Ultraljudslys av E. coli
- E. coli-bakterier är de vanligaste bakterierna inom mikrobiologi och bioteknik.
- Ultraljudscellstörare ger tillförlitliga och reproducerbara resultat för lys av E. coli.
- Intensiva men ändå exakt kontrollerbara kavitations- och skjuvkrafter resulterar i fullständig störning och höga extraktionsutbyten (t.ex. proteiner, DNA).
Varför är ultraljudscellstörning av E. coli den föredragna metoden?
Ultraljudshomogenisatorer eller ultraljudsapparater av sondtyp erbjuder flera fördelar för E. coli-lys eftersom intensivt ultraljud effektivt stör cellväggar och membran. Ultraljudsapparater av sondtyp används i stor utsträckning för E. coli-lys på grund av följande skäl:
Proteinextraktion från E.coli-celler utförs effektivt med hjälp av ultraljudssond UP200St
Ultraljud av sondtyp erbjuder många fördelar för E. coli-lys. Den tillförlitliga och exakta kontrollen över ultraljudsprocessparametrar gör det möjligt att optimera driftsparametrarna såsom effekt, varaktighet och provhantering för att uppnå önskade resultat.
Elektroforetiska analyser av genomiskt DNA av E. coli EDL933 utsätts för 0 – 15 min ultraljud. L indikerar DNA-stegen.
(studie och bild: ©Basselet et al. 2008)
Cellstörning med hjälp av ultraljudskavitation
Homogenisatorer av ultraljudssondtyp arbetar med cirka 20 000 cykler per sekund (vid 20 kHz) och orsakar kavitation i vätskor eller suspensioner. Akustisk kavitation, mikroskopiska områden med vakuumliknande tryck och höga temperaturer som sliter isär celler. Även om temperaturen kan nå flera tusen grader Celsius är kavitationsvolymerna så små att de inte värmer upp processen nämnvärt. Ultraljudsgenererad akustisk kavitation och skjuvkrafter perforerar eller bryter cellmembranet hos bakterieceller som E.coli. Hielscher ultraljudsapparater möjliggör exakt kontroll över processparametrar såsom ultraljudsintensitet, amplitud, energitillförsel och temperatur. Därigenom kan ultraljudslysprocessen anpassas optimalt till celltypen, cellkulturen och processmålet.
- Exakt kontroll av lys (intensitet, amplitud, temperatur)
- Tillförlitliga, reproducerbara resultat
- Optimal anpassning till specifika prover
- Temperaturkontroll
- för mycket små till mycket stora prover (μL till liter)
- Rent mekanisk behandling
- Användarvänlig, säker drift
- Linjär uppskalning från labb till produktion
VialTweeter för ultraljudslys
Ultraljud Homogenisator vs andra Lysis Tekniker
Även om kemisk och enzymatisk lys kan vara problematisk – eftersom kemisk lys kan förändra proteinstrukturer och introducera reningsproblem och enzymatisk lys kräver långa inkubationstider och är inte reproducerbar – Ultraljudsstörning är en sofistikerad, snabb cellstörningsmetod.
Ultraljudslys baseras endast på mekaniska krafter. Inga kemikalier tillsätts, ultraljudsbehandling bryter cellväggen genom skjuvkrafter. Kemisk lys kan förändra proteinstrukturen och introducera reningsproblem. Enzymatiska störningar kräver långa inkubationstider och är inte reproducerbara. Ultraljudscellstörning av E.coli bakterieceller är snabb, enkel, pålitlig och reproducerbar. Det är därför Hielscher ultraljudsapparater används i biologiska och biokemiska laboratorier runt om i världen för provberedning, pre-ananlytika, in vitro diagonstiker och mångfaldiga analyser.
Allmänna rekommendationer för ultraljudslys
Ultraljudsbehandling är den mest populära tekniken för att lysera mycket små, medelstora och stora mängder cellsuspensioner – från pico-liter upp till 100L/h (med hjälp av en ultraljudsflödescell). Cellerna lyseras genom vätskeskjuvning och kavitation. DNA skjuvs också under ultraljudsbehandling, så det är inte nödvändigt att lägga till DNas till cellsuspensionen.
Temperaturkontroll under ultraljud E.coli-lys
Genom att förkyla provet och hålla provet under ultraljudsbehandling på is, kan provets termiska nedbrytning av provet enkelt förhindras.
Helst bör proverna hållas iskalla under lyseringen, men för de flesta prover är det tillräckligt om temperaturen inte stiger över temperaturen för odlingen eller vävnadskällan. Därför rekommenderas det, att hålla suspensionen på is och att sonikera med flera korta ultraljudspulser på 5-10 sek och pauser på 10-30 sek. Under pauserna kan värmen försvinna för att återupprätta en låg temperatur. För större cellprover finns olika flödescellsreaktorer med kylmantel.
Här kan du läsa detaljerade tips och rekommendationer för en lyckad ultraljudsanalys!
Protokoll för ultraljudsberedning av E. coli-lysat
Forskare använder Hielscher ultraljudshomogenisatorer för att störa E.coli-celler. Nedan hittar du olika testade och beprövade protokoll för E.coli-lys med hjälp av Hielscher ultraljudshomogenisatorer för olika E. coli-relaterade applikationer.
Celltillväxt, tvärbindning och beredning av E. coli cellextrakt med hjälp av ultraljud
För SeqA och RNA-polymeras ChIP-Chip E. coli odlades MG1655 eller MG1655 ΔseqA vid 37 °C till en OD600 på cirka 0,15 i 50 ml LB (+ 0,2 % glukos) innan 27 μl formaldehyd (37 %) per ml medium tillsattes (slutlig koncentration 1 %). Tvärbindning utfördes vid långsam skakning (100 rpm) vid rumstemperatur i 20 minuter följt av kylning med 10 ml 2,5 M glycin (slutlig koncentration 0,5 M). För värmechockexperiment odlades E. coli MG1655 i 65 ml LB-medium vid 30 °C till en OD600 på cirka 0,3. Därefter överfördes 30 ml kultur till en förvärmd kolv vid 43 °C och återstoden förvarades vid 30 °C. Tvärbindning och kylning var som beskrivits ovan förutom att cellerna hölls vid 30 eller 43 °C i 5 minuter innan ytterligare långsam skakning vid rumstemperatur. Cellerna samlades in genom centrifugering och tvättades två gånger med kall TBS (pH 7,5). Efter resuspension i 1 ml lysbuffert (10 mM Tris (pH 8,0), 20 % sackaros, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozym) och inkubation vid 37 °C i 30 minuter följt av tillsats av 4 ml IP-buffert, sonikerades cellerna på is med 12 gånger 30 sek och 30 sek pauser med hjälp av Hielscher ultraljudsprocessor UP400St vid 100% effektinställning. Efter centrifugering i 10 minuter vid 9000 g förvarades 800 μl alicitater av supernatanten vid -20 °C. (Waldminghaus 2010)
Överproduktion och rening av enzymer med en ultraljudssond
För överproduktion av dekahistidin (His10)-märkta proteiner transformerades E. coli BL21(DE3) med pET19b-konstruktioner. En förkultur över natten skördades genom centrifugering, och 1 % användes för att inokulera en expressionskultur. Celler som bär pET19mgtB odlades vid 22°C tills en optisk densitet vid 600 nm (OD600) var 0,7. Kulturen överfördes till 17 °C och inducerades med 100 μM IPTG. Efter 16 timmar skördades kulturen genom centrifugering vid 7 500 × g vid 4 °C. Celler resuspenderades i 50 mM fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med 0,3 M NaCl vid pH 7,4 och störs av ultraljud med en S2 mikrospets sonotrode vid Hielscher ultraljudsapparat UP200St vid en cykel av 0,5 och en amplitud av 75%.
Överproduktionen av dekahistidinmärkt GtfC inducerades vid 37 °C vid en OD600 på 0,6 med 100 μM IPTG. Cellerna inkuberades sedan i 4 timmar, skördades och lyserades enligt ovan för MgtB.
Råa cellextrakt centrifugerades vid 15 000 × g och 4 °C för att sedimentera cellresterna. De klarnade extrakten laddades på 1 ml HisTrap FF Crude-kolonner med hjälp av ett ÄKTAprime Plus-system. Enzymerna renades enligt tillverkarens protokoll för gradienteluering av His-märkta proteiner. Eluerade proteinlösningar dialyserades två gånger mot 1 000 volymer av 50 mM PBS, pH 7,4, med 0,3 M NaCl vid 4°C. Reningen analyserades med 12% SDS-PAGE. Koncentrationen av protein bestämdes med Bradford-metoden med hjälp av Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Ultraljud extraktion av protein från E. coli bakterier
Ett betesprotein av intresse (i detta fall MTV1 av Arabidopsis thaliana) smälts samman med en GST-tagg och uttrycks i BL21 Escherichia coli (E. coli) celler.
- Ta en pellet GST-MTV1 och GST (motsvarande 50 ml bakteriekultur) och återsuspendera var och en i 2,5 ml iskall extraktionsbuffert.
- Använd en ultraljudsapparat UP100H (utrustad med MS3 microtip-sonotrode för små volymer på ca 2-5 ml) för att störa bakteriecellerna tills de lyseras, vilket indikeras av minskad opacitet och ökad viskositet. Detta måste utföras på is, och det rekommenderas att ultraljudsbehandla i intervaller (t.ex. 10 sek ultraljudsbehandling följt av 10 sek paus på is och så vidare). Försiktighet måste iakttas för att inte sonikera med för hög intensitet. Om skumning eller bildning av en vit fällning upptäcks måste intensiteten sänkas.
- Överför den lyserade bakterielösningen till 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 4 °C, 16 000 x g i 20 minuter.
Ultraljudsapparater av sondtyp som UP400St använda arbetsprincipen för akustisk kavitation för effektiv lys av E.coli.
Uttrycksanalys och rening av rekombinant protein med hjälp av ultraljudsbehandling
E. coli-pelleten sonikerades med Hielscher ultraljudsapparat UP100H. För detta ändamål återsuspenderades cellpellet i en kyld lysbuffert (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) och kyldes på is i 10 minuter. Sedan sonikerades cellsuspensionen med 10 korta skurar på 10 s följt av ett intervall på 30 s för kylning. Slutligen avlägsnades cellrester genom ultracentrifugering vid 4°C i 15 minuter vid 14000 rpm. För att bekräfta rPR-uttrycket kördes supernatanten på 12% polyakrylamidgel och analyserades med SDS-PAGE och Western blotting. Rening av rPR gjordes med hjälp av Ni2+-NTA-harts (Invitrogen, USA) enligt tillverkarens guide. I detta skede användes en naturlig reningsmetod. Renheten hos det renade proteinet bedömdes med hjälp av elektrofores på 12 % polyakrylamidgel och efterföljande Coomassie blue-färgning. Renad proteinkoncentration mättes med Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
Ultraljudshomogenisatorer för E. coli-lys
Hielscher Ultrasonics designar, tillverkar och levererar högpresterande ultraljudshomogenisatorer för tillförlitlig och effektiv lys av E. coli-bakterier och andra celltyper, vävnader och cellkulturer.
Den breda portföljen av ultraljudssonder samt indirekta ultraljudsbehandlingssystem gör att vi kan erbjuda dig den perfekta ultraljudsvävnadshomogenisatorn för din cellstörning och extraktionsapplikation.
Design, tillverkning och rådgivning – Kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Smart programvara, intuitiv meny, programmerbara inställningar och automatisk dataprotokollering är bara några funktioner i Hielscher ultraljudsapparater. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i forsknings- och biotekniska anläggningar. Även tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultraljudsapparater.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater:
| Batchvolym | Flöde | Rekommenderade enheter |
|---|---|---|
| Multi-brunnar / mikrotiterplattor | N.A. | UIP400MTP |
| CupHorn för ampuller eller bägare | N.A. | Ultraljud CupHorn |
| ultraljud mikroflödesreaktor | N.A. | GDmini2 |
| upp till 10 injektionsflaskor med 0,5 till 1,5 ml | N.A. | VialTweeter |
| 0.5 till 1,5 ml | N.A. | VialTweeter |
| 1 till 500 ml | 10 till 200 ml/min | UP100H |
| 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 till 20L | 0.2 till 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 till 100L | 2 till 10L/min | UIP4000 |
| N.A. | 10 till 100 L/min | UIP16000 |
| N.A. | Större | kluster av UIP16000 |
Kontakta oss! / Fråga oss!
Ytterligare protokoll för ultraljud E. coli lys
Allicinmodifierade proteiner i E. coli med hjälp av en ultraljudsvialTweeter
Bestämning av sulfhydrylhalter med 5,5′-ditiobis(2-nitrobensoesyra) (DTNB) analys
En E. coli MG1655 odling över natten användes för att inokulera MOPS minimalt medium (1:100). Kulturen odlades aerobt tills en A600 på 0,4 uppnåddes. Odlingen delades upp i tre 15 ml kulturer för stressbehandling. En obehandlad kultur fungerade som en negativ kontroll. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) eller 1 mM diamid tillsattes till en av de återstående två kulturerna vardera. Kulturerna inkuberades i 15 minuter. 5 ml av varje kultur skördades genom centrifugering (8 525 × g, 4 °C, 10 min). Cellerna tvättades två gånger med 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, förvarades anaerobt före användning) och centrifugerades (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Cellerna återsuspenderades i lysbuffert (PBS med 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) före störning vid 4 °C genom ultraljud (VialTweeter ultraljudsapparat, Hielscher GmbH, Tyskland) (3 × 1 min). Cellskräp pelleterades genom centrifugering (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatanten överfördes till en 3,5 ml QS-makrokyvett (10 mm) med en magnetisk omrörare och blandades med 1 ml lyseringsbuffert. Utsläckningen av proverna övervakades vid 412 nm med en Jasco V-650 spektrofotometer utrustad med PSC-718 temperaturkontrollerad cellhållare vid rumstemperatur. 100 μl av en 3 mM ditiobis(2-nitrobensoesyra) lösning tillsattes. Utdöendet övervakades tills det nådde mättnad. Beräkning av tiolkoncentrationen utfördes med hjälp av extinktionskoefficienten ε412 = 13,700 M-1 centimeter-1 för tio-2-nitrobensoesyra (TNB). Cellulära tiolkoncentrationer beräknades baserat på en volym av E. coli-celler på 6,7 × 10-15 liter och en celldensitet på A600 = 0,5 (motsvarande 1 × 108 celler ml-1 kultur). (Müller et al. 2016)
In vivo glutationbestämning med hjälp av en ultraljudscellkross
E.coli MG1655 odlades i MOPS minimalmedium i en total volym på 200ml tills ett A600-värde på 0,5 uppnåddes. Kulturen delades upp i 50 ml kulturer för stressbehandling. Efter 15 minuters inkubation med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimetylsulfoxid (kontroll) skördades cellerna vid 4 000 g vid 4 °C i 10 minuter. Cellerna tvättades två gånger med KPE-buffert innan pellets i 700 μl KPE-buffert blandades igen. För deproteinering tillsattes 300l 10% (w/v) sulfosalicylsyra före störning av celler genom ultraljud (3 x 1 min; VialTweeter ultraljud). Supernatanterna samlades in efter centrifugering (30 min, 13 000 g, 4 °C). Koncentrationerna av sulfosalicylsyra sänktes till 1 % genom tillsats av 3 volymer KPE-buffert. Mätningar av total glutation och GSSG utfördes enligt beskrivningen ovan. Cellulära glutationkoncentrationer beräknades baserat på en volym av E. coli-celler på 6,7×10-15 liter och en celldensitet på A600 0,5 (motsvarande 1×108 celler ml-1 kultur). GSH-koncentrationerna beräknades genom subtraktion av 2[GSSG] från total glutation. (Müller et al. 2016)
Uttryck av human mAspAT i E. coli med hjälp av en ultraljudshomogenisator
Den enda koloni av E. coli BL21 (DE3) som hyser expressionsvektorn i 30 ml Luria-Bertani (LB) medium innehållande 100 μg/ml ampicillin, och som sedan odlas vid 37 °C tills den optiska densiteten (OD600) nådde 0,6. Cellerna skördades genom centrifugering vid 4 000 × g i 10 minuter och återsuspenderades i 3L färskt LB-medium innehållande 100 μg/ml ampicillin.
Därefter inducerades proteinuttrycket med 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) under 20 timmar vid 16ºC. Cellerna skördades genom centrifugering vid 8 000 × g i 15 minuter och tvättades med buffert A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Approximativa 45g (våtvikt) celler erhölls från 3 L odling. Efter centrifugering återsuspenderades cellpelletsen i 40 ml (för 1 L odling) iskall extraktionsbuffert A och lyserades genom ultraljud vid iskall temperatur med hjälp av Hielscher ultraljudscellkross UP400St. Celllysen centrifugerades vid 12 000 rpm i 15 minuter för att separera lösliga (supernatant) och utfällda (pellet) fraktioner. (Jiang et al. 2015)
Fakta som är värda att veta
E.coli
Escherichia coli (E. coli) är en gramnegativ, fakultativt anaerob, stavformad, koliform bakterie av släktet Escherichia som vanligtvis finns i nedre tarmen hos varmblodiga organismer (endotermer). Det finns ett stort antal E. coli-stammar (eller undertyper) med olika egenskaper. De flesta E. coli-stammar är ofarliga för människor, t.ex. B- och K-12-stammar som ofta används för forskningstillämpningar i laboratorier. Vissa stammar är dock skadliga och kan orsaka allvarlig sjukdom.
E. coli spelar en viktig roll inom modern bioteknik och industriell mikrobiologi eftersom bakterien är lätt att manipulera. Vanliga laboratorietillämpningar som ofta involverar användning av E. coli, t.ex. för att skapa rekombinant deoxiribonukleinsyra (DNA) eller för att fungera som en modellorganism.
E. coli är en mycket mångsidig värd för produktion av heterologa proteiner, och många proteinuttryckssystem finns tillgängliga för att producera rekombinanta proteiner i E. coli. Med hjälp av plasmider som tillåter höggradigt uttryck av protein kan gener föras in i bakterierna, vilket gör det möjligt att producera sådana proteiner i stora mängder i industriella fermenteringsprocesser.
E.coli används som cellfabriker för att producera insulin. Andra tillämpningar inkluderar användningen av modifierade E. coli-celler för att utveckla och producera vacciner och immobiliserade enzymer, för att producera biobränslen samt för bioremediering.
Stammen K-12 är en muterad form av E. coli som överuttrycker enzymet alkaliskt fosfatas (ALP). Denna mutation uppstår på grund av en defekt i genen som ständigt kodar för enzymet. Om en gen producerar en produkt utan någon hämning kallas detta för konstitutiv aktivitet. Denna specifika mutantform används för att isolera och rena ALP-enzymet.
E. coli-bakterier används också i stor utsträckning som cellfabriker. Konstruerade mikrober (t.ex. bakterier) och växtceller kan användas som så kallade cellfabriker. Dessa genetiskt modifierade celler producerar molekyler, kemikalier, polymerer, proteiner och andra ämnen, som används till exempel inom läkemedels-, livsmedels- och kemisk industri. För att frigöra de molekyler som produceras i det inre av sådana biokonstruerade celler är ultraljudslys en vanlig metod för att störa cellväggarna och för att överföra målämnena till den omgivande vätskan. Läs mer om hur man använder sig av biokonstruerade celler!
Ultraljud DNA-klippning
Ultraljudsskjuvkrafter är en vanlig metod för att frigöra molekyler, organeller och proteiner från cellens inre samt för att bryta DNA-strängar i bitar. Akustisk kavitation bryter sönder cellväggar och membran för att extrahera DNA från celler och generera fragment av cirka 600 – 800 bp i längd, vilket är idealiskt för analys.
Klicka här för att lära dig mer om ultraljudshomogenisatorer för DNA-fragmentering!
Litteratur / Referenser
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics tillverkar högpresterande ultraljudshomogenisatorer från labb till industriell storlek.