Ultraljud proteinextraktion från vävnads- och cellkulturer
- Proteinextraktion är ett viktigt provberedningssteg inom proteomik.
- Proteiner kan utvinnas ur växt- och djurvävnad, jäst och mikroorganismer.
- Ultraljudsbehandling är en pålitlig, effektiv protein extraktion metod som ger höga protein utbyten inom en kort extraktionstid.
Proteinutvinning från vävnader och celler
Proteinextraktion från vävnader och odlade celler är ett viktigt provberedningssteg som utförs under många biokemiska och analytiska tekniker såsom ELISA, PAGE, Western blotting, masspektrometri eller proteinrening. Ultraljud cellstörning, lys och extraktion är en exakt kontrollerbar, icke-termisk teknik för att säkerställa höga utbyten av proteiner.
Proteinextraktion från celler med ultraljudssond UP200St
- Snabb
- Höga skördar
- Mycket effektiv
- Exakt kontroll över parametrar
- Reproducerbara resultat
- Linjär skalbarhet
Allmänna instruktioner för ultraljudslys och proteinextraktion
- Temperaturreglering: För att säkerställa ett högt proteinutbyte utan termisk denaturering måste temperaturen under extraktionen kontrolleras. Hielschers toppmoderna homogenisatorer för ultraljud – även kallad ultraljudsdesintegrator eller ultraljudsförstärkare – är exakt kontrollerbara. De kommer med en pluggbar temperatursensor. I inställningsalternativen för ultraljudshomogenisatorn kan en maximal temperatur ställas in. När denna temperatur max har uppnåtts stannar ultraljudaren automatiskt tills provet har svalnat.
- Buffert: Valet av en lämplig buffert och rätt volym av buffert varierar från vävnad till vävnad och måste tas reda på genom trial-and-error-testning.
- Isolering / rening: Proteinlysat kan innehålla ett överskott av biomolekyler såsom DNA eller kolhydrater, som kan avlägsnas genom proteinutfällning (deoxikolat-triklorättiksyra) eller buffertutbyte.
Chittapalo och Noomhorm (2009) rapporterade i sin studie att proteinutbytet ökade med hjälp av ultraljudsbehandling och att ultraljudsvävnadshomogenisering och lyseringsprocessen kan förbättra befintliga extraktionsprocesser avsevärt – möjliggöra nya kommersiella utvinningsmöjligheter.
Ultraljud CupHorn för samtidig provberedning av flera prover under samma betingelser för proteinisolering och DNA-fragmentering.
Proteinutvinning från animalisk vävnad
För beredning av vävnad i hel storlek (t.ex. njure, hjärta, lungor, muskler etc.) bör vävnaden dissekeras i mycket små bitar med rena verktyg, helst på is, och så snabbt som möjligt för att förhindra nedbrytning av proteaser (t.ex. lysbuffert som RIPA eller hypoton lysbuffert som innehåller proteas och fosfatashämmare). Efter dissekering sänks provet ner i flytande kväve för snapfrysning. Provet kan förvaras vid -80 °C för senare användning eller förvaras på is för omedelbar homogenisering. Omedelbart före ultraljudsextraktion tillsätts iskall lysbuffert (med proteashämmare DTT, leupeptin och aprotinin) snabbt i provröret (per ~10 mg vävnad rekommenderas ca ~600 μL buffert). Ca 20-60 mg vävnad rekommenderas per provrör.
Ultraljudshomogenisering, lys och extraktion utförs med en ultraljudshomogenisator som UP100H eller UP200Ht, utrustad med en mikrospets sonotrode. Ultraljudsbehandling varaktighet är 60-90 sek. vid en ultraljudscykel läge på 15 sek. ultraljudsbehandling och 10 sek. vilotid. Provet ska förvaras i is hela tiden.
Efter ultraljudshomogenisering/extraktion centrifugeras lysatet vid 27 000 g i ca 20 minuter. Därefter samlas supernagenten in, så att proteinkoncentrationen kan bestämmas med hjälp av en proteinanalys, t.ex. Pierce Protein Assay BCA.
Proteinextraktion från blodserum
För en homogen blandning av serum och fosfatbuffert virvlas provet först före ultraljudscelllys. För ultraljudslysen är provet sonikerat med en ultraljudslaboratorium homogenisator som UP100H i 8 cykler vid 20% amplitud, för cykler av varje 5 sekunder på och 15 sekunder av. Proteinextraktion utförs genom ultraljudsbehandling i cykler (pulsationsläge) och genom att placera provet på is så att en överhettning och termisk nedbrytning av provet undviks. Eftersom serum innehåller en stor mängd proteiner med hög molekylvikt (t.ex. albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunglobulin G och immunglobulin A), som stör separationen av lågmolekylära proteiner under IEF, rekommenderas att de töms från serumet med hjälp av en utarmningskolonn.
Proteinutvinning från växtvävnad
Färsk, mjuk växtvävnad, t.ex. mossa etc., kan lätt störas genom att helt enkelt placera det hackade provmaterialet i lysbuffert för ultraljudsbehandling. Sega, ligenösa växtvävnader, såsom frön, granbarr etc., bör malas torra. Vissa hårda, vedartade växtmaterial måste frysas och malas i flytande kväve innan de extraheras genom ultraljudsbehandling. För växtcellsodlingssuspensioner är en ultraljudsbehandling mellan 30 och 150 sekunder i en lysbuffert för det mesta tillräcklig. Tuffare material som pumpafrön kräver en mer intensiv ultraljudsbehandling som beskrivs nedan.
Protokoll för ultraljud extraktion av albumin från pumpafrön
För ultraljudsproteinextraktion av albumin från finmalet pumpafröpulver tillsätts 10 g avfettat pumpafröpulver och 100 ml avjoniserat vatten som lösningsmedel i en 250 ml glasbägare. Proteinextraktionen består av två steg: Först är provet ultraljudsbehandlat med en sond-typ ultraljudsapparat UP400St (400W, 24kHz) utrustad med sonotrode S24d7. Glasbägaren placeras i ett kallvattenbad under ultraljudshomogeniseringen. Den pluggbara temperatursensorn och temperaturkontrollinställningarna för ultraljudsapparaten UP400St säkerställer att provtemperaturen alltid hålls under 30°C. Genom den exakta temperaturkontrollen under ultraljudsbehandling undviks en denaturering av albumin. För det andra utfördes extraktionen med en mixer vid 200 rpm hastighet och vid 30°C. Därefter överförs bägaren till en termostatisk shaker. Globulin avlägsnas via dialys med destillerat vatten. Efter att globulinet avlägsnats kan prov tas från proteinextraktet för bestämning av albuminprofilen och därefter justeras till pI=3,0 med användning av 0,1 M HCl för albuminkoagulation. Den fasta fasen separeras genom centrifugering vid 5000 g, 20 °C och löses upp på nytt i avjoniserat vatten. Albuminkoagulation utförs två gånger för att öka proteinförhållandet i albuminkoncentratet.
Ultraljud alkalisk proteinextraktion för framställning av proteinkoncentrat från riskli visar att ultraljudsbehandlingen resulterar i högre proteinutbyte i en betydligt kortare extraktionstid – jämfört med konventionella extraktionsmetoder.
Protokoll för provberedning för funktionellt iNOS-enzym
För att erhålla fullt fungerande iNOS-enzym (t.ex. för läkemedelsscreening) rekommenderas följande protokoll: Cellsuspensionen bör placeras på is och är sonikerad med en UP100H vid 10 μm amplitud vid cykelläge på 5 sek. ultraljudsbehandling och 25 sek. vila på is. Proceduren bör upprepas ca 3 gånger. Vilotiden mellan ultraljudsbehandlingscykler minskar temperaturökningen och kommer därför att minska risken för denaturering.
Ultraljud protein solubilisering
Ultraljudsbehandling kan påskynda proteinsolubiliseringsprocessen, vilket vanligtvis kräver flera timmar. För att inte överhetta provet och förhindra proteinnedbrytning och modifieringar i lösningar som innehåller urea, bör ultraljudssprängningarna inte vara längre än några sekunder.
Ultraljud UP200Ht med 2mm microtip S26d2 för ultraljudsbehandling av små prover.
Ultraljudsutrustning för proteinextraktion
Hielscher Ultrasonics erbjuder ett brett utbud av ultraljudshomogenisatorer för sönderdelning av celler, vävnader, bakterier, mikroorganismer, jäst och sporer.
Hielscher lab ultraljudsapparater är kraftfulla och lätta att använda. De är byggda för 24/7-drift och är utformade som robusta och effektiva laboratorie- och bänkenheter. För alla enheter kan energiutmatningen och amplituden styras exakt. Det breda utbudet av tillbehör öppnar upp för ytterligare inställningsmöjligheter. De digitala ultraljudsapparaterna som VialTweeter, UP200Ht, UP200St, och UP400St har en integrerad temperaturkontroll och ett inbyggt SD-kort för automatisk dataregistrering.
För indirekt, korskontaminering fri och samtidig ultraljudsbehandling av flera prover, erbjuder vi VialTweeter eller ultraljud CupHorn.
Tabellen nedan ger dig en översikt över våra ultraljudsapparater för provberedning, cellstörning och extraktion. Klicka på enhetstypen för att få mer information om varje ultraljudshomogenisator. Vår välutbildade och långvariga erfarenhet tekniska personal hjälper dig gärna att välja den mest lämpliga ultraljudsapparaten för din provberedning!
| Batchvolym | Flöde | Rekommenderade enheter |
|---|---|---|
| Upp till 10 injektionsflaskor eller tuber | N.A. | VialTweeter |
| Multiwell / Microtiterplattor | N.A. | UIP400MTP |
| Flera rör / kärl | N.A. | Kopparhorn |
| 1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min | UP100H |
| 10 till 1000 ml | 20 till 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min | UP400St |
Beroende på din applikation, material och provvolym kommer vi att rekommendera dig den mest lämpliga inställningen för din provförberedelse. Kontakta oss idag!
Kontakta oss! / Fråga oss!
Hielscher digitala ultraljudsapparater har en webbläsare fjärrkontroll och automatisk dataprotokollering på ett integrerat SD-kort.
VialTweeter för indirekt ultraljudsbehandling.
Fakta som är värda att veta
Proteomik
Proteomik är det forskningsområde som undersöker proteiner och proteomet. Proteiner uppfyller ett brett spektrum av vitala funktioner i organismer. Proteomet är hela uppsättningen proteiner som uttrycks av ett genom, en cell, en vävnad eller en organism vid en viss tidpunkt. Proteomet varierar med tid och olika krav, eller påfrestningar, som en cell eller organism genomgår. Mer specifikt är det uppsättningen uttryckta proteiner i en given typ av cell eller organism, vid en given tidpunkt, under definierade förhållanden. Termen är en blandning av proteiner och genom. Proteomik är läran om proteomet.
protein
Proteiner är stora biomolekyler, så kallade makromolekyler – som består av en eller flera långa kedjor av aminosyrarester. Proteiner finns i alla organismer av både vegetabiliskt och animaliskt ursprung och de är avgörande för de flesta av de biologiska funktionerna. Eftersom proteiner innehåller mycket biologisk information extraheras de för analytiska ändamål, t.ex. för proteomisk forskning. Den viktigaste funktionen som utförs av proteiner inkluderar katalys av metaboliska reaktioner, DNA-replikation, svar på stimuli och transport av molekyler från en plats till en annan. Proteiner skiljer sig från varandra främst i sin sekvens av aminosyror, som dikteras av nukleotidsekvensen i deras gener, och som vanligtvis resulterar i att protein veckas till en specifik tredimensionell struktur som bestämmer dess aktivitet. Proteiner är – Förutom peptider – en av de viktigaste komponenterna i livsmedel. Därför är proteomik ett kraftfullt verktyg inom livsmedelsvetenskap för att optimera processer, livsmedelssäkerhet och näringsbedömning.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction är en preanalytisk procedur för att separera och förkonkretisera analyter. I kombination med ultraljud kan utvinning av grumlingspunkter intensifieras vilket gör processen effektivare, snabbare och miljövänligare. Med ultraljud är grumlingspunktsextraktion en betydligt effektivare metod för analytberedning. Läs mer om ultraljudsassisterad extraktion av molnpunkter!Gelelektrofores
Gelelektrofores är den viktigaste metoden för separation och analys av makromolekyler som DNA, RNA och proteiner samt deras fragment, baserat på deras storlek och laddning. Det används inom klinisk kemi för att separera proteiner efter laddning och/eller storlek (IEF-agaros, i huvudsak storleksoberoende) och inom biokemi, molekylärbiologi och proteomik för att separera en blandad population av DNA- och RNA-fragment efter längd, för att uppskatta storleken på DNA och RNA-fragment eller för att separera proteiner genom laddning.
Cellkulturer
Cellodling är den kontrollerade odlingsprocess genom vilken celler odlas under kontrollerade förhållanden. Cellodlingsförhållandena varierar för varje celltyp. I allmänhet består miljön i en cellkultur av ett lämpligt kärl (t.ex. petriskål) med substrat eller medium som tillför de essentiella näringsämnena (aminosyror, kolhydrater, vitaminer, mineraler), tillväxtfaktorer, hormoner och gaser (CO2, O2) och reglerar den fysiokemiska miljön (pH-buffert, osmotiskt tryck, temperatur). De flesta celler behöver en yta eller ett artificiellt substrat, medan andra cellkulturer kan odlas fritt flytande i odlingsmedium (suspensionskultur, cellsuspension).
Masskulturer av djurcellinjer används i industriell produktion av virala vacciner och andra biotekniskt framställda produkter. Mänskliga stamceller odlas för att utöka antalet celler och differentiera cellerna till olika somatiska celltyper för transplantationsändamål.
Vävnadsprover
Termen vävnad beskriver en cellulär intermediär, där cellmaterialet befinner sig på en organisatorisk nivå mellan celler och ett helt organ. I vävnad monteras liknande celler, från samma ursprung som tillsammans utför en specifik funktion. Genom den funktionella grupperingen av flera vävnader bildas de komplexa strukturerna av organ.
Vävnad provtas för forskning inom biologi, histologi/histopatologi, parasitologi, biokemi, immunhistokemi samt för att odla och extrahera DNA. Det kan skiljas mellan djurvävnad (underavdelning: däggdjursvävnad) och växtvävnad. Animaliska vävnader grupperas i de fyra grundläggande typerna av bindväv, muskelvävnad, nervvävnad och epitelvävnad. Växtvävnad är indelad i följande tre vävnadssystem: epidermis, markvävnaden och kärlvävnaden.
Vävnadsprover kan framställas från djur- eller växtdelar, t.ex. ben, muskler, löv etc.
Kroppsvätskor
Blod, serum, plasma, cerebrospinalvätska, saliv och ledvätska är kroppsvätskor som utgör en stor källa till diagnostiskt relevant information. Därför är det viktigt med en sofistikerad förberedelse av kroppsvätskeprover för analys. Den första svårigheten är förknippad med det breda dynamiska omfånget av komponenter som finns i kroppsvätskor.
Bestämning av proteinkoncentration
Bradford-analys, Lowry-analys och bicinkoninsyra (BCA) -analys är vanliga analyser för att bestämma koncentrationen av proteiner. Bovint serumalbumin (BSA) är en av de mest använda proteinstandarderna.
Buffert för lys
Lysbuffert måste väljas i enlighet med cellmaterialet eller vävnaden (vävnadskultur, växt, bakterier, svampar etc.) och om cellerna finns i en struktur och typen av struktur. Ett brett utbud av lysbuffertar för extraktion av proteiner, membran och organeller är formulerade med ett eller flera rengöringsmedel. Tvättmedlet väljs vanligtvis genom trial-and-error-tester eller – om tillgängligt – enligt ett befintligt protokoll för proteinextraktion. Tvättmedlet måste vara kompatibelt med vävnadskällan och proteinerna. I allmänhet väljs det mildaste tvättmedlet som fungerar för en specifik vävnad / protein för att bibehålla extraktets maximala funktionalitet. Dessutom, vid extraktion av membran och organeller, håller ett milt rengöringsmedel membranet intakt. Vanligt använda rengöringsmedel i lysbuffertar är mestadels nonjoniska eller zwitterjoniska, t.ex. CHAPS, deoxikolat, Triton™ X-100, NP40 och Tween 20.
Till exempel kan vävnader som hjärna, lever, tarm, njure, mjälte etc. helt enkelt buffras med RIPA – proteashämmare och DTT (t.ex. för gelelektrofores) bör dock inkluderas.
Lysbuffert för skelettmuskelvävnad (iskall kyla): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol kompletterad med proteas- och fosfatashämmarcocktail
Tabell över vanliga buffertar och deras pH-intervall. I allmänhet används dessa buffertar normalt vid koncentrationer på 20-50 mM.
| buffert | pH-omfång |
|---|---|
| Citronsyra – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natriumcitrat – Citronsyra | 3.0 – 6.2 |
| Natriumacetat – ättiksyra | 3.6 – 5.6 |
| Kacodylsyra natriumsalt – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natriumdivätefosfat – dinatriumvätefosfat | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPPAR – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolaminhydroklorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES (ÄRE) – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricin – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natriumtetraborat – borsyra | 7.6 – 9.2 |
| Bicine (Bicine) – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
De flesta buffertar visar ett pH-beroende med temperaturen. Detta gäller särskilt för Tris-buffertar. pKa ändras från 8,06 vid 25 °C till 8,85 vid 0 °C.
(pH och pKa för en buffert: pH mäter koncentrationen av vätejoner i en vattenlösning. pKa (= syradissociationskonstant) är ett relaterat, men mer specifikt mått, eftersom det hjälper till att förutsäga hur en molekyl kommer att agera vid ett specifikt pH-värde.)
TRIzol
TRIzol är en kemisk lösning som används för att extrahera RNA/DNA/protein under extraktionen av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform. Användningen av ultraljudsassisterad TRIzol-extraktion resulterar i högt DNA-, RNA- och proteinutbyte från samma prov och utmärker sig därmed andra extraktionsmetoder.
Litteratur/Referenser
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.