Ultraljudsproteinuttagning från vävnad och cellkulturer
- Proteinextraktion är ett viktigt prov preparering steg i proteomik.
- Proteiner kan extraheras från växt-och djur vävnad, jäst och mikroorganismer.
- Ultraljudsbehandling är en pålitlig, effektiv protein utvinning metod som ger hög protein avkastning inom en kort utvinning tid.
Protein utvinning från vävnader och celler
Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är ett viktigt provberedningssteg som utförs under många biokemiska och analytiska tekniker som ELISA, PAGE, Western blotting, masspektrometri eller proteinrening. Ultraljud cell störningar, lys och extraktion är en exakt kontrollerbar, icke-termisk teknik för att säkerställa höga utbyten av proteiner.
Proteinextraktion från celler med ultraljud sond UP200St
- Snabb
- hög avkastning
- mycket effektiv
- Exakt kontroll över parametrar
- Reproducerbara resultat
- Linjär skalbarhet
Allmänna instruktioner för ultraljud lys och protein extraktion
- Temperatur kontroll: För att säkerställa en hög protein avkastning utan termisk denaturering måste temperaturen under extraktionen kontrol leras. Hielschers State-of-Art ultraljud Homogenisatorer – även kallad ultraljud disintegrator eller ultrasonifier – är exakt kontrollerbara. De kommer med en plugable temperatur sensor. I inställnings alternativen för ultraljud Homogenisatorer, en maximal temperatur kan ställas in. När denna temperatur Max nås, ultrasonicator stannar automatiskt tills provet har svalnat.
- Buffert: Val av lämplig buffert och rätt buffertmängd varierar från vävnad till vävnad och måste fastställas genom test och fel testning.
- Isolering/rening: Proteinlysat kan innehålla ett överskott av biomoleculer såsom DNA eller kolhydrater, som kan avlägsnas genom protein fällning (deoxicholat-triklorättiksyra) eller buffertutbyte.
Chittapalo och Noomhorm (2009) rapporterade i sin studie att proteinutbytet ökade med ultraljudsbehandling och att ultraljudsvävnadshomogenisering och lysprocess kan förbättra befintliga extraktionsprocesser avsevärt – möjliggör nya kommersiella utvinnings möjligheter.
Ultraljud CupHorn för samtidig beredning av mycket effektiva prov av flera prover under samma betingelser för proteinisolering och DNA-fragmentering.
Protein utvinning från djur vävnad
För beredning av hel-storlek vävnad (t. ex. njure, hjärta, lunga, muskel etc.), bör vävnaden dissekeras i mycket små bitar med rena verktyg, på isen helst, och så snabbt som möjligt för att förhindra nedbrytning av proteaser (t. ex. lysis buffert såsom RIPA eller hypotonisk lysbuffert innehållande proteas och fosfatashämmare cocktail). Efter dissekera, är provet nedsänkt i flytande kväve för Snap Freeze. Provet kan förvaras vid-80 ° c för senare användning eller vara höll på is för omedelbar homogenisering. Omedelbart före ultraljud utvinning, is kallt lysis buffert (med proteashämmare DTT, leupeptin och aprotinin) tillsätts snabbt i provet röret (per ~ 10 mg vävnad ca. ~ 600 μL buffert rekommenderas). Ca. 20-60mg vävnad rekommenderas per provrör.
Ultraljud homogenisering, lys och extraktion utförs med en ultraljud homogenisator såsom UP100H eller UP200Ht, utrustad med en mikro-spets sonotrode. Ultraljudsbehandling varaktighet är 60-90 sek. vid en ultraljud cykel läge av 15 sek. ultraljudsbehandling och 10 sek. Provet ska hållas i is hela tiden.
Efter ultraljud homogenisering/utvinning, är lysat centrifugeras på 27, 000g för ca. 20 min. efteråt supernatenten samlas in, så att protein koncentrationen kan bestämmas genom ett protein assay såsom Pierce protein assay BCA.
Protein utvinning från blod serum
För en homogen blandning av serumet och fosfatbufferten virvlas provet först före ultraljudscelllys. För ultraljudslysen är provet sonicated med en ultraljud lab homogenisator såsom UP100H för 8 cykler vid 20% amplitud, för cykler av varje 5 sekunder på och 15 sekunder av. Proteinutvinning utförs genom ultraljudsbehandling i cykler (pulseringsläge) och genom att placera provet på is så att överhettning och termisk nedbrytning av provet undviks. Eftersom serum innehåller en stor mängd proteiner med hög molekylvikt (såsom albumin, a1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G och immunoglobulin A), som stör separationen av proteiner med låg molekylvikt under IEF, rekommenderas att tömma dem från serumet med hjälp av en utarmningskolonn.
Protein utvinning från växt vävnad
Färsk, mjuk växtvävnad, e.g. Moss etc., kan lätt störas genom att helt enkelt placera den hackade provmaterialet i lysis buffert för ultraljudsbehandling. Tuffa, ligenösa växt vävnader, såsom frön, barr etc., bör malas torrt. Vissa hårda, vedartade växtmaterial måste frysas och mals i flytande kväve innan extraheras av ultraljudsbehandling. För växternas cellkultur suspensioner, en Ultraljuds behandling mellan 30 och 150 sekunder i en lysis buffert är mestadels tillräckligt. Hårdare material såsom pumpafrön kräver en mer intensiv ultraljudsbehandling som beskrivs nedan.
Protokoll för ultraljud utvinning av albumin från pumpafrön
För ultraljud protein utvinning av albumin från finmalda pumpa fröpulver, 10 g avfettad pumpa fröpulver och 100 ml avjoniserat vatten som lösningsmedel tillsätts i en 250mL glas bägare. Proteinextraktionen består av två steg: Först sonikeras provet med en sond-typ ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) utrustad med sonotrode S24d7. Glasbägaren placeras i ett kallvattenbad under ultraljudshomogeniseringen. Den pluggbara temperatursensorn och temperaturkontrollinställningarna för ultraljudsapparaten UP400St säkerställer att provtemperaturen alltid hålls under 30 ° C. Genom den exakta temperaturkontrollen under ultraljudsbehandling undviks en denaturering av albumin. För det andra utfördes extraktionen med en mixer vid 200 rpm hastighet och vid 30 ° C. Därefter överförs bägaren till en termostatisk skakapparat. Globulin avlägsnas via dialys med destillerat vatten. Efter avlägsnande av globulin kan proteinextraktet provtas för bestämning av albuminprofilen och justeras därefter till pI = 3,0 med användning av 0,1 M HCl för albuminkoagulation. Den fasta fasen separeras genom centrifugering vid 5000 g, 20 °C och löses upp i avjoniserat vatten. Albuminkoagulering utförs två gånger för att öka proteinförhållandet i albuminkoncentratet.
Ultraljud alkaliska protein utvinning för beredning av proteinkoncentrat från riskli visar att Ultraljuds behandling resulterar i högre protein avkastning i en betydligt kortare utvinning tid – jämfört med konventionella extraktionsmetoder.
Prov berednings protokoll för funktionella iNOS-enzym
För att erhålla fullt fungerande iNOS-enzym (t.ex. för läkemedelsscreening) rekommenderas följande protokoll: Cellsuspensionen ska placeras på is och är sonikerad med en UP100H vid 10μm amplitud vid cykelläge på 5 sek. Förfarandet bör upprepas ca 3 gånger. Vilotiden mellan ultraljudsbehandling cykler minskar temperaturökningen och kommer därför att minska risken för denaturering.
Ultraljud Proteinlösbilisering
Ultraljudsbehandling kan påskynda proteinet inlösning process, som vanligt vis kräver flera timmar. För att inte överhetta provet och förhindra protein nedbrytning och modifieringar i lösningar som innehåller urea, ultraljud skurar bör inte pågå längre än några sekunder.
Ultrasonicator UP200Ht med 2mm microtip S26d2 för ultraljudsbehandling av små prover.
Ultraljud utrustning för protein utvinning
Hielscher Ultrasonics erbjuder ett brett spektrum av ultraljud Homogenisatorer för sönderfall av celler, vävnader, bakterier, mikroorganismer, jäst, och sporer.
Hielscher lab ultrasonicators är kraftfulla och enkla att använda. De är byggda för 24/7 drift och är utformade som robusta och effektiva laboratorie- och bänkenheter. För alla enheter kan energiproduktionen och amplituden styras exakt. Det breda utbudet av tillbehör öppnar ytterligare installationsalternativ. De digitala ultrasonicators som VialTweeter, UP200Ht, UP200St och UP400St har en integrerad temperaturkontroll och ett inbyggt SD-kort för automatisk datainspelning.
För indirekt, korskontaminering-fri och samtidig ultraljudsbehandling av flera prover, erbjuder vi VialTweeter eller ultraljud CupHorn.
Tabellen nedan ger dig en översikt över våra ultrasonicators för provberedning, cellstörning och extraktion. Klicka på enhetstypen för att få mer information om varje ultraljudshomogenisator. Vår välutbildade och långvariga erfarenheter teknisk personal hjälper dig gärna att välja den mest lämpliga ultrasonicator för din provberedning!
| batch Volym | Flödeshastighet | Rekommenderade Devices |
|---|---|---|
| upp till 10 injektionsflaskor eller rör | n.a. | VialTweeter |
| multiwell / microtiter plattor | n.a. | UIP400MTP |
| flera rör / kärl | n.a. | Cuphorn |
| 1 till 500 ml | 10 till 200 ml / min | UP100H |
| 10 till 1000 ml | 20 till 200 ml/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml / min | UP400St |
Beroende på ditt program, material och prov volym, kommer vi att rekommendera dig den lämpligaste inställningen för ditt prov prep. Kontakta oss idag!
Kontakta oss! / Fråga oss!
Hielscher digitala ultrasonicators har en webbläsare fjärrkontroll och automatisk data protokoll på ett integrerat SD-kort.
VialTweeter för indirekta ultraljudsbehandling.
Fakta Värt att veta
Proteomik
Proteomik är forsknings fältet som undersöker proteiner och proteomen. Proteiner fullfil ett brett spektrum av vitala funktioner inom organismer. Proteomet är hela uppsättningen av proteiner som uttrycks genom en arvs massa, cell, vävnad eller organism vid en viss tidpunkt. Proteomet varierar med tid och distinkta krav, eller betonar, att en cell eller organism genomgår. Mer specifikt är det uppsättningen av uttryckta proteiner i en given typ av cell eller organism, vid en given tidpunkt, under definierade förhållanden. Termen är en blandning av proteiner och arvs massa. Proteomik är studiet av proteomen.
Protein
Proteiner är stora biomoleculer, s.k. makro molekyler – som består av en eller flera långa kedjor av aminosyrerester. Proteiner är närvarande i alla organismer av både vegetabiliskt och animaliskt ursprung och de är avgörande för de flesta av de biologiska funktionerna. Eftersom proteiner innehåller mycket biologisk information extraheras de för analytiska ändamål, t ex för proteomisk forskning. Den viktigaste funktionen som utförs av proteiner inkluderar katalys av metaboliska reaktioner, DNA-replikation, respons på stimuli, och transport av molekyler från en plats till en annan. Proteiner skiljer sig från varandra främst i deras sekvens av aminosyror, som styrs av nukleotid sekvens av deras gener, och som vanligt vis resulterar i protein vikning till en specifik tredimensionell struktur som bestämmer dess aktivitet. Proteiner är – Förutom peptider – en av de viktigaste komponenterna i livsmedel. Därför är proteomik ett kraftfullt verktyg i livsmedels vetenskap för att optimera processer, livsmedels säkerhet och näringsmässiga bedömning.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction är ett föranalytiskt förfarande för att separera och förkoka analyter. I kombination med ultraljud kan molnpunkt utvinning intensifieras vilket gör processen effektivare, snabbare och miljövänligare. Med ultraljud är molnpunktsutvinning en betydligt effektivare metod för analytberedning. Läs mer om ultraljudsassisterad molnpunktsutvinning!Gel elektrofores
Gelelektrofores är den viktigaste metoden för separation och analys av makro molekyler som DNA, RNA och proteiner samt deras fragment, baserat på deras storlek och laddning. Det används i klinisk kemi för att separera proteiner genom laddning och/eller storlek (IEF agarose, väsentligen storlek oberoende) och i biokemi, molekylärbiologi och proteomik att separera en blandad population av DNA och RNA fragment av längd, för att uppskatta storleken på DNA-och RNA-fragment eller separera proteiner genom laddning.
Cellkulturer
Cell odling är den kontrollerade odlings processen genom vilken celler odlas under kontrollerade betingelser. Cell odlings förhållandena varierar för varje cell typ. I allmänhet består miljön av en cell kultur av ett lämpligt kärl (t. ex. petriskål) med substrat eller medium som förser de essentiella näringsämnena (aminosyror, kolhydrater, vitaminer, mineraler), tillväxtfaktorer, hormoner och gaser (CO2O2) och reglerar den fysikalisk-kemiska miljön (pH-buffert, osmotiskt tryck, temperatur). De flesta celler behöver en yta eller konstgjorda substrat, medan andra cell kulturer kan odlas fritt flytande i odlings substrat (SUS pension kultur, cell SUS pension).
Mass kulturer av animaliska cellinjer används i industriell produktion av virus vacciner och andra bioteknologiskt framställda produkter. Mänskliga stamceller odlas för att utöka antalet celler och differentiera cellerna till olika somatiska cell typer för transplantations ändamål.
Vävnadsprover
Termen vävnad beskriver en cellulär intermediär, där cell materialet är på en organisatorisk nivå mellan celler och ett komplett organ. I vävnad är liknande celler, från samma ursprung som tillsammans utför en specifik funktion, monterade. Genom funktionell gruppering av flera vävnader bildas de komplexa strukturerna av organ.
Vävnad samplas för forskning inom biologi, histologi/histopatologi, parasitologi, biokemi, immunohistokemi samt för att odla och extrahera DNA. Det kan särskiljas mellan djur (indelning: däggdjurs vävnad) och växtvävnad. Djurvävnader är grupperade i fyra grundläggande typer av bindväv, muskel, nervös, och epitelial vävnad. Växtvävnad är indelad i följande tre vävnads system: epidermis, marken vävnad, och kärl vävnaden.
Vävnads prov kan framställas från djur-eller växt delar, t. ex. ben, muskler, löv etc.
Kroppsvätskor
Blod, serum, plasma, cerebrospinalvätska, saliv och synovialvätska är kropps vätskor, som erbjuder en stor källa till diagnotiskt relevant information. Därför är en sofistikerad beredning av kroppen vätske prov för analys viktigt. Den första svårigheten är förknippad med det breda dynamiska omfånget av komponenter som finns i kropps vätskor.
Bestämning av protein koncentration
Bradford assay, Lowry analys och bicinchoninic syra (BCA) assay är vanliga analyser för att bestämma koncentrationen av proteiner. Bovint serumalbumin (BSA) är en av de vanligast använda protein standard.
Lyseringsbuffert
Lyseringsbuffert måste väljas i enlighet med cell material eller vävnad (vävnads odling, växt, bakterier, svampar, etc.), och om cellerna är i en struktur och typ av struktur. Ett brett spektrum av lyseringsbuffertar för extraktion av proteiner, membran och organeller är formulerade med ett eller flera rengörings medel. Rengörings medlet väljs vanligt vis via test-och fel test eller – om tillgängligt – enligt ett befintligt protein utvinnings protokoll. Rengörings medlet måste vara kompatibelt med vävnads källan och proteinerna. I allmänhet är det mildaste tvätt medel som fungerar för en specifik vävnad/protein, väljs för att bibehålla maximal funktionalitet av extraktet. Dessutom, i händelse av en extraktion av membran och organeller, ett milt rengörings medel håller membranet intakt. Vanligen använda rengörings medel i lyseringsbuffertar är mesta dels nonionisk eller zwitterionic, t ex CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, och Tween 20.
Till exempel, vävnader såsom hjärna, lever, tarm, njure, mjälte etc. kan helt enkelt bubbas med RIPA – proteashämmare och DTT (t. ex. för gelelektrofores) bör inkluderas.
Lyseringsbuffert för Skelett muskel vävnad (iskaffe): 20 mM tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (vikt/volym) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mm ditiothreitol kompletterat med proteas-och fosfatashämmare cocktail
Tabell över gemensamma buffertar och deras pH-omfång. I allmänhet används dessa buffertar normalt vid koncentrationer på 20-50 mM.
| Buffert | pH-omfång |
|---|---|
| Citronsyra – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natriumcitrat – Citronsyra | 3,0 – 6,2 |
| Natriumacetat – Ättiksyra | 3,6 – 5,6 |
| Natrium salt av cacodylic Acid – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| Mes – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natriumdivätefosfat – dinatriumvätefosfat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Moppar – Koh | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolaminhydroklorid – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| Tricine – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| Natriumtetraborat – Borsyra | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| Glycin – Naoh | 8,6 – 10,6 |
De flesta buffertar visar ett pH-beroende med temperatur. Detta gäller särskilt för tris buffertar. PKa ändras från 8,06 vid 25 ° c till 8,85 vid 0 ° c.
(pH och pKa i en buffert: pH mäter koncentrationen av vätejoner i en vatten lösning. pKa (= Acid dissociationskonstant) är en relaterad, men mer specifik åtgärd, eftersom den hjälper till att förutsäga hur en molekyl kommer att agera vid ett specifikt pH-värde.)
Mer från TRIzol
TRIzol är en kemisk lösning som används för att extrahera RNA/DNA/protein under utvinning av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform. Användningen av ultraljud assisterad TRIzol utvinning resulterar i hög DNA, RNA, och protein avkastningen från samma prov och utmärker därmed andra extraktionsmetoder.
Litteratur / Referenser
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.