Ultraljudsproteinuttagning från vävnad och cellkulturer

• Proteinextraktion är ett viktigt prov preparering steg i proteomik.
• Proteiner kan extraheras från växt-och djur vävnad, jäst och mikroorganismer.
• Ultraljudsbehandling är en pålitlig, effektiv protein utvinning metod som ger hög protein avkastning inom en kort utvinning tid.

Protein utvinning från vävnader och celler

Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är ett viktigt prov berednings steg som utförs under många biokemiska och analytiska tekniker såsom ELISA, PAGE, Västlig blotting, masspektrometri eller protein rening. Ultraljud cell störningar, lys och extraktion är en exakt kontrollerbar teknik för att säkerställa hög avkastning av proteiner.

Protein utvinning från djur vävnad

För beredning av hel-storlek vävnad (t. ex. njure, hjärta, lunga, muskel etc.), bör vävnaden dissekeras i mycket små bitar med rena verktyg, på isen helst, och så snabbt som möjligt för att förhindra nedbrytning av proteaser (t. ex. lysis buffert såsom RIPA eller hypotonisk lysbuffert innehållande proteas och fosfatashämmare cocktail). Efter dissekera, är provet nedsänkt i flytande kväve för Snap Freeze. Provet kan förvaras vid-80 ° c för senare användning eller vara höll på is för omedelbar homogenisering. Omedelbart före ultraljud utvinning, is kallt lysis buffert (med proteashämmare DTT, leupeptin och aprotinin) tillsätts snabbt i provet röret (per ~ 10 mg vävnad ca. ~ 600 μL buffert rekommenderas). Ca. 20-60mg vävnad rekommenderas per provrör.
Ultraljud homogenisering, lys och extraktion utförs med ett ultraljud Homogenisatorer såsom Uf200 ः t eller UP200St, utrustad med en mikro-tip sonotrode. Ultraljudsbehandling varaktighet är 60-90 SEK. vid ett ultraljud cykel läge av 15 sek. ultraljudsbehandling och 10 SEK. vilo tid. Provet ska förvaras i is hela tiden.
Efter ultraljud homogenisering/utvinning, är lysat centrifugeras på 27, 000g för ca. 20 min. efteråt supernatenten samlas in, så att protein koncentrationen kan bestämmas genom ett protein assay såsom Pierce protein assay BCA.

Protein utvinning från blod serum

För en homogen blandning av serum och fosfatbuffert, är provet vortexed först innan ultraljud cell Lys. För ultraljud lysis, provet är sonicated med en ultraljud Lab Homogenisatorer såsom UP100H för 8 cykler med 20% amplitud, för cykler av varje 5 sekunder på och 15 sekunder av. Sonocation utförs av sonicationg i cykler och genom att placera provet på isen så att en överhettning och termisk nedbrytning av provet undviks. Eftersom serum innehåller en stor mängd proteiner med hög molekyl vikt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunglobulin G och immunglobulin A), vilket stör separationen av proteiner med låg molekyl vikt under IEF, är det rekommenderas att tömma ut dem från serumet med en utarmning kolumn.

Protein utvinning från växt vävnad

Färsk, mjuk växtvävnad, e.g. Moss etc., kan lätt störas genom att helt enkelt placera den hackade provmaterialet i lysis buffert för ultraljudsbehandling. Tuffa, ligenösa växt vävnader, såsom frön, barr etc., bör malas torrt. Vissa hårda, vedartade växtmaterial måste frysas och mals i flytande kväve innan extraheras av ultraljudsbehandling. För växternas cellkultur suspensioner, en Ultraljuds behandling mellan 30 och 150 sekunder i en lysis buffert är mestadels tillräckligt. Hårdare material såsom pumpafrön kräver en mer intensiv ultraljudsbehandling som beskrivs nedan.

Protokoll för ultraljud utvinning av albumin från pumpafrön

För ultraljud protein utvinning av albumin från finmalet pumpafrön pulver, 10 g avfettat pumpa frö pulver och 100 ml avjoniserat vatten som lösnings medel tillsätts i en 250ml glas bägare. Proteinet extraktion består i två steg: för det första är provet sonicated med en sond-typ ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) med monterad sonotrode S24d7. Glas bägaren är placerad i ett kallt vatten bad under ultraljud homogenisering. Inställningen av ultrasonicator UP400St med den plugable temperatur sensorn säkerställde att prov temperaturen alltid hålls under 30 ° c. Av den exakta temperatur kontroll under ultraljudsbehandling, en denaturering av albumin undviks. För det andra utfördes extraktion med en mixer vid 200 rpm hastighet och vid 30 ° c. Därefter överförs bägaren till en termostatskakapparat. Globulin avlägsnas via dialys med destillerat vatten. Efter avlägsnande av globulin kan protein extraktet provtas för bestämning av albuminprofilen och därefter justeras till pI = 3,0 med 0,1 M HCl för albuminkoagulering. Den fasta fasen separeras genom centrifugering vid 5000g, 20 ° c och löses i avjoniserat vatten. Albuminkoagulering utförs två gånger för att öka protein kvoten i albuminkoncentratet.

Ultraljud alkaliska protein utvinning för beredning av proteinkoncentrat från riskli visar att Ultraljuds behandling resulterar i högre protein avkastning i en betydligt kortare utvinning tid – jämfört med konventionella extraktionsmetoder.

Prov berednings protokoll för funktionella iNOS-enzym

För att få fullt fungerande iNOS enzym (t. ex. för läkemedels screening) rekommenderas följande protokoll: cell SUS pensionen ska placeras på is och sonikera med en UP100H vid 10μm amplitud i cykel läge av 5 sek. ultraljudsbehandling och 25 SEC. vila på isen. Proceduren bör upprepas ca 3 gånger. Vilo tiden i mellan ultraljudsbehandling cykler minskar temperaturhöjningen och kommer därför att minska risken för denaturering.

Ultraljud Proteinlösbilisering

Ultraljudsbehandling kan påskynda proteinet inlösning process, som vanligt vis kräver flera timmar. För att inte överhetta provet och förhindra protein nedbrytning och modifieringar i lösningar som innehåller urea, ultraljud skurar bör inte pågå längre än några sekunder.

Allmänna instruktioner

Temperatur kontroll: För att säkerställa en hög protein avkastning utan termisk denaturering måste temperaturen under extraktionen kontrol leras. Hielschers State-of-Art ultraljud Homogenisatorer – även kallad ultraljud sönderfall eller sonificator – är exakt kontrollerbara. De kommer med en plugable temperatur sensor. I inställnings alternativen för ultraljud Homogenisatorer, en maximal temperatur kan ställas in. När denna temperatur Max nås, ultrasonicator stannar automatiskt tills provet har svalnat.
Buffert: Val av lämplig buffert och rätt buffertmängd varierar från vävnad till vävnad och måste fastställas genom test och fel testning.
Isolering/rening: Proteinlysat kan innehålla ett överskott av biomoleculer såsom DNA eller kolhydrater, som kan avlägsnas genom protein fällning (deoxicholat-triklorättiksyra) eller buffertutbyte.

Chittapalo och Noomhorm (2009) rapporterade att protein avkastningen ökade med ultraljudsbehandling och att ultraljud vävnad homogenisering och Lys processen kan förbättra befintliga utvinning processer avsevärt – möjliggör nya kommersiella utvinnings möjligheter.

Ultraljud utrustning för protein utvinning

Hielscher Ultrasonics erbjuder ett brett spektrum av ultraljud Homogenisatorer för sönderfall av celler, vävnader, bakterier, mikroorganismer, jäst, och sporer.
Hielscher Lab ultrasonicators är kraftfulla och lätta att använda. Byggd för 24/7 drift, de är konstruerade som robusta och effektiva Lab och bänk enheter. För alla enheter kan energi produktionen och amplituden kontrol leras exakt. Det breda utbudet av Tillbehör öppnar ytterligare inställnings alternativ. Digitala enheter som VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, och UP400St har en integrerad temperatur kontroll och ett inbyggt SD-kort för automatisk data registrering.
För den indirekta, korskontaminering-fria och samtidiga ultraljudsbehandling av flera prover, erbjuder vi VialTweeter eller Ultraljud CupHorn.
Beroende på ditt program, material och prov volym, kommer vi att rekommendera dig den lämpligaste inställningen för ditt prov prep. Kontakta oss idag!