Ultraljud Lys av Drosophila melanogaster Prover

Drosophila melanogaster används ofta i laboratorier som modellorganism. Därför måste föranalyserande beredningssteg som lysis, cellstörningar, proteinutvinning och DNA-skevning av Drosophila melanogasterprover utföras ofta. Ultraljud dismembrators är tillförlitliga och effektiva och kan användas för att utföra olika uppgifter såsom lysis, protein utvinning eller DNA fragmentering tillfreds genom att endast justera ultraljud processparametrar. Ultraljud homogenisatorer är därmed flexibla verktyg med ett brett spektrum av applikationer.

Ultraljud Lysis och proteinutvinning

Lys, cell solubilization, vävnad homogenisering och protein extraktion är typiska uppgifter för ultraljud dismembrators i biologiska laboratorier. Ultraljudsdemembrators och cellstörare är väl lämpade för att homogenisera djurvävnader, insekter (t.ex., Drosophila melanogaster, C. elegans) eller växtprover. Efterföljande tillämpningar av ultraljud är lysen av cell suspensioner och pellets samt utvinning av intracellulära proteiner.
Ultraljudslys och protein extraktion är mycket tillförlitliga och reproducerbara processer, som kan utföras på grundval av etablerade protokoll. Eftersom ultraljud processintensitet kan exakt justeras via ultraljudsbehandling parametrar såsom amplitud, cykel / pulsläge, temperatur och prov volym, en gång beprövade protokoll kan upprepas med samma utfall om och om igen.

Ultraljud DNA och RNA Fragmentering

Efter celllys och proteinextraktion är ett vanligt nödvändigt steg i provberedningen saxning och fragmentering av DNA, RNA och kromatin, t.ex. före kromatinimmunprecipitation (ChIP). DNA- och RNA-fragmentering kan uppnås på ett tillförlitligt sätt genom att bryta de kovanta bindningar som håller ihop DNA:t med fysiska krafter. Med hjälp av fysisk savning som ultraljudsbehandling bryts först DNA-strängarna, sedan fragmenteras DNA: t i mindre bitar.
Ultraljud DNA fragmentering är tillförlitlig och effektiv i skjuvning DNA till en riktad längd, t ex 500bp (baspar). De stora fördelarna med ultraljud DNA fragmentering inkluderar exakt kontroll av ultraljud process parametrar och intensitet. Ultraljudsprocess parametrar kan justeras genom att trimma ultraljudsbehandling intensitet, cykler och tid exakt. Detta gör det möjligt att skapa önskade DNA-storlekar och den riktade DNA-längden kan på ett tillförlitligt sätt produceras samt reproduceras. Ultraljud DNA-skjuvning är också idealisk för att skapa hög molekylvikt DNA-fragment.

Protokoll för Ultraljudslys av Drosophila melanogaster

Nedan kan du hitta olika protokoll för ultraljud-assisted lysis, protein extraktion, och DNA eller kromatin fragmentering av Drosophila prover.

Ultraljud Lys för cross-linking Immunoprecipitation (CLIP) Analys

CLIP-analysen utfördes som tidigare rapporterats med vissa modifieringar. Cirka 20 mg äggstockar från 0 till 1 dag gamla vilda honor var UV-korslänkade (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniserade på is i 1 ml RCB-buffert (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sackaros, 1 mM DTT, 1× EDTA-fria Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) kompletterad med 300 U RNAseOUT och placerad på is i 30 min. Homogenatet sonikerades på is, med 80% effekt, fem gånger på 20 s bursts med en 60 s vila däremellan med Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) och centrifugeras (16000 × g i 5 min vid 4°C). Lösligt extrakt var precleared med 20 μl Protein-G dynabeads för 20 min vid 4°C. Efter avlägsnande av prover för immunoblotting och kvantifiering av RNA-ingång (1%), HP1 var immunoprecipitated med anti-HP1 9A9 antikroppar från 450 μl precleared extrakt genom inkubation för 4 h med 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates tvättades 4 gånger med RCB. För att elera de immunutstrålade RNA kokades de pelleterade pärlorna i 100 μL av UltraPure DEPC-behandlat Vatten i 5 min. 900 μL Qiazol Reagens tillsattes till supernatanten som återvunnits för RNA-preparat. RNA renas användes som en mall för att syntetisera cDNA med hjälp av oligo dT, slumpmässiga hexamerer och SuperScript omvänd transkriptas III enligt tillverkarens protokoll.
(Cassale et al. 2019)

Ultraljud Lys för Kromatin Immunoprecipitation Assay

Chromatin immunoprecipitation utfördes enligt den metod som beskrivs av Menet med mindre ändringar. Cirka 20 mg äggstockar från 0- till 1-dagars gamla vilda honor homogeniserades i 1 ml NEB-buffert (10 mM HEPES-Na vid pH 8, 0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na vid pH 8, 0,5 mM EDTA-Na vid pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1× EDTA- fria Complete Protease Inhibitors) med en homogenisator / nedsänkningsdispersor 1 min (vid 3000 varv/min). Homogenate överfördes till en förkyld glasdubbe och 15 full slag tillämpades med en snäv mortel. Fria kärnor centrifugerades sedan vid 6000xg i 10 min vid 4°C. De nukleinhaltiga pelletsen återanvändes i 1 ml NEB och centrifugerades vid 20000 × g i 20 min på sackarosgradient (0,65 ml 1,6 M sackaros i NEB, 0,35 ml 0,8 M sackaros i NEB). Pelleten återanvändes i 1 ml NEB och formaldehyd till en slutlig koncentration på 1%. Atomkärnor var korslänkade i 10 min vid rumstemperatur och släcktes genom att lägga till 1/10 volymprocent 1,375 M glycin. Kärnorna samlades in genom centrifugering vid 6000 × g i 5 min. Atomkärnor tvättades två gånger i 1 ml NEB och återanvändes i 1 ml Lysis-buffert (15 mM HEPES-Na vid pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA vid pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine och 1× EDTA-fria Complete Protease Inhibitors). Nuclei var soniska med hjälp av en Hielscher Ultraljud Processor UP100H (100 W, 30 kHz) sex gånger för 20 s på och 1 min på is. Sonicated atomkärnor centrifugeras vid 13000 × g i 4 min vid 4 ° C. Majoriteten av sonicated kromatin var 500 till 1000 bas par (bp) i längd. För varje immunoprecipitation inkuberades 15 μg kromatin i närvaro av 10 μg HP1 9A9 monoklonal antikropp (3 h vid 4° C i ett roterande hjul). Därefter tillsattes 50 μl dynabeads protein G och inkubationen fortsattes över natten vid 4°C. Supernatanterna kasserades och proverna tvättades två gånger i Lysbuffert (varje tvätt 15 min vid 4 °C) och två gånger i TE Buffert (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl vid pH 8). Kromatin eluerades från pärlor i två steg; först i 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl vid pH 8) vid 65°C i 15 min, följt av centrifugering och återvinning av supernatanten. Pärlor material åter extraherades i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det kombinerade eluatet (200 μl) inkuberades över natten vid 65°C för att vända korslänkar och behandlades med 50 μg/ml RNaseA i 15 min vid 65°C och med 500 μg/ml Proteinase K i 3 h vid 65°C. Prover var fenol–kloroform extraherade och etanol utfälld. DNA var resuspended i 25 μl vatten. För att maximera de molekylära analyserna med DNA-immunoprecipitated, förstärktes kandidatgener i par genom ett optimerat duplex-PCR-protokoll genom att använda två olika uppsättningar primers med liknande smälttemperaturer i en enda reaktion.
(Casale et al. 2019)

Högpresterande ultraljudscellsstörare för biologiska prover

Hielscher Ultrasonics är din länge erfarna partner när det gäller högpresterande ultrasonicators för cellavbrott, lys, proteinextraktion, DNA, RNA, och kromatin fragmentering samt andra pre-analytiska prov beredning steg. Erbjuder en omfattande portfölj av ultraljud lab homogenisatorer och prov beredning enheter, Hielscher har den idealiska ultraljud enhet för din biologiska tillämpning och krav.
Ultraljuds- ultraljuds- med mikro-tip för klassisk sond-typ som t.ex. UP200St (200W; se bilden till vänster) eller någon av de ultraljudsprovberedningsenheterna VialTweeter eller UP200St_TD_CupHorn med VialHolder är favoritmodeller inom forsknings- och analyslaboratorier. Den klassiska ultraljudssonden är idealisk, när du förbereder färre prover måste lysas, extraheras eller fragmenteras. Provberedningsenheterna VialTweeter och UP200St_TD_CupHorn möjliggör samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 respektive 5 injektionsflaska.
Om höga provnummer (t.ex. 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor etc.) måste bearbetas, måste UIP400MTP är den idealiska ultraljudsbehandling setup. UIP400MTP fungerar som en större cuphorn, som är fylld med vatten och har tillräckligt med utrymme för att hålla mikro-väl plattor. Drivs av en 400 watt kraftfull ultraljud processor, UIP400MTP levererar en mycket enhetlig och intensiv ultraljudsbehandling av flera brunnsplattor för att störa celler, lyse prover, solubilize pellets, extrahera proteiner eller skjuvning DNA.

Precise Control via Smart Software

Alla Hielscher ultraljudsbehandling lösningar från 200 watt uppåt är utrustade med en digital färg touch-skärm och en intelligent programvara. Via den smarta data protocolling alla ultraljud processparametrar sparas automatiskt som CSV-fil på en inbyggd SD-kort så snart ultrasonicator startas. Detta gör forskning och protocolling så mycket bekvämare. Efter ultraljudsbehandling prövningar eller prov förberedelse, du kan helt enkelt granska ultraljudsbehandling parametrar för varje ultraljudsbehandling springa och jämföra dem.
Via den intuitiva menyn kan många parametrar förinställda före ultraljudsbehandling: För att till exempel kontrollera temperaturen i provet och förhindra dess termiska nedbrytning kan en övre gräns för provtemperatur ställas in. En pluggbar temperaturgivare, som levereras med ultraljudsenheten, ger ultraljud processor feedback på den faktiska ultraljudsbehandling temperaturen. När den övre temperaturgränsen uppnås pausar ultraljudsenheten tills den nedre gränsen för den inställda ∆T uppnås och börjar sedan automatiskt ultraljudsförblöta igen.
Om ultraljudsbehandling med en specifik energi ingång krävs, kan du förinställa den slutliga ultraljud energi av ultraljudsbehandling köra. Naturligtvis kan ultraljudspulsering och cykelläge ställas in individuellt också.
För att åter använda dina mest framgångsrika ultraljudsbehandling parametrar, kan du spara olika ultraljudsbehandling lägen (t.ex. ultraljudsbehandling tid, intensitet, cykel läge etc.) som pre-set lägen, så att de kan vara lätt och snabbt igång igen.
För mer operativ bekvämlighet, alla digitala ultraljud enheter kan drivas via webbläsare fjärrkontroll i alla vanliga webbläsare (t.ex. InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). LAN-anslutningen är en enkel plug-n-play-inställning och kräver ingen ytterligare programinstallation.
Vi på Hielscher vet att den framgångsrika ultraljudsbehandling av biologiska prover kräver precision och repeterbarhet. Därför har vi utformat våra ultrasonicators som smarta enheter med alla funktioner som möjliggör en effektiv, tillförlitlig, reproducerbar och bekväm provberedning.

Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem från ultraljud mikrospetsar och klassiska ultraljud homogenisatorer till MultiSample ultraljudsatorer för bekväm, tillförlitlig beredning av många prover: