Proteinextraktion med ultraljud från vävnad och cellkulturer

• Proteinextraktion är ett avgörande provberedningssteg inom proteomik.
• Proteiner kan extraheras från växt- och djurvävnad, jästsvampar och mikroorganismer.
• Ultraljudsbehandling är en tillförlitlig, effektiv metod för proteinextraktion som ger höga proteinutbyten på kort extraktionstid.

Proteinextraktion från vävnader och celler

Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är ett avgörande provberedningssteg som utförs vid många biokemiska och analytiska tekniker såsom ELISA, PAGE, Western blotting, masspektrometri eller proteinrening. Cellsönderdelning, lys och extraktion med ultraljud är en exakt styrbar, icke-termisk teknik för att säkerställa höga proteinutbyten.

Allmänna anvisningar för lys och proteinextraktion med ultraljud

• Temperaturkontroll: För att säkerställa ett högt proteinutbyte utan termisk denaturering måste temperaturen under extraktionen kontrolleras. Hielschers toppmoderna ultraljudshomogenisatorer – även kallade ultraljudsdisintegratorer eller ultraljudsapparater – kan styras exakt. De levereras med en anslutningsbar temperatursensor. En maxtemperatur kan ställas in i ultraljudshomogenisatorns inställningar. När denna maxtemperatur uppnås stannar ultraljudsapparaten automatiskt tills provet har svalnat.
• Buffert: Valet av en lämplig buffert och rätt buffertvolym varierar mellan olika vävnader och måste fastställas genom att prova sig fram.
• Isolering / rening: Proteinlysat kan innehålla ett överskott av biomolekyler såsom DNA eller kolhydrater, vilka kan avlägsnas genom proteinfällning (deoxikolat–triklorättiksyra) eller buffertbyte.

Chittapalo och Noomhorm (2009) rapporterade i sin studie att proteinutbytet ökade vid användning av ultraljudsbehandling och att processen för vävnadshomogenisering och lys med ultraljud kan förbättra befintliga extraktionsprocesser avsevärt – vilket möjliggör nya kommersiella extraktionsmöjligheter.
 

Proteinextraktion från djurvävnad

För beredning av hela vävnadsstycken (t.ex. njure, hjärta, lunga, muskel osv.) bör vävnaden dissekeras i mycket små bitar med rena verktyg, helst på is, och så snabbt som möjligt för att förhindra nedbrytning av proteaser (t.ex. lysbuffert såsom RIPA eller hypoton lysbuffert som innehåller en blandning av proteas- och fosfatashämmare). Efter dissekeringen sänks provet ned i flytande kväve för snabbfrysning. Provet kan förvaras vid -80°C för senare användning eller hållas på is för omedelbar homogenisering. Omedelbart före ultraljudsextraktionen tillsätts iskall lysbuffert (med proteashämmarna DTT, leupeptin och aprotinin) snabbt till provröret (per ~10 mg vävnad rekommenderas ca ~600 μL buffert). Ca 20–60mg vävnad rekommenderas per provrör.
Homogenisering, lys och extraktion med ultraljud utförs med en ultraljudshomogenisator såsom UP100H eller UP200Ht, utrustad med en sonotrod med mikrospets. Ultraljudsbehandlingens varaktighet är 60–90 sek. i ett cykelläge med 15 sek. ultraljudsbehandling och 10 sek. vilotid. Provet bör hållas i is hela tiden.
Efter homogeniseringen / extraktionen med ultraljud centrifugeras lysatet vid 27 000g i ca 20 min. Därefter samlas supernatanten upp så att proteinkoncentrationen kan bestämmas med en proteinanalys såsom Pierce BCA-proteinanalys.

Proteinextraktion från blodserum

För att få en homogen blandning av serumet och fosfatbufferten vortexblandas provet först före celllys med ultraljud. Vid ultraljudslysen behandlas provet med en ultraljudshomogenisator för laboratoriebruk, såsom UP100H, under 8 cykler vid 20% amplitud, med 5 sekunders behandling och 15 sekunders paus i varje cykel. Proteinextraktionen utförs genom ultraljudsbehandling i cykler (pulserande läge) och genom att provet placeras på is så att överhettning och termisk nedbrytning av provet undviks. Eftersom serum innehåller en stor mängd proteiner med hög molekylvikt (såsom albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunglobulin G och immunglobulin A), vilka stör separationen av proteiner med låg molekylvikt under IEF, rekommenderas att dessa avlägsnas från serumet med hjälp av en depletionskolonn.

Proteinextraktion från växtvävnad

Färsk, mjuk växtvävnad, t.ex. mossa, kan enkelt sönderdelas genom att det hackade provmaterialet placeras i lysbuffert för ultraljudsbehandling. Seg, förvedad växtvävnad, såsom frön, granbarr etc., bör malas torr. Vissa hårda, vedartade växtmaterial måste frysas och malas i flytande kväve före extraktion med ultraljud. För suspensioner av växtcellskulturer räcker det oftast med ultraljudsbehandling i lysbuffert under 30 till 150 sekunder. Segare material såsom pumpafrön kräver intensivare ultraljudsbehandling enligt beskrivningen nedan.
 

Protokoll för extraktion av albumin från pumpafrön med ultraljud

För ultraljudsextraktion av proteinet albumin från finmalet pumpafröpulver tillsätts 10 g avfettat pumpafröpulver och 100 mL avjoniserat vatten som lösningsmedel i en glasbägare på 250mL. Proteinextraktionen består av två steg: Först ultraljudsbehandlas provet med en ultraljudsapparat av sondtyp, UP400St (400W, 24kHz), utrustad med sonotroden S24d7. Glasbägaren placeras i ett kallt vattenbad under ultraljudshomogeniseringen. Den anslutningsbara temperatursensorn och inställningarna för temperaturreglering på ultraljudsapparaten UP400St säkerställer att provtemperaturen alltid hålls under 30°C. Genom den exakta temperaturregleringen under ultraljudsbehandlingen undviks denaturering av albumin. I det andra steget utfördes extraktionen med en mixer vid ett varvtal på 200 rpm och vid 30°C. Därefter överförs bägaren till en termostatstyrd skakapparat. Globulin avlägsnas genom dialys med destillerat vatten. Efter att globulinet avlägsnats kan prov tas från proteinextraktet för bestämning av albuminprofilen, och därefter justeras extraktet till pI=3,0 med 0,1 M HCl för koagulering av albumin. Den fasta fasen separeras genom centrifugering vid 5000g, 20°C och löses åter i avjoniserat vatten. Albuminkoaguleringen utförs två gånger för att öka proteinandelen i albuminkoncentratet.

Alkalisk proteinextraktion med ultraljud för framställning av proteinkoncentrat från riskli visar att ultraljudsbehandlingen ger ett högre proteinutbyte på betydligt kortare extraktionstid – jämfört med konventionella extraktionsmetoder.

Provberedningsprotokoll för funktionellt iNOS-enzym

För att erhålla fullt funktionellt iNOS-enzym (t.ex. för läkemedelsscreening) rekommenderas följande protokoll: Cellsuspensionen bör placeras på is och ultraljudsbehandlas med en UP100H vid 10µm amplitud i cykler med 5 sekunders ultraljudsbehandling och 25 sekunders vila på is. Proceduren bör upprepas cirka 3 gånger. Vilotiden mellan ultraljudsbehandlingscyklerna minskar temperaturökningen och minskar därför risken för denaturering.

Solubilisering av proteiner med ultraljud

Ultraljudsbehandling kan påskynda solubiliseringen av proteiner, som vanligtvis kräver flera timmar. För att undvika överhettning av provet och förhindra proteinnedbrytning och modifieringar i lösningar som innehåller urea bör ultraljudspulserna inte vara längre än några få sekunder.

Ultraljudsutrustning för proteinextraktion

Hielscher Ultrasonics erbjuder ett brett sortiment av ultraljudshomogenisatorer för sönderdelning av celler, vävnader, bakterier, mikroorganismer, jäst och sporer.
Hielschers ultraljudsapparater för laboratorier är kraftfulla och enkla att använda. De är byggda för drift dygnet runt, alla dagar i veckan, och utformade som robusta och effektiva laboratorie- och bänkapparater. För alla apparater kan den avgivna energin och amplituden styras exakt. Det breda tillbehörssortimentet ger ytterligare konfigurationsmöjligheter. De digitala ultraljudsapparaterna, såsom VialTweeter, UP200Ht, UP200St och UP400St, har integrerad temperaturreglering och ett inbyggt SD-kort för automatisk dataregistrering.
För indirekt och samtidig ultraljudsbehandling av flera prover utan korskontaminering erbjuder vi VialTweeter eller ultraljudsenheten CupHorn.
Tabellen nedan ger dig en översikt över våra ultraljudsapparater för provberedning, cellsönderdelning och extraktion. Klicka på apparattypen för att få mer information om varje ultraljudshomogenisator. Vår välutbildade tekniska personal med mångårig erfarenhet hjälper dig gärna att välja den lämpligaste ultraljudsapparaten för din provberedning!
 

Beroende på din tillämpning, ditt material och din provvolym rekommenderar vi den lämpligaste konfigurationen för din provberedning. Kontakta oss idag!