Ultraljuds Lys av E. Coli
- E. coli-bakterier är de vanligaste bakterierna inom mikrobiologi och bio teknik.
- Ultraljud cell ämnen ger tillförlitliga och reproducerbara resultat för lys av E. coli.
- Intensiva men exakt kontrollerbara kavitation och skjuvning krafter resultera i fullständig störning och hög utvinning avkastning (t. ex. proteiner, DNA).
Varför är ultraljud cell störning av E. coli den föredragna metoden?
Ultraljud homogenisatorer eller sond-typ ultrasonicators erbjuder flera fördelar för E. coli lys som intensiv ultraljud effektivt stör cellväggar och membran. Sond-typ ultrasonicators används ofta för E. coli-lys på grund av följande skäl:
Proteinextraktion från E. coli-celler utförs effektivt med ultraljud sond UP200St
Probe-typ ultrasonicator erbjuder många fördelar för E. coli lysis. Den tillförlitliga och exakta kontrollen över ultraljudsprocessparametrar gör det möjligt att optimera driftsparametrarna som effekt, varaktighet och provhantering för att uppnå önskat resultat.
Elektroforetiska analyser av genomiskt DNA av E. coli EDL933 utsätts för 0 – 15 min ultraljud. L indikerar DNA-stegen.
(studie och bild: ©Basselet et al. 2008)
Cell störningar med ultraljud kavitation
Ultraljud sond-typ homogenisatorer arbetar med ca. 20.000 cykler per sekund (vid 20kHz) och orsaka kavitation i vätskor eller suspensioner. Akustisk kavitation mikroskopiska områden med vakuumliknande tryck och höga temperaturer som riva celler isär. Även om temperaturen kan nå flera tusen grader Celsius är kavitationsvolymerna så små att de inte värmer processen avsevärt. Ultraljud genererade akustisk kavitation och skjuvkrafter perforerar eller bryter cellmembranet i bakterieceller såsom E. coli. Hielscher ultrasonicators tillåter exakt kontroll över processparametrar såsom ultraljud intensitet, amplitud, energiingång, och temperatur. Därigenom kan ultraljudslysprocessen anpassas optimalt till celltypen, cellkulturen och processmålet.
- noggrann kontroll av Lys (intensitet, amplitud, temperatur)
- tillförlitliga, reproducerbara resultat
- optimal anpassning till specifika prover
- temperaturkontroll
- för mycket små till mycket stora prover (μL till liter)
- Rent mekanisk behandling
- Användarvänlig, säker drift
- linjär skala upp från labb till produktion
VialTweeter för ultraljud Lys
Ultraljud homogenisator vs andra lystekniker
Medan kemisk och enzymatisk lys kan vara problematisk – eftersom kemisk Lys kan förändra protein strukturer och införa renings problem och enzymatisk Lys kräver långa inkubations tider och inte är reproducerbara – ultraljud störningar är en sofistikerad, snabb cell störning metod.
Ultraljud lys är baserad på mekaniska krafter endast. Inga kemikalier tillsätts, ultraljudsbehandling bryter cellväggen genom skjuvkrafter. Kemisk lys kan förändra proteinstrukturen och införa reningsproblem. Enzymatisk störning kräver långa inkubationstider och är inte reproducerbar. Ultraljud cell störning av E. coli bakterieceller är snabb, enkel, pålitlig och reproducerbar. Det är därför Hielscher ultrasonicators används i biologiska och biokemiska laboratorier runt om i världen för provberedning, pre-ananlytics, in vitro diagonstics och mångfaldiga analyser.
Allmänna rekommendationer för ultraljud lys
Ultraljudsbehandling är den mest populära tekniken för lyseringslösning mycket små, medium och stora mängder av cell SUS pensioner – från Pico-liter upp till 100L/HR (med hjälp av en ultraljud flöde cell). Cellerna lyseras av vätskeskjuvning och kavitation. DNA är också klippt under ultraljudsbehandling, så det är inte nödvändigt att lägga DNase till cell SUS pensionen.
Temperaturkontroll under ultraljud E.coli lys
Genom Pre-kylning provet och hålla provet under ultraljudsbehandling på isen, prov termisk nedbrytning av provet kan lätt förhindras.
Helst bör proverna hållas iskalla under lys, men för de flesta prover är det tillräckligt om temperaturen inte stiger över temperaturen på kulturen eller vävnadskällan. Därför rekommenderas, att hålla upphängningen på is och att sonikera med flera korta ultraljud pulser på 5-10 sek och pauser på 10-30 sek. Under pauserna kan värmen försvinna för att återställa en låg temperatur. För större cellprover finns olika flödescellreaktorer med kylmantlar tillgängliga.
Protokoll för ultraljud beredning av E. coli lysater
Forskare använder Hielscher ultraljud homogenisatorer för E. coli cell störningar. Nedan hittar du olika testade och beprövade protokoll för E. coli-lys med Hielscher ultraljud homogenisatorer för olika E. coli-relaterade applikationer.
Celltillväxt, tvärbindning och beredning av E. coli cellextrakt med ultraljud
För SeqA och RNA-polymeras ChIP-chip E. coli MG1655 eller MG1655 ΔseqA odlades vid 37 ° c till en OD600 på cirka 0,15 i 50 ml LB (+ 0,2% glukos) före 27 μl formaldehyd (37%) medel tillfördes (slut koncentration 1%). Crosslinking utfördes vid långsam skakning (100 rpm) vid rums temperatur under 20 minuter följt av kylning med 10 ml 2,5 M glycin (slut koncentration 0,5 M). Vid värme chock experiment odlades E. coli MG1655 i 65 ml LB-medium vid 30 ° c till en OD600 på cirka 0,3. Därefter överfördes 30 ml kultur till en förvärmd kolv vid 43 °C och resten hölls vid 30 °C. Tvärbindning och kylning var som beskrivits ovan förutom att cellerna hölls vid 30 eller 43 ° C i 5 minuter innan ytterligare långsam skakning vid rumstemperatur. Cellerna samlades upp genom centrifugering och tvättades två gånger med kall TBS (pH7,5). Efter resuspension i 1 ml lysbuffert (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sackaros, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozym) och inkubation vid 37°C i 30 minuter följt av tillsats av 4 ml IP-buffert, var cellerna sonicated på is med 12 gånger 30 sek och 30 sek pauser med Hielscher ultraljud processor UP400St vid 100% effektinställning. Efter centrifugering i 10 minuter vid 9000 g förvarades 800 μl alicitat av supernatanten vid -20 °C. (Waldminghaus 2010)
Överproduktion och rening av enzymer med en ultraljudssond
För överproduktion av dekahistidin (His10)-märkta proteiner transformerades E. coli BL21 (DE3) med pET19b-konstruktioner. En förkultur över natten skördades genom centrifugering och 1% användes för att inokulera en uttryckskultur. Celler som bär pET19mgtB odlades vid 22 ° C tills en optisk densitet vid 600 nm (OD600) på 0,7. Kulturen överfördes till 17 °C och inducerades av 100 μM IPTG. Efter 16 timmar skördades kulturen genom centrifugering vid 7 500 × g vid 4 °C. Cellerna resuspenderades i 50 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,3 M NaCl vid pH 7,4 och stördes av ultraljud med en S2 mikrospets sonotrode vid Hielscher ultrasonicator UP200St vid en cykel av 0,5 och en amplitud av 75%.
Överproduktionen av decahistidinmärkt GtfC induceras vid 37 ° c vid en OD600 0,6 med 100 μM IPTG. Cellerna inkuberades sedan i 4 timmar, skördades och lyserades enligt ovan för MgtB.
Råcellsextrakt centrifugerades vid 15 000 × g och 4 ° C för att sedimentera cellskräpet. De klarade extrakten laddades på 1 ml HisTrap FF Crude-kolonner med hjälp av ett ÄKTAprime Plus-system. Enzymerna renades enligt tillverkarens protokoll för gradienteluering av His-märkta proteiner. Eluerade proteinlösningar dialyserades två gånger mot 1 000 volymer 50 mM PBS, pH 7,4, med 0,3 M NaCl vid 4 °C. Reningen analyserades med 12% SDS-PAGE. Koncentrationen av protein bestämdes med Bradford-metoden med användning av Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Ultraljud utvinning av protein från E. coli bakterier
Ett bete protein av intresse (i detta fall, MTV1 av Arabidopsis thaliana) är smält till en GST tagg och uttrycks i BL21 Escherichia coli (E. coli) celler.
- Ta en pellet GST-MTV1 och GST (motsvarande 50 ml bakteriekultur) och suspendera var och en i 2,5 ml iskall extraktionsbuffert.
- Använd en ultrasonicator UP100H (utrustad med MS3 microtip-sonotrode för små volymer på ca. 2-5mL) för att störa bakteriecellerna tills de lyseras, vilket indikeras av minskad opacitet och ökad viskositet. Detta måste utföras på is, och det rekommenderas att sonikera i intervaller (t.ex. 10 sek ultraljudsbehandling följt av 10 sek paus på is och så vidare). Försiktighet måste vidtas för att inte sonikera med för hög intensitet. Om skumning eller bildning av en vit fällning detekteras måste intensiteten sänkas.
- Överför den lyserade bakterielösningen till 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 4 °C, 16 000 x g i 20 minuter.
Sond-typ ultrasonicators som UP400St använda arbetsprincipen för akustisk kavitation för effektiv lys av E. coli.
Uttryck analys och rening av rekombinant protein med ultraljudsbehandling
E. coli-pelleten var sonicated med Hielscher ultrasonicator UP100H. För detta ändamål återsuspenderades cellpelleten i kyld lysbuffert (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) och kyldes på is i 10 minuter. Sedan, cell suspension sonicated med 10 korta skurar av 10 s följt av intervall av 30 s för kylning. Slutligen avlägsnades cellskräp genom ultracentrifugering vid 4 ° C i 15 minuter vid 14000 rpm. För bekräftelse av rPR-uttryck kördes supernatanten på 12% polyakrylamidgel och analyserades med SDS-PAGE och Western blotting. Rening av rPR gjordes med Ni2+-NTA-harts (Invitrogen, USA) enligt tillverkarhandboken. I detta skede användes inbyggd reningsmetod. Renheten hos det renade proteinet bedömdes med hjälp av elektrofores på 12% polyakrylamidgel och efterföljande Coomassie-blåfärgning. Renad proteinkoncentration mättes med Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
Ultraljud homogenisatorer för E. coli Lysis
Hielscher Ultrasonics designar, tillverkar och levererar högpresterande ultraljud homogenisatorer för tillförlitlig och effektiv lys av E. coli bakterier och andra celltyper, vävnader och cellkulturer.
Den breda portföljen av ultraljudssonder samt indirekta ultraljudsbehandlingssystem gör att vi kan erbjuda dig den perfekta ultraljudsvävnadshomogenisatorn för din cellstörning och extraktionsapplikation.
Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielscher ultrasonicators är kända för sin högsta kvalitet och design standarder. Smart programvara, intuitiv meny, programmerbara inställningar och automatisk dataprotokollering är bara några funktioner i Hielscher ultrasonicators. Robusthet och enkel drift möjliggör smidig integration av våra ultraljudsapparater i forsknings- och bioteknikanläggningar. Även grova förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultrasonicators med state-of-the-art teknik och användarvänlighet. Naturligtvis är Hielscher ultrasonicators CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.
Nedanstående tabell ger dig en indikation på hur mycket våra ultraljudsapparater kan hantera:
| batch Volym | Flödeshastighet | Rekommenderade Devices |
|---|---|---|
| multi-well / microtiter plattor | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn för injektionsflaskor eller bägare | n.a. | Ultraljud CupHorn |
| Ultraljud mikroflödesreaktor | n.a. | GDmini2 |
| upp till 10 injektionsflaskor med 0,5 till 1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 0.5 till 1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 1 till 500 ml | 10 till 200 ml / min | UP100H |
| 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1 till 20L | 0.2 till 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 till 100 liter | 2 till 10 1 / min | UIP4000 |
| n.a. | 10 till 100 l / min | UIP16000 |
| n.a. | större | kluster av UIP16000 |
Kontakta oss! / Fråga oss!
Ytterligare protokoll för ultraljud E. coli lys
Allicin-modifierade proteiner i E. coli med hjälp av en ultraljud injektionsflaska
Bestämning av sulfhydryl innehåll med 5,5 ′-ditiobis (2-nitrobensoesyra) (DTNB)-analys
En E. coli MG1655 över natten kultur användes för att inokulera MOPS minimalt medium (1:100). Kulturen odlades aerobt tills en A600 på 0,4 uppnåddes. Kulturen delades upp i tre 15 ml-kulturer för stressbehandling. En obehandlad kultur fungerade som en negativ kontroll. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) eller 1 mM diamid tillsattes till en av de återstående två kulturerna vardera. Odlingarna inkuberades i 15 minuter. 5 ml av varje kultur skördades genom centrifugering (8,525 × g, 4 °C, 10 min). Cellerna tvättades två gånger med 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, lagrades anaerobt före användning) och centrifugerades (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Cellerna återsuspenderades i lysbuffert (PBS med 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) före störning vid 4 ° C genom ultraljud (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Tyskland) (3 × 1 min). Cellskräp pelleterades genom centrifugering (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatanten överfördes till en 3,5 ml QS-makrokyvett (10 mm) med en magnetisk omrörningsstång och blandades med 1 ml lysbuffert. Extinktionen av proverna övervakades vid 412 nm med en Jasco V-650 spektrofotometer utrustad med PSC-718 temperaturkontrollerad cellhållare vid rumstemperatur. 100μl av en 3 mM dithiobis (2-nitrobensoesyra) lösning tillsattes. Utrotning övervakades tills den nådde mättnad. Beräkning av tiolkoncentrationen utfördes med användning av extinktionskoefficienten ε412 = 13 700 M-1 Cm-1 för tio-2-nitrobensoesyra (TNB). Cellulära tiolkoncentrationer beräknades baserat på en volym av E. coli-celler på 6,7 × 10-15 liter och en celldensitet på A600 = 0,5 (motsvarande 1 × 108 celler ml-1 och kultur). (Müller et al. 2016)
In vivo glutationbestämning med hjälp av en ultraljudscellkross
E. coli MG1655 odlades i MOPS minimala medium i en total volym på 200 ml tills en A600 på 0,5 uppnåddes. Kulturen delades upp i 50 ml-kulturer för stressbehandling. Efter 15 minuters inkubation med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimetylsulfoxid (kontroll) skördades cellerna vid 4 000 g vid 4 °C i 10 minuter. Cellerna tvättades två gånger med KPE-buffert före resuspension av pellets i 700 μl KPE-buffert. För deproteination, 300l av 10% (w/v) sulfosalicylsyra tillsattes före störning av celler genom ultraljud (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants samlades in efter centrifugering (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Sulfosalicylsyra koncentrationer minskade till 1% genom tillsats av 3 volymer KPE buffert. Mätningar av total glutation och GSSG utfördes enligt beskrivningen ovan. Cellulära glutathionkoncentrationer beräknades baserat på en volym av E. coli-celler av 6,7×10-15 liter och en celldensitet på A600 0,5 (motsvarande 1×108 celler ml-1 och kultur). GSH-koncentrationerna beräknades genom subtraktion av 2 [GSSG] från total glutation. (Müller et al. 2016)
Uttryck av humana mAspAT i E. coli med hjälp av en ultraljud homogenisator
Den enda koloni av E. coli BL21 (DE3) hyser uttrycket vektor i 30 mL Luria-Bertani (LB) medium som innehåller 100μg/mL ampicillin, och sedan odlas vid 37 º C tills den optiska densiteten (OD600) nådde 0,6. Cellerna skördades genom centrifugering vid 4 000 × g i 10 min och återsuspenderas i 3L färskt LB-medium innehåll ande 100μg/mL ampicillin.
Därefter inducerades proteinuttryck med 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) i 20 timmar vid 16ºC. Cellerna skördades genom centrifugering vid 8 000 × g i 15 minuter och tvättades med buffert A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Ca 45g (våtvikt) celler erhölls från 3 L kultur. Efter centrifugering återsuspenderades cellpelletsen i 40 ml (för 1 L kultur) iskall extraktionsbuffert A och lyserades genom ultraljud vid iskall temperatur med Hielscher ultraljudscellkross UP400St. Celllysen centrifugerades vid 12 000 rpm i 15 minuter för att separera lösliga (supernatant) och utfällda (pellets) fraktioner. (Jiang et al. 2015)
Fakta Värt att veta
E coli
Escherichia coli (E. coli) är en gramnegativ, fakultativt anaerob, stavformad, koliforma bakterie av släktet Escherichia som vanligt vis finns i nedre tarmen av varm blodiga organismer (endotherms). Det finns ett stort antal E. coli-stammar (eller subtyper) med olika egenskaper. De flesta E. coli-stammar är ofarliga för människor, t ex B-och K-12-stammar som används ofta för forsknings tillämpningar i laboratorier. Emellertid, vissa stammar är skadliga och kan orsaka allvarlig sjukdom.
E. coli spelar en viktig roll i modern biologisk ingenjörs konst och industriell mikrobiologi eftersom bakterierna är lätta att manipulera. Vanliga labb applikationer som ofta involverar användning av E. coli, t ex för att skapa rekombinant deoxyribonukleinsyra (DNA) eller för att fungera som modellorganism.
E. coli är en mycket mångsidig värd för produktion av heterologa proteiner, och mångfaldiga protein uttrycks system finns tillgängliga för framställning av rekombinanta proteiner i E. coli. Med hjälp av plasmider som tillåter hög halt uttryck av protein, kan gener införas i bakterierna, vilket gör det möjligt att producera sådana proteiner i stora mängder i industriella fermenterings processer.
E. coli används som cellfabriker för att producera insulin. Ytterligare tillämpningar inkluderar användning av modifierade E. coli-celler för att utveckla och producera vacciner och immobiliserade enzymer, för att producera biobränslen samt för bioremediering.
Stammen K-12 är en mutant form av E. coli som över-uttrycker enzymet alkaliska fosfataser (ALP). Denna mutation uppstår på grund av en defekt i genen som ständigt kodar för enzymet. Om en gen producerar en produkt utan någon hämning så kallas det konstitutiv aktivitet. Denna specifika muterade form används för isolering och rening av ALP-enzymet.
E. coli-bakterier används också ofta som cellfabriker. Konstruerade mikrober (t.ex. bakterier) och växtceller kan användas som så kallade cellfabriker. Dessa genetiskt modifierade celler producerar molekyler, kemikalier, polymerer, proteiner och andra ämnen, som används till exempel inom läkemedels-, livsmedels- och kemisk industri. För att frigöra de molekyler som produceras i insidan av sådana bioengineered celler, ultraljud lys är en vanlig metod för att störa cellväggarna och överföra målämnena till den omgivande vätskan. Läs mer om lysen av bioengineered celler!
Ultraljud-DNA Shearing
Ultraljud skjuvkrafter är en vanlig metod för att frigöra molekyler, organeller och proteiner från cellens inre samt att bryta DNA-strängar i bitar. Akustisk kavitation bryter cellväggarna och membranen för att extrahera DNA från celler och generera fragment på cirka 600 – 800 BP i längd, vilket är idealiskt för analys.
Klicka här för att läsa mer om ultraljud Homogenisatorer för DNA-fragmentering!
Litteratur / Referenser
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljud homogenisatorer från Labb till industriell storlek.