Hielscher ultraljud teknik

Ultraljuds Lys av E. Coli

  • E. coli-bakterier är de vanligaste bakterierna inom mikrobiologi och bio teknik.
  • Ultraljud cell ämnen ger tillförlitliga och reproducerbara resultat för lys av E. coli.
  • Intensiva men exakt kontrollerbara kavitation och skjuvning krafter resultera i fullständig störning och hög utvinning avkastning (t. ex. proteiner, DNA).

Cell störningar av kavitation

Escherichia coli bakterier är tillförlitligt lyserat med ultraljud vävnad Homogenisatorer.Ultraljud sond-typ Homogenisatorer fungerar med ca. 20 000 cykler per sekund (vid 20kHz) och orsaka kavitation i vätskor eller supsensions. Akustisk kavitation mikroskopiska områden av vakuum-liknande tryck och höga temperaturer att riva cellerna isär. Även om temperaturen kan nå flera tusen grader Celsius, kavitation volymer är så små att de inte värmer processen avsevärt. Ultraljud genererade akustiska kavitation och skjuvning styrkor perforera eller bryta cell membranet hos E. coli – beroende på enhetens inställning av ultraljud Homogenisatorer.

Fördelar med ultraljud Lys

  • noggrann kontroll av Lys (intensitet, amplitud, temperatur)
  • optimal anpassning till specifika prover
  • temperaturkontroll
  • för mycket små till mycket stora prover (μL till liter)
  • ren mekanisk behandling
  • linjär skala upp från labb till produktion
Ultraljud enheten VialTweeter möjliggör samtidig prov beredning av upp till 10 flaskor under samma process förhållanden. (Klicka för att förstora!)

VialTweeter för ultraljud Lys

Informationsförfrågan




Notera vår Integritetspolicy.


Även om kemisk och enzymtisk Lys kan vara problematiskt – eftersom kemisk Lys kan förändra protein strukturer och införa renings problem och enzymatisk Lys kräver långa inkubations tider och inte är reproducerbara – ultraljud störningar är en sofistikerad, snabb cell störning metod.
Ultraljudslys är baserad på mekaniska krafter bara. Inga kemikalier tillsätts, ultraljudsbehandling bryter cellväggen genom skjuvkrafter. Kemisk lys kan förändra proteinstruktur och införa reningsproblem. Enzymatiska störningar kräver långa inkubationstider och är inte reproducerbara. Ultraljud cell störningar av E.coli bakterier celler är snabb, enkel, tillförlitlig och reproducerbar. Det är därför Hielscher ultrasonicators används i biologiska och biokemiska laboratorier runt om i världen för provberedning, pre-ananlytics, in vitro diagonstics och grenrörsanalyser.

Allmänna rekommendationer

UP400St ultrasonicator med flödes reaktorUltraljudsbehandling är den mest populära tekniken för lyseringslösning mycket små, medium och stora mängder av cell SUS pensioner – från Pico-liter upp till 100L/HR (med hjälp av en ultraljud flöde cell). Cellerna lyseras av vätskeskjuvning och kavitation. DNA är också klippt under ultraljudsbehandling, så det är inte nödvändigt att lägga DNase till cell SUS pensionen.
Temperatur kontroll:
Genom Pre-kylning provet och hålla provet under ultraljudsbehandling på isen, prov termisk nedbrytning av provet kan lätt förhindras.
Helst bör proverna hållas iskalla under Lys, men för de flesta prover är det tillräckligt om temperaturen inte stiger över temperaturen i kulturen eller vävnads källa. Därför rekommenderas, att hålla SUS pensionen på isen och att Sonikera med flera korta Ultrasonics pulser av 5-10 SEK och pauser på 10-30 sek. Under pauserna kan värmen försvinna för att återupprätta en låg temperatur. För större cell prov finns olika flödes cells reaktorer med kyl mantel.

Protokoll för beredning av E. coli Lysates

Uttrycks analys och rening av rekombinant protein

E. coli pelleten var sonicated med ett ultraljud system UP100H (Hielscher). För detta ändamål återsuspenderas cellpellet i kylningsbuffert (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) och kyls på is i 10 min. Sedan, cell SUS pension var sonicated med 10 korta skurar av 10 s följt av intervall på 30 s för kylning. Slutligen avlägsnades cell skräp av ultracentrifugering vid 4 ° c i 15 min vid 14000 RPM. För bekräftelse av rPR uttryck, supernatanten kördes på 12% polyakrylamid gel och analyseras av SDS-PAGE och Western blotting. Rening av rPR gjordes med hjälp av ni2 eller högre-NTA-harts (Invitrogen, USA) enligt tillverkarens anvisningar. I detta skede användes inhemsk renings metod. Renat proteiners renhet bedömdes med hjälp av elektrofores på 12-procentig polyakrylamidgel och efterföljande Coomassie-Blåfärgning. Renat protein koncentrationen mättes genom Micro BCA protein assay Kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultraljud cellstörande UP100H (100W) för Lys, cell störningar och DNA klippning.

Ultraljud Homogenisatorer UP100H 100W

Cell tillväxt, crosslinking och beredning av E. coli cell extrakt

För SeqA och RNA-polymeras ChIP-chip E. coli MG1655 eller MG1655 ΔseqA odlades vid 37 ° c till en OD600 på cirka 0,15 i 50 ml LB (+ 0,2% glukos) före 27 μl formaldehyd (37%) medel tillfördes (slut koncentration 1%). Crosslinking utfördes vid långsam skakning (100 rpm) vid rums temperatur under 20 minuter följt av kylning med 10 ml 2,5 M glycin (slut koncentration 0,5 M). Vid värme chock experiment odlades E. coli MG1655 i 65 ml LB-medium vid 30 ° c till en OD600 på cirka 0,3. Därefter överfördes 30 ml av kulturen till en förvärmd kolv vid 43 ° c och återstoden hölls vid 30 ° c. Tvär bindning och kylning var som beskrivits ovan, förutom att cellerna förvarades vid 30 eller 43 ° c i 5 minuter innan ytterligare långsam skakning vid rums temperatur. Cellerna samlades in genom centrifugering och tvättades två gånger med kall TBS (pH 7.5). Efter resuspension i 1 ml lyseringsbuffert (10 mM tris (pH 8,0), 20% sackaros, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozym) och inkubation vid 37 ° c i 30 minuter följt av tillsats av 4 ml IP-buffert, celler var sonicated på isen med 12 gånger 30 SEK och 30 SEK raster vid En UP400St ultraljud processor (Hielscher Ultrasonics GmbH) med 100% makt. Efter centrifugering under 10 min vid 9000 g, lagrades 800 μl av supernatanten vid-20 ° c. (Waldminghaus 2010)

Överproduktion och rening av enzymer.

För överproduktion av decahistidin (His10)-märkta proteiner, E. coli BL21 (DE3) förvandlades med pET19b konstruktioner. En förodling över natten skördades genom centrifugering, och 1% användes för att Inokulera en uttrycks kultur. Celler redovisade pET19mgtB odlades vid 22 ° c tills en optisk densitet vid 600 Nm (OD600) på 0,7. Kulturen överfördes till 17 ° c och inducerade av 100 μM IPTG. Efter 16 timmar skördades kulturen genom centrifugering vid 7 500 × g vid 4 ° c. Cellerna återsuspenderas i 50 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,3 M NaCl vid pH 7,4 och störs av ultraljud med en S2 mikro-tip sonotrode vid UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Tyskland) vid en cykel av 0,5 och en amplitud på 75%.
Överproduktionen av decahistidinmärkt GtfC induceras vid 37 ° c vid en OD600 0,6 med 100 μM IPTG. Cellerna inkuberades sedan i 4 timmar, skördades och lyserades enligt ovan för MgtB.
Rå cell extrakt centrifugerades vid 15 000 × g och 4 ° c för att sedimentera cell avfallet. De klargj橬一j extrakten laddades på 1 ml HisTrap FF rå kolonner med ett ÄKTAprime plus system (GE Healthcare). Enzymerna renades enligt tillverkarens protokoll för gradient eluering av hans-märkta proteiner. Eluerade protein lösningar dialyserades två gånger mot 1 000 volymer av 50 mM PBS, pH 7,4, med 0,3 M NaCl vid 4 ° c. Reningen analyserades med 12% SDS-PAGE. Koncentrationen av protein bestämdes av Bradford-metoden med Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Tyskland). (Rabausch et al. 2013)

Utvinning av protein från E. coli bakterier
Ett bete protein av intresse (i detta fall, MTV1 av Arabidopsis thaliana) är smält till en GST tagg och uttrycks i BL21 Escherichia coli (E. coli) celler.
1. ta en pellet av GST-MTV1 och GST (motsvarande 50 ml bakterie odling) och resuspendera varje i 2,5 mL Ice Cold extraktion buffert.
2. Använd en ultrasonicator UP100H (utrustad med MS3 microtip-sonotrode för små volymer (2-5mL)) för att störa bakterie cellerna tills de är lysed, vilket indikeras av minskad opacitet och ökad viskositet. Detta måste utföras på isen, och det rekommenderas att Sonikera i intervaller (t. ex. 10 SEK son ICA ting följt av 10 SEK på is och så vidare). Försiktighet måste iakttas att inte Sonikera med för hög intensitet. Om skum bildning eller bildandet av en vit fällning upptäcks, måste intensiteten sänkas.
3. överför den lyserade bakterie lösningen till 1,5 mL mikrocentrifugrör och centrifugera vid 4 ° c, 16 000 x g i 20 min.

Allicin-modifierade proteiner i E. coli

Den VialTweeter är en bekväm ultrasonicator för små prov homogeniseringBestämning av sulfhydryl innehåll med 5,5 ′-ditiobis (2-nitrobensoesyra) (DTNB)-analys
En E. coli MG1655 över natten kultur användes för att vaccinera MOPS minimal medium (1:100). Kulturen odlades aerobt tills en A600 av 0,4 uppnåddes. Kulturen delades upp i 3 15-ml-kulturer för stress behandling. En obehandlad kultur fungerade som en negativ kontroll. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) eller 1 mM diamid lades till en av de återstående två kulturerna vardera. Kulturer inkuberades i 15 min. 5 ml av varje kultur skördades genom centrifugering (8 525 × g, 4 ° c, 10 min). Cellerna tvättades två gånger med 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, lagrad anaerobt före användning) och centrifugeras (13 000 × g, 4 ° c, 10 min). Cellerna återsuspenderas i lyseringsbuffert (PBS med 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) före avbrott vid 4 ° c av ultraljud (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Tyskland) (3 × 1 min). Cell skräp pelleterades genom centrifugering (13 000 × g, 4 ° c, 15 min). Supernatanten överfördes till en 3,5-ml QS-Macro-kyvetten (10 mm) med en magnetisk rör stång och blandades med 1 ml lyseringsbuffert. Utslockningen av proverna övervakades vid 412 Nm med en JASCO V-650 spektrofotometer utrustad med den temperaturkontrollerade cell hållaren PSC-718 (JASCO) vid rums temperatur. 100 μl av en 3 mM ditiobis (2-nitrobensoesyra) lösning har tillsatts. Utrotning övervakades tills den nådde mättnad. Beräkningen av tiolkoncentrationen utfördes med hjälp av utdöningskoefficienten ε412 = 13 700 M-1 Cm-1 för tio-2-nitrobensoesyra (TNB). Cellulära tiolkoncentrationer beräknades baserat på en volym av E. coli-celler på 6,7 × 10-15 liter och en cell täthet av A600 = 0,5 (motsvarar 1 × 108 celler ml-1 och kultur). (Müller et al. 2016)

In vivo Glutathione bestämning

E. coli MG1655 odlades i det minimala mediet MOPS i en total volym på 200ml tills en A600 av 0,5 uppnåddes. Kulturen delades upp i 50-ml-kulturer för stress behandling. Efter 15 minuters inkubation med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimetylsulfoxid (kontroll) skördades cellerna vid 4 000 g vid 4 ° c i 10 min. cellerna tvättades två gånger med KPE-buffert före återsuspension av pellets i 700 μl KPE-buffert. För deproteination, 300l av 10% (w/v) sulfosalicylsyra lades före störningar av celler av ultraljud (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants samlades in efter centrifugering (30 min, 13, 000g, 4 ° c). Sulfosalicylsyra koncentrationer minskade till 1% genom tillsats av 3 volymer KPE buffert. Mätningar av total glutation och GSSG utfördes enligt beskrivningen ovan. Cellulära glutathionkoncentrationer beräknades baserat på en volym av E. coli-celler av 6,7×10-15 liter och en cell täthet av A600 05. (motsvarar 1×108 celler ml-1 och kultur). GSH-koncentrationerna beräknades genom subtraktion av 2 [GSSG] från total glutation. (Müller et al. 2016)

Ultraljud störande för cell lys och utvinning av biologiskt material (Klicka för att förstora!)

Sond-typ ultrasonicator UP400St

Uttryck för humant mAspAT i E. coli

Ultraljud cellstörande UP400St (400W) för extraktion av intracellulär materia (t. ex. proteiner, organeller, DNA, RNA etc.)Den enda koloni av E. coli BL21 (DE3) hyser uttrycket vektor i 30 mL Luria-Bertani (LB) medium som innehåller 100μg/mL ampicillin, och sedan odlas vid 37 º C tills den optiska densiteten (OD600) nådde 0,6. Cellerna skördades genom centrifugering vid 4 000 × g i 10 min och återsuspenderas i 3L färskt LB-medium innehåll ande 100μg/mL ampicillin.
Därefter induceras protein uttryck med 1 mM isopropylβ-ᴅ -1-tiogalaktopyranosid (IPTG) för 20 h vid 16 º C. Cellerna skördades genom centrifugering vid 8 000 × g i 15 min och tvättades med buffert A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Approximerade 45g (våt vikt) celler erhölls från 3 L kultur. Efter centrifugering återsuspenderas cell pellets i 40 ml (för 1 L kultur) Ice-Cold extraktion buffert A, och lyserat av ultraljud vid iskalla temperaturer med hjälp av en UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Tyskland). Celllysis centrifugerades vid 12 000 rpm under 15 minuter för att separera lösliga (supernatant) och fällda fraktioner (pellet). (Jiang et al. 2015)

Nedanstående tabell ger dig en indikation på hur mycket våra ultraljudsapparater kan hantera:

batch Volym Flödeshastighet Rekommenderade Devices
0.5 till 1,5 ml n.a. VialTweeter
1 till 500 ml 10 till 200 ml / min UP100H
10 till 2000 ml 20 till 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 till 20L 0.2 till 4L / min UIP2000hdT
10 till 100 liter 2 till 10 1 / min UIP4000
n.a. 10 till 100 l / min UIP16000
n.a. större kluster av UIP16000

Kontakta oss! / Fråga oss!

Använd formuläret nedan om du vill begära ytterligare information om ultraljud homogenisering. Vi ska vara glada att kunna erbjuda dig ett ultraljud system som uppfyller dina krav.









Observera att våra Integritetspolicy.


Litteratur / Referenser



Fakta Värt att veta

E coli

Escherichia coli (E. coli) är en gramnegativ, fakultativt anaerob, stavformad, koliforma bakterie av släktet Escherichia som vanligt vis finns i nedre tarmen av varm blodiga organismer (endotherms). Det finns ett stort antal E. coli-stammar (eller subtyper) med olika egenskaper. De flesta E. coli-stammar är ofarliga för människor, t ex B-och K-12-stammar som används ofta för forsknings tillämpningar i laboratorier. Emellertid, vissa stammar är skadliga och kan orsaka allvarlig sjukdom.
E. coli spelar en viktig roll i modern biologisk ingenjörs konst och industriell mikrobiologi eftersom bakterierna är lätta att manipulera. Vanliga labb applikationer som ofta involverar användning av E. coli, t ex för att skapa rekombinant deoxyribonukleinsyra (DNA) eller för att fungera som modellorganism.
E. coli är en mycket mångsidig värd för produktion av heterologa proteiner, och mångfaldiga protein uttrycks system finns tillgängliga för framställning av rekombinanta proteiner i E. coli. Med hjälp av plasmider som tillåter hög halt uttryck av protein, kan gener införas i bakterierna, vilket gör det möjligt att producera sådana proteiner i stora mängder i industriella fermenterings processer.
E. coli används som en cell fabriker för att producera insulin. Ytterligare tillämpningar inkluderar användning av modifierade E. coli-celler för att utveckla och producera vacciner och immobiliserade enzymer, för att framställa biodrivmedel, samt för bioremediering.
Stammen K-12 är en mutant form av E. coli som över-uttrycker enzymet alkaliska fosfataser (ALP). Denna mutation uppstår på grund av en defekt i genen som ständigt kodar för enzymet. Om en gen producerar en produkt utan någon hämning så kallas det konstitutiv aktivitet. Denna specifika muterade form används för isolering och rening av ALP-enzymet.

Ultraljud-DNA Shearing

Ultraljud skjuvning krafter är en vanligt förekommande metod för att separera från cellen och bryta DNA-strängar i bitar. Akustisk kavitation bryter cell väggar och membran för att extrahera DNA från celler och generera fragment av ca 600 – 800 BP i längd, vilket är idealiskt för analys.
Klicka här för att läsa mer om ultraljud Homogenisatorer för DNA-fragmentering!