Ultraljudslys av Drosophila melanogaster prover

Drosophila melanogaster används ofta i laboratorier som modellorganism. Därför måste preanalytiska preparationssteg såsom lysering, cellstörning, proteinextraktion och DNA-skjuvning av Drosophila melanogaster-prover utföras ofta. Ultraljudsdismembratorer är pålitliga och effektiva och kan användas för att utföra olika uppgifter såsom lys, proteinextraktion eller DNA-fragmentering på ett enkelt sätt genom att endast justera ultraljudsprocessparametrar. Ultraljudshomogenisatorer är därmed flexibla verktyg med ett brett användningsområde.

Ultraljud lys och proteinextraktion

Lys, cellsolubilisering, vävnadshomogenisering och proteinextraktion är typiska uppgifter för ultraljudsdismembratorer i biologiska laboratorier. Ultraljudsdesmembratorer och cellstörande ämnen är väl lämpade för att homogenisera djurvävnader, insekter (t.ex. Drosophila melanogaster, C. elegans) eller växtprover. Efterföljande tillämpningar av ultraljud är lysering av cellsuspensioner och pellets samt extraktion av intracellulära proteiner.
Ultraljudslys och proteinextraktion är mycket tillförlitliga och reproducerbara processer, som kan utföras på grundval av etablerade protokoll. Eftersom ultraljud processintensitet kan justeras exakt via ultraljudsbehandling parametrar såsom amplitud, cykel / pulsläge, temperatur och provvolym, en gång beprövade protokoll kan upprepas med samma resultat om och om igen.

Ultraljud DNA och RNA fragmentering

Efter celllys och proteinextraktion är ett vanligt nödvändigt steg i provberedningen skjuvning och fragmentering av DNA, RNA och kromatin, t.ex. före kromatinimmunprecipitering (ChIP). DNA- och RNA-fragmentering kan uppnås på ett tillförlitligt sätt genom att bryta de kovalenta bindningar som håller ihop DNA med fysiska krafter. Med hjälp av fysisk skjuvning som ultraljudsbehandling, först bryts DNA-strängarna, sedan fragmenteras DNA:t i mindre bitar.
Ultraljuds-DNA-fragmentering är tillförlitlig och effektiv vid skjuvning av DNA till en riktad längd, t.ex. 500bp (baspar). De stora fördelarna med ultraljud DNA-fragmentering inkluderar den exakta kontrollen av ultraljudsprocessens parametrar och intensitet. Ultraljudsprocessparametrarna kan justeras genom att ställa in ultraljudsbehandling intensitet, cykler och tid exakt. Detta gör det möjligt att skapa önskade DNA-storlekar och den målsatta DNA-längden kan produceras och reproduceras på ett tillförlitligt sätt. Ultraljuds-DNA-skjuvning är också idealisk för att skapa DNA-fragment med hög molekylvikt.

Protokoll för ultraljudslys av Drosophila melanogaster

Nedan kan du hitta olika protokoll för ultraljudsassisterad lys, proteinextraktion och DNA- eller kromatinfragmentering av Drosophila-prover.

Ultraljudslys för tvärbindning av immunprecipitulation (CLIP) analys

CLIP-analysen utfördes som tidigare rapporterats med vissa modifieringar. Cirka 20 mg äggstockar från 0 till 1 dag gamla vildtypshonor var UV-tvärbundna (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniserade på is i 1 ml RCB-buffert (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 % Triton X-100, 250 mM sackaros, 1 mM DTT, 1× EDTA-fria kompletta proteashämmare, 1 mM PMSF) kompletterade med 300 U RNAseOUT och placerades på is i 30 minuter. Homogenatet var sonikerad på is, vid 80% effekt, fem gånger i 20 s skurar med en 60 s vila emellan med hjälp av Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) och centrifugerad (16000 × g i 5 minuter vid 4 °C). Lösligt extrakt förrensades med 20 μl Protein-G dynabeads i 20 minuter vid 4 °C. Efter avlägsnande av prover för immunoblotning och kvantifiering av RNA-input (1 %) immunprecipiterades HP1 med anti-HP1 9A9-antikroppar från 450 μl preclearance-extrakt genom inkubation i 4 timmar med 50 μl Protein-G-dynabeads. Immunfällningar tvättades 4 gånger med RCB. För att eluera de immunprecipiterade RNA:erna kokades de pelleterade kulorna i 100 μL UltraPure DEPC-behandlat vatten i 5 minuter. 900 μL Qiazol-reagens tillsattes till supernatanten som återfanns för RNA-beredning. Det renade RNA:t användes som en mall för att syntetisera cDNA med hjälp av oligo dT, slumpmässiga hexamerer och SuperScript omvänt transkriptas III enligt tillverkarens protokoll.
(Cassale et al. 2019)

Ultraljudslys för kromatinimmunprecipitationsanalys

Kromatinimmunprecipitering utfördes enligt den metod som beskrivits av Menet med smärre modifieringar. Cirka 20 mg äggstockar från 0 till 1 dag gamla vildtypshonor homogeniserades i 1 ml NEB-buffert (10 mM HEPES-Na vid pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na vid pH 8, 0,5 mM EDTA-Na vid pH 8, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-fria kompletta proteashämmare) med en homogenisator / immersionsdispergis 1 min (vid 3000 rpm). Homogenatet överfördes till en förkyld glasbehållare och 15 hela slag applicerades med en tät mortelstöt. Fria kärnor centrifugerades sedan vid 6000xg i 10 minuter vid 4°C. De kärninnehållande pelletarna suspenderades åter i 1 ml NEB och centrifugerades vid 20000 × g i 20 minuter på sackarosgradient (0,65 ml av 1,6 M sackaros i NEB, 0,35 ml av 0,8 M sackaros i NEB). Pelleten återsuspenderades i 1 ml NEB och formaldehyd till en slutlig koncentration på 1 %. Kärnorna tvärbands i 10 minuter vid rumstemperatur och kyldes genom tillsats av 1/10 vol 1,375 M glycin. Kärnorna samlades in genom centrifugering vid 6000 × g i 5 minuter. Kärnorna tvättades två gånger i 1 ml NEB och återsuspenderades i 1 ml lysbuffert (15 mM HEPES-Na vid pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA vid pH 8, 1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 % Na-deoxikolat, 0,1 % SDS, 0,5 % N-lauroylsarkosin och 1× EDTA-fria kompletta proteashämmare). Kärnor sonikerades med hjälp av en Hielscher ultraljudsprocessor UP100H (100 W, 30 kHz) Sex gånger i 20 s på och 1 min på is. Ultraljudsbehandlade kärnor centrifugerades vid 13000 × g i 4 minuter vid 4 °C. Majoriteten av ultraljudsbehandlat kromatin var 500 till 1000 baspar (bp) i längd. För varje immunoprecipitering inkuberades 15 μg kromatin i närvaro av 10 μg HP1 9A9 monoklonal antikropp (3 timmar vid 4 °C i ett roterande hjul). Därefter tillsattes 50 μl dynabeads protein G och inkubationen fortsatte över natten vid 4 °C. Supernatanterna kasserades och proverna tvättades två gånger i Lysis Buffer (varje tvätt 15 min vid 4 °C) och två gånger i TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl vid pH 8). Kromatin eluerades från pärlor i två steg; först i 100 μl av Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM TrisHCl vid pH 8) vid 65 °C i 15 minuter, följt av centrifugering och återvinning av supernatanten. Pärlmaterial extraherades på nytt i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det kombinerade eluatet (200 μl) inkuberades över natten vid 65 °C för att omvända tvärbindningar och behandlades med 50 μg/ml RNaseA i 15 minuter vid 65 °C och med 500 μg/ml proteinas K i 3 timmar vid 65 °C. Proverna extraherades med fenol-kloroform och etanolfälldes ut. DNA resuspenderades i 25 μl vatten. För att maximera de molekylära analyserna med DNA immunoprecipitativrat, amplifierades kandidatgener i par genom ett optimerat duplex-PCR-protokoll genom att använda två olika uppsättningar primers med liknande smälttemperaturer i en enda reaktion.
(Casale et al. 2019)
 

Högpresterande ultraljudscellstörare för biologiska prover

Hielscher Ultrasonics är din långa erfarna partner när det gäller högpresterande ultraljudsapparater för cellstörningar, lys, proteinextraktion, DNA, RNA och kromatinfragmentering samt andra preanalytiska provberedningssteg. Hielscher erbjuder en omfattande portfölj av ultraljudshomogenisatorer för laboratorier och provberedningsenheter och har den perfekta ultraljudsenheten för din biologiska tillämpning och dina krav.
Klassisk ultraljudsapparat av sondtyp med mikrospets som t.ex. UP200St (200W; se bilden till vänster) eller en av ultraljudsprovberedningsenheterna VialTweeter eller UP200ST_TD_CupHorn med VialHolder är favoritmodeller i forsknings- och analyslaboratorier. Den klassiska ultraljudssonden är idealisk, när man förbereder måste färre prover lyseras, extraheras eller fragmenteras. Provberedningsenheterna VialTweeter och UP200St_TD_CupHorn möjliggöra samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 eller 5 injektionsflaskor, respektive.
Om ett stort antal prover (t.ex. 96-brunnars plattor, mikrotiterplattor etc.) måste bearbetas, ska UIP400MTP är den perfekta ultraljudsbehandlingen. Den UIP400MTP fungerar som ett större kopphorn, som är fyllt med vatten och har tillräckligt med utrymme för att hålla mikrobrunnsplattor. Drivs av en 400 watt kraftfull ultraljudsprocessor, levererar UIP400MTP en mycket enhetlig och intensiv ultraljudsbehandling av flera brunnar plattor för att störa celler, lysera prover, solubilisera pellets, extrahera proteiner eller skjuva DNA.

Exakt styrning via smart programvara

Alla Hielscher ultraljudsbehandling lösningar från 200 watt och uppåt är utrustade med en digital färgpekskärm och en intelligent programvara. Via den smarta dataprotokolleringen sparas alla ultraljudsprocessparametrar automatiskt som CSV-fil på ett inbyggt SD-kort så snart ultraljudsapparaten startas. Detta gör forskning och protokollering så mycket bekvämare. Efter ultraljudsbehandling försök eller provberedning, kan du helt enkelt granska ultraljudsbehandling parametrar för varje ultraljudsbehandling köra och jämföra dem.
Via den intuitiva menyn kan många parametrar förinställas före ultraljudsbehandling: Till exempel, för att kontrollera temperaturen i provet och för att förhindra dess termiska nedbrytning, kan en övre gräns för provtemperaturen ställas in. En pluggbar temperatursensor, som levereras med ultraljudsenheten, ger ultraljudsprocessorn feedback om den faktiska ultraljudsbehandlingstemperaturen. När den övre temperaturgränsen har uppnåtts pausar ultraljudsanordningen tills den nedre gränsen för den inställda ∆T uppnås och börjar sedan automatiskt ultraljudsbehandling igen.
Om ultraljudsbehandling med en specifik energitillförsel krävs, kan du förinställa den slutliga ultraljudsenergin för ultraljudsbehandling köra. Naturligtvis kan ultraljudspulsering och cykelläge också ställas in individuellt.
För att återanvända dina mest framgångsrika ultraljudsbehandling parametrar, kan du spara olika ultraljudsbehandling lägen (t.ex. ultraljudsbehandling tid, intensitet, cykel läge etc.) som förinställda lägen, så att de kan vara enkelt och snabbt starta igen.
För mer användarvänlighet kan alla digitala ultraljudsenheter styras via webbläsarens fjärrkontroll i alla vanliga webbläsare (t.ex. InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). LAN-anslutningen är en enkel plug-n-play-installation och kräver ingen ytterligare programvaruinstallation.
Vi på Hielscher vet att framgångsrik ultraljudsbehandling av biologiska prover kräver precision och repeterbarhet. Därför designade vi våra ultraljudsapparater som smarta enheter med alla funktioner som möjliggör en effektiv, pålitlig, reproducerbar och bekväm provberedning.

Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem, från ultraljudsmikrospetsar och klassiska ultraljudshomogenisatorer till MultiSample ultraljudsapparater för bekväm och tillförlitlig beredning av många prover: