Hielscher ultraljud teknik

Ultraljudsproteinuttagning från vävnad och cellkulturer

  • Proteinextraktion är ett viktigt prov preparering steg i proteomik.
  • Proteiner kan extraheras från växt-och djur vävnad, jäst och mikroorganismer.
  • Ultraljudsbehandling är en pålitlig, effektiv protein utvinning metod som ger hög protein avkastning inom en kort utvinning tid.

 

Protein utvinning från vävnader och celler

Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är ett viktigt prov berednings steg som utförs under många biokemiska och analytiska tekniker såsom ELISA, PAGE, Västlig blotting, masspektrometri eller protein rening. Ultraljud cell störningar, lys och extraktion är en exakt kontrollerbar teknik för att säkerställa hög avkastning av proteiner.

Protein utvinning från djur vävnad

För beredning av hel-storlek vävnad (t. ex. njure, hjärta, lunga, muskel etc.), bör vävnaden dissekeras i mycket små bitar med rena verktyg, på isen helst, och så snabbt som möjligt för att förhindra nedbrytning av proteaser (t. ex. lysis buffert såsom RIPA eller hypotonisk lysbuffert innehållande proteas och fosfatashämmare cocktail). Efter dissekera, är provet nedsänkt i flytande kväve för Snap Freeze. Provet kan förvaras vid-80 ° c för senare användning eller vara höll på is för omedelbar homogenisering. Omedelbart före ultraljud utvinning, is kallt lysis buffert (med proteashämmare DTT, leupeptin och aprotinin) tillsätts snabbt i provet röret (per ~ 10 mg vävnad ca. ~ 600 μL buffert rekommenderas). Ca. 20-60mg vävnad rekommenderas per provrör.
Ultraljud homogenisering, lys och extraktion utförs med ett ultraljud Homogenisatorer såsom Uf200 ः t eller UP200St, utrustad med en mikro-tip sonotrode. Ultraljudsbehandling varaktighet är 60-90 SEK. vid ett ultraljud cykel läge av 15 sek. ultraljudsbehandling och 10 SEK. vilo tid. Provet ska förvaras i is hela tiden.
Efter ultraljud homogenisering/utvinning, är lysat centrifugeras på 27, 000g för ca. 20 min. efteråt supernatenten samlas in, så att protein koncentrationen kan bestämmas genom ett protein assay såsom Pierce protein assay BCA.

Protein ultraljudsbehandling är en viktig metod för provberedning

Ultraljud protein utvinning från celler med UP200St

Informationsförfrågan




Notera vår Integritetspolicy.


Protein utvinning från blod serum

För en homogen blandning av serum och fosfatbuffert, är provet vortexed först innan ultraljud cell Lys. För ultraljud lysis, provet är sonicated med en ultraljud Lab Homogenisatorer såsom UP100H för 8 cykler med 20% amplitud, för cykler av varje 5 sekunder på och 15 sekunder av. Sonocation utförs av sonicationg i cykler och genom att placera provet på isen så att en överhettning och termisk nedbrytning av provet undviks. Eftersom serum innehåller en stor mängd proteiner med hög molekyl vikt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunglobulin G och immunglobulin A), vilket stör separationen av proteiner med låg molekyl vikt under IEF, är det rekommenderas att tömma ut dem från serumet med en utarmning kolumn.

Protein utvinning från växt vävnad

Färsk, mjuk växtvävnad, e.g. Moss etc., kan lätt störas genom att helt enkelt placera den hackade provmaterialet i lysis buffert för ultraljudsbehandling. Tuffa, ligenösa växt vävnader, såsom frön, barr etc., bör malas torrt. Vissa hårda, vedartade växtmaterial måste frysas och mals i flytande kväve innan extraheras av ultraljudsbehandling. För växternas cellkultur suspensioner, en Ultraljuds behandling mellan 30 och 150 sekunder i en lysis buffert är mestadels tillräckligt. Hårdare material såsom pumpafrön kräver en mer intensiv ultraljudsbehandling som beskrivs nedan.

Protokoll för ultraljud utvinning av albumin från pumpafrön

Ultraljud vävnad Homogenisatorer UP400St med S24d40-för protein utvinning från växt-och djur vävnad (Klicka för att förstora!)För ultraljud protein utvinning av albumin från finmalet pumpafrön pulver, 10 g avfettat pumpa frö pulver och 100 ml avjoniserat vatten som lösnings medel tillsätts i en 250ml glas bägare. Proteinet extraktion består i två steg: för det första är provet sonicated med en sond-typ ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) med monterad sonotrode S24d7. Glas bägaren är placerad i ett kallt vatten bad under ultraljud homogenisering. Inställningen av ultrasonicator UP400St med den plugable temperatur sensorn säkerställde att prov temperaturen alltid hålls under 30 ° c. Av den exakta temperatur kontroll under ultraljudsbehandling, en denaturering av albumin undviks. För det andra utfördes extraktion med en mixer vid 200 rpm hastighet och vid 30 ° c. Därefter överförs bägaren till en termostatskakapparat. Globulin avlägsnas via dialys med destillerat vatten. Efter avlägsnande av globulin kan protein extraktet provtas för bestämning av albuminprofilen och därefter justeras till pI = 3,0 med 0,1 M HCl för albuminkoagulering. Den fasta fasen separeras genom centrifugering vid 5000g, 20 ° c och löses i avjoniserat vatten. Albuminkoagulering utförs två gånger för att öka protein kvoten i albuminkoncentratet.

Ultraljud alkaliska protein utvinning för beredning av proteinkoncentrat från riskli visar att Ultraljuds behandling resulterar i högre protein avkastning i en betydligt kortare utvinning tid – jämfört med konventionella extraktionsmetoder.

Ultraljud enhet VialTweeter för protein utvinning från vävnadsprover (Klicka för att förstora!)

VialTweeter för indirekta ultraljudsbehandling.

Fördelar

  • Snabb
  • hög avkastning
  • mycket effektiv
  • Exakt kontroll över parametrar
  • Reproducerbara resultat
  • Linjär skalbarhet

Prov berednings protokoll för funktionella iNOS-enzym

För att få fullt fungerande iNOS enzym (t. ex. för läkemedels screening) rekommenderas följande protokoll: cell SUS pensionen ska placeras på is och sonikera med en UP100H vid 10μm amplitud i cykel läge av 5 sek. ultraljudsbehandling och 25 SEC. vila på isen. Proceduren bör upprepas ca 3 gånger. Vilo tiden i mellan ultraljudsbehandling cykler minskar temperaturhöjningen och kommer därför att minska risken för denaturering.

Ultraljud Proteinlösbilisering

Ultraljudsbehandling kan påskynda proteinet inlösning process, som vanligt vis kräver flera timmar. För att inte överhetta provet och förhindra protein nedbrytning och modifieringar i lösningar som innehåller urea, ultraljud skurar bör inte pågå längre än några sekunder.

Allmänna instruktioner

Temperatur kontroll: För att säkerställa en hög protein avkastning utan termisk denaturering måste temperaturen under extraktionen kontrol leras. Hielschers State-of-Art ultraljud Homogenisatorer – även kallad ultraljud sönderfall eller sonificator – är exakt kontrollerbara. De kommer med en plugable temperatur sensor. I inställnings alternativen för ultraljud Homogenisatorer, en maximal temperatur kan ställas in. När denna temperatur Max nås, ultrasonicator stannar automatiskt tills provet har svalnat.
Buffert: Val av lämplig buffert och rätt buffertmängd varierar från vävnad till vävnad och måste fastställas genom test och fel testning.
Isolering/rening: Proteinlysat kan innehålla ett överskott av biomoleculer såsom DNA eller kolhydrater, som kan avlägsnas genom protein fällning (deoxicholat-triklorättiksyra) eller buffertutbyte.

Chittapalo och Noomhorm (2009) rapporterade att protein avkastningen ökade med ultraljudsbehandling och att ultraljud vävnad homogenisering och Lys processen kan förbättra befintliga utvinning processer avsevärt – möjliggör nya kommersiella utvinnings möjligheter.

Ljud skydd med Hielschers ljud hölje SPB-L och ultraljud enhet UP200St. (Klicka för att förstora!)

Ultraljud vävnad Homogenisatorer UP200St för effektiv protein utvinning

Exakt kontroll av Ultraljuds behandling (Klicka för att förstora!)

Browser kontroll för exakt drift och övervakning av ultraljudsbehandling processen

Ultraljud utrustning för protein utvinning

Hielscher Ultrasonics erbjuder ett brett spektrum av ultraljud Homogenisatorer för sönderfall av celler, vävnader, bakterier, mikroorganismer, jäst, och sporer.
Hielscher Lab ultrasonicators är kraftfulla och lätta att använda. Byggd för 24/7 drift, de är konstruerade som robusta och effektiva Lab och bänk enheter. För alla enheter kan energi produktionen och amplituden kontrol leras exakt. Det breda utbudet av Tillbehör öppnar ytterligare inställnings alternativ. Digitala enheter som VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, och UP400St har en integrerad temperatur kontroll och ett inbyggt SD-kort för automatisk data registrering.
För den indirekta, korskontaminering-fria och samtidiga ultraljudsbehandling av flera prover, erbjuder vi VialTweeter eller Ultraljud CupHorn.
Beroende på ditt program, material och prov volym, kommer vi att rekommendera dig den lämpligaste inställningen för ditt prov prep. Kontakta oss idag!

Kontakta oss! / Fråga oss!

Använd formuläret nedan om du vill begära ytterligare information om ultraljud homogenisering. Vi ska vara glada att kunna erbjuda dig ett ultraljud system som uppfyller dina krav.









Observera att våra Integritetspolicy.


Litteratur / Referenser

  • Chittapalo T, noomhorm a (2009): ultraljud assisterad alkali utvinning av protein från avfettad riskli och egenskaper hos proteinkoncentrat. Int J Food Sci Technol 44:1843 – 1849.
  • Simões, André E. S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D' Hooge, Rudi; Styra, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): effektiv återhämtning av proteiner från flera källprover efter TRIzol eller TRIzol LS RNA-extraktion och långtidslagring. BMC Genomics 2013, 14:181.


Fakta Värt att veta

Proteomik

Proteomik är forsknings fältet som undersöker proteiner och proteomen. Proteiner fullfil ett brett spektrum av vitala funktioner inom organismer. Proteomet är hela uppsättningen av proteiner som uttrycks genom en arvs massa, cell, vävnad eller organism vid en viss tidpunkt. Proteomet varierar med tid och distinkta krav, eller betonar, att en cell eller organism genomgår. Mer specifikt är det uppsättningen av uttryckta proteiner i en given typ av cell eller organism, vid en given tidpunkt, under definierade förhållanden. Termen är en blandning av proteiner och arvs massa. Proteomik är studiet av proteomen.

Protein

Proteiner är stora biomoleculer, s.k. makro molekyler – som består av en eller flera långa kedjor av aminosyrerester. Proteiner är närvarande i alla organismer av både vegetabiliskt och animaliskt ursprung och de är avgörande för de flesta av de biologiska funktionerna. Eftersom proteiner innehåller mycket biologisk information extraheras de för analytiska ändamål, t ex för proteomisk forskning. Den viktigaste funktionen som utförs av proteiner inkluderar katalys av metaboliska reaktioner, DNA-replikation, respons på stimuli, och transport av molekyler från en plats till en annan. Proteiner skiljer sig från varandra främst i deras sekvens av aminosyror, som styrs av nukleotid sekvens av deras gener, och som vanligt vis resulterar i protein vikning till en specifik tredimensionell struktur som bestämmer dess aktivitet. Proteiner är – Förutom peptider – en av de viktigaste komponenterna i livsmedel. Därför är proteomik ett kraftfullt verktyg i livsmedels vetenskap för att optimera processer, livsmedels säkerhet och näringsmässiga bedömning.

Gel elektrofores

Gelelektrofores är den viktigaste metoden för separation och analys av makro molekyler som DNA, RNA och proteiner samt deras fragment, baserat på deras storlek och laddning. Det används i klinisk kemi för att separera proteiner genom laddning och/eller storlek (IEF agarose, väsentligen storlek oberoende) och i biokemi, molekylärbiologi och proteomik att separera en blandad population av DNA och RNA fragment av längd, för att uppskatta storleken på DNA-och RNA-fragment eller separera proteiner genom laddning.

Cellkulturer

Cell odling är den kontrollerade odlings processen genom vilken celler odlas under kontrollerade betingelser. Cell odlings förhållandena varierar för varje cell typ. I allmänhet består miljön av en cell kultur av ett lämpligt kärl (t. ex. petriskål) med substrat eller medium som förser de essentiella näringsämnena (aminosyror, kolhydrater, vitaminer, mineraler), tillväxtfaktorer, hormoner och gaser (CO2O2) och reglerar den fysikalisk-kemiska miljön (pH-buffert, osmotiskt tryck, temperatur). De flesta celler behöver en yta eller konstgjorda substrat, medan andra cell kulturer kan odlas fritt flytande i odlings substrat (SUS pension kultur, cell SUS pension).
Mass kulturer av animaliska cellinjer används i industriell produktion av virus vacciner och andra bioteknologiskt framställda produkter. Mänskliga stamceller odlas för att utöka antalet celler och differentiera cellerna till olika somatiska cell typer för transplantations ändamål.

Vävnadsprover

Termen vävnad beskriver en cellulär intermediär, där cell materialet är på en organisatorisk nivå mellan celler och ett komplett organ. I vävnad är liknande celler, från samma ursprung som tillsammans utför en specifik funktion, monterade. Genom funktionell gruppering av flera vävnader bildas de komplexa strukturerna av organ.
Vävnad samplas för forskning inom biologi, histologi/histopatologi, parasitologi, biokemi, immunohistokemi samt för att odla och extrahera DNA. Det kan särskiljas mellan djur (indelning: däggdjurs vävnad) och växtvävnad. Djurvävnader är grupperade i fyra grundläggande typer av bindväv, muskel, nervös, och epitelial vävnad. Växtvävnad är indelad i följande tre vävnads system: epidermis, marken vävnad, och kärl vävnaden.
Vävnads prov kan framställas från djur-eller växt delar, t. ex. ben, muskler, löv etc.

Kroppsvätskor

Blod, serum, plasma, cerebrospinalvätska, saliv och synovialvätska är kropps vätskor, som erbjuder en stor källa till diagnotiskt relevant information. Därför är en sofistikerad beredning av kroppen vätske prov för analys viktigt. Den första svårigheten är förknippad med det breda dynamiska omfånget av komponenter som finns i kropps vätskor.

Bestämning av protein koncentration

Bradford assay, Lowry analys och bicinchoninic syra (BCA) assay är vanliga analyser för att bestämma koncentrationen av proteiner. Bovint serumalbumin (BSA) är en av de vanligast använda protein standard.

Lyseringsbuffert

Lyseringsbuffert måste väljas i enlighet med cell material eller vävnad (vävnads odling, växt, bakterier, svampar, etc.), och om cellerna är i en struktur och typ av struktur. Ett brett spektrum av lyseringsbuffertar för extraktion av proteiner, membran och organeller är formulerade med ett eller flera rengörings medel. Rengörings medlet väljs vanligt vis via test-och fel test eller – om tillgängligt – enligt ett befintligt protein utvinnings protokoll. Rengörings medlet måste vara kompatibelt med vävnads källan och proteinerna. I allmänhet är det mildaste tvätt medel som fungerar för en specifik vävnad/protein, väljs för att bibehålla maximal funktionalitet av extraktet. Dessutom, i händelse av en extraktion av membran och organeller, ett milt rengörings medel håller membranet intakt. Vanligen använda rengörings medel i lyseringsbuffertar är mesta dels nonionisk eller zwitterionic, t ex CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, och Tween 20.
Till exempel, vävnader såsom hjärna, lever, tarm, njure, mjälte etc. kan helt enkelt bubbas med RIPA – proteashämmare och DTT (t. ex. för gelelektrofores) bör inkluderas.
Lyseringsbuffert för Skelett muskel vävnad (iskaffe): 20 mM tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (vikt/volym) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mm ditiothreitol kompletterat med proteas-och fosfatashämmare cocktail
Tabell över gemensamma buffertar och deras pH-omfång. I allmänhet används dessa buffertar normalt vid koncentrationer på 20-50 mM.

Buffert pH-omfång
Citronsyra – Naoh 2,2 – 6,5
Natriumcitrat – Citronsyra 3,0 – 6,2
Natriumacetat – Ättiksyra 3,6 – 5,6
Natrium salt av cacodylic Acid – Hcl 5,0 – 7,4
Mes – Naoh 5,6 – 6,8
Natriumdivätefosfat – dinatriumvätefosfat 5,8 – 8,0
Imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
Moppar – Koh 6,6 – 7,8
Trietanolaminhydroklorid – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
Tricine – Naoh 7,6 – 8,6
Natriumtetraborat – Borsyra 7,6 – 9,2
Bicine – Naoh 7,7 – 8,9
Glycin – Naoh 8,6 – 10,6

De flesta buffertar visar ett pH-beroende med temperatur. Detta gäller särskilt för tris buffertar. PKa ändras från 8,06 vid 25 ° c till 8,85 vid 0 ° c.
(pH och pKa i en buffert: pH mäter koncentrationen av vätejoner i en vatten lösning. pKa (= Acid dissociationskonstant) är en relaterad, men mer specifik åtgärd, eftersom den hjälper till att förutsäga hur en molekyl kommer att agera vid ett specifikt pH-värde.)

Mer från TRIzol

TRIzol är en kemisk lösning som används för att extrahera RNA/DNA/protein under utvinning av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform. Användningen av ultraljud assisterad TRIzol utvinning resulterar i hög DNA, RNA, och protein avkastningen från samma prov och utmärker därmed andra extraktionsmetoder.