rekommenderas efter tillsats av tillsatser.
 

Ytterligare reagenser:

• Reagenser för BCA-proteinanalys
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• trypsin
• Myrsyra
• TMT-reagenser, om multiplex kvantitativ proteomik används
• IMAC-reagenser, om fosfopeptidanrikning utförs

Utrustning för sonikeringsassisterad proteinextraktion

Krävs

Rekommenderat val av sond

För prover runt 200-1000 µL, använd en sonotrode med liten diameter som är lämplig för direkt högintensiv bearbetning av små volymer. Hielscher erbjuder flera sonotrode-diametrar, och mindre spetsdiametrar ger högre intensitet vid spetsen.

Praktisk anmärkning: Använd den minsta sonden som ger effektiv blandning utan överdriven skumning eller kontakt med kärlväggen.

Om du arbetar med flera prover samtidigt kan du överväga Multi-Tube Sonicator VialTweeter eller Sonicator för mikroplattor UIP400MTP!

Steg-för-steg-instruktioner: Procedur för ultraljudsassisterad proteinextraktion

A. Förkylning och förberedelse

1. Kyl centrifugen till 4°C.
2. Förbered färsk urea lysisbuffert och förvara den på is.
3. Ställ upp UP200Ht eller UP200St på ett stativ inuti ett ljudhölje.
4. Förbered ett isbad som är tillräckligt stort för att hålla provrören upprätt och stabilt.

Förberedelse av färsk buffert och kylhantering är avgörande.

B. Inledande urea-extraktion

1. Förvara kryopulveriserad vävnad på is.
2. Tillsätt 200 µL kyld urea lysisbuffert per 50 mg våt vävnad.
3. Vortex 5-10 s i hög hastighet.
4. Inkubera 15 minuter vid 4°C.
5. Upprepa vortex- plus inkubationssteget en gång till.
6. Centrifugera vid 20 000 g i 10 min vid 4°C.
7. Överför lysat/supernatant till ett rent rör med låg bindning.

C. Sonikering med användning av UP200Ht eller UP200St

Startförhållanden för ultraljudsbehandling

• Amplitud: börja vid 20-30%.
• Pulslängd: 5 s ON
• Kylning: 2 min på is mellan pulserna
• Antal cykler: 4 cykler
• Total aktiv sonikeringstid: 20 s
• Total processtid inklusive kylning: ca 8-10 min

Steg för ultraljudsbehandling

1. Överför lysatet till ett rör som lämpar sig för ultraljudsbehandling. Använd ett smalt, tunnväggigt rör som tillåter bra värmeväxling och säker nedsänkning av proben.
2. Placera röret i ett isbad. I artikeln anges att kylning under ultraljudsbehandling är avgörande för att förhindra värmeskador.
3. Sänk ner probspetsen i provet. Håll spetsen tillräckligt nedsänkt för stabil kavitation, men låt den inte vidröra rörets vägg eller botten.
4. Kör en 5 s-puls med startamplituden.
5. Lägg omedelbart tillbaka hela provet på is i 2 minuter.
6. Upprepa tills 4 cykler har genomförts.
7. Inspektera lysatet efter cykeln.
8. Fortsätt endast om det behövs, med ytterligare en 5 s-puls i taget, alltid följt av fullständig kylning.
9. Stoppa när lysatet blir mer enhetligt och mindre trådigt/visköst.
   Slutpunkten är ett mer genomskinligt lysat som bildar droppar snarare än ett kontinuerligt visköst flöde.
10. Centrifugera vid ca 16.000 g i 15 min vid 4°C.
11. Överför den klarade supernatanten till ett nytt rör och mät proteinkoncentrationen.

Jämförelse av global proteomik och fosfoproteomik mellan sonikerade och icke-sonikerade prover.
a. Antal identifierade proteiner (global proteomik) i alla PDX-tumörvävnader med eller utan sonikering. b. Antal identifierade fosfopeptider (IMAC-anrikning) i alla PDX-tumörvävnader med eller utan sonikering. Endast proteiner och fosfopeptider med ett abundansförhållande som var större än eller lika med den 25:e percentilen räknades. Abundansförhållandet beräknades mellan samma typer av prover.
Studie och grafer: ©Li et al., 2025

Digestion och analys i efterföljande led

Efter sonikering och klarning, fortsätt enligt beskrivningen i det ursprungliga arbetsflödet i CPTAC-stil:

1. Späd lysatet 1:3 (v/v) med 50 mM Tris-HCl pH 8,0 för att reducera urea till <2 M.
2. Tillsätt LysC med 1 mAU per 50 µg protein och inkubera 2 timmar vid 25°C.
3. Tillsätt trypsin i förhållandet 1:49 enzym:substrat (w/w) och smälta över natten vid 25°C.
4. Kväv med myrsyra till 1% slutlig.
5. Fortsätt med avsaltning, TMT-märkning, fraktionering, fosfopeptidberikning och LC-MS/MS efter behov.

Differentiellt uttryck av fosfopeptider från TMT-märkt MS.
a. Den basala subtypen, med markering av vissa humana fosfopeptider (proteinsekvensens början och slut) som uppreglerats i sonikerade prover jämfört med icke sonikerade prover. b. Den luminala subtypen, med markering av vissa humana fosfopeptider (proteinsekvensens början och slut) som uppreglerats i sonikerade prover jämfört med icke sonikerade prover. c. Berikade KEGG-vägar baserade på proteinerna i uppreglerade fosfopeptider i sonikerade tumörer av basal subtyp. d. Berikade KEGG-vägar baserade på proteinerna i uppreglerade fosfopeptider i sonikerade tumörer av luminal subtyp.
Studie och grafer: ©Li et al., 2025

Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland

Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultraljudsapparater.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.

Litteratur / Referenser