Ultraljud Lys av Drosophila melanogaster Prover

Drosophila melanogaster is widely used in laboratories as model organism. Therefore, pre-analytical preparation steps such as lysis, cell disruption, protein extraction and DNA shearing of Drosophila melanogaster samples must be frequently carried out. Ultrasonic dismembrators are reliable and efficient and can used to perform various tasks such as lysis, protein extraction or DNA fragmentation at ease by only adjusting ultrasonic process parameters. Ultrasonic homogenizers are thereby flexible tools with a broad range of applications.

Ultraljud Lysis och proteinutvinning

Lys, cell solubilization, vävnad homogenisering och protein extraktion är typiska uppgifter för ultraljud dismembrators i biologiska laboratorier. Ultraljudsdemembrators och cellstörare är väl lämpade för att homogenisera djurvävnader, insekter (t.ex., Drosophila melanogaster, C. elegans) eller växtprover. Efterföljande tillämpningar av ultraljud är lysen av cell suspensioner och pellets samt utvinning av intracellulära proteiner.
Ultraljudslys och protein extraktion är mycket tillförlitliga och reproducerbara processer, som kan utföras på grundval av etablerade protokoll. Eftersom ultraljud processintensitet kan exakt justeras via ultraljudsbehandling parametrar såsom amplitud, cykel / pulsläge, temperatur och prov volym, en gång beprövade protokoll kan upprepas med samma utfall om och om igen.

Ultraljud DNA och RNA Fragmentering

After cell lysis and protein extraction, a common required step in sample preparation is the shearing and fragmentation of DNA, RNA, and chromatin, e.g. before chromatin immunoprecipitation (ChIP). DNA and RNA fragmentation can be reliably achieved by breaking the covalent bonds that hold the DNA together by physical forces. Using physical shearing such as sonication, at first the DNA strands are broken, then the DNA is fragmented into smaller pieces.
Ultraljud DNA fragmentering är tillförlitlig och effektiv i skjuvning DNA till en riktad längd, t ex 500bp (baspar). De stora fördelarna med ultraljud DNA fragmentering inkluderar exakt kontroll av ultraljud process parametrar och intensitet. Ultraljudsprocess parametrar kan justeras genom att trimma ultraljudsbehandling intensitet, cykler och tid exakt. Detta gör det möjligt att skapa önskade DNA-storlekar och den riktade DNA-längden kan på ett tillförlitligt sätt produceras samt reproduceras. Ultraljud DNA-skjuvning är också idealisk för att skapa hög molekylvikt DNA-fragment.

Protokoll för Ultraljudslys av Drosophila melanogaster

Nedan kan du hitta olika protokoll för ultraljud-assisted lysis, protein extraktion, och DNA eller kromatin fragmentering av Drosophila prover.

Ultraljud Lys för cross-linking Immunoprecipitation (CLIP) Analys

CLIP assay was performed as previously reported with some modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were UV crosslinked (3 × 2000 μJ/cm2), homogenized on ice in 1 mL RCB buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) supplemented with 300 U RNAseOUT and placed on ice for 30 min. The homogenate was sonicated on ice, at 80% power, five times in 20 s bursts with a 60 s rest in between using the Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) och centrifugeras (16000 × g i 5 min vid 4°C). Lösligt extrakt var precleared med 20 μl Protein-G dynabeads för 20 min vid 4°C. Efter avlägsnande av prover för immunoblotting och kvantifiering av RNA-ingång (1%), HP1 var immunoprecipitated med anti-HP1 9A9 antikroppar från 450 μl precleared extrakt genom inkubation för 4 h med 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates tvättades 4 gånger med RCB. För att elera de immunutstrålade RNA kokades de pelleterade pärlorna i 100 μL av UltraPure DEPC-behandlat Vatten i 5 min. 900 μL Qiazol Reagens tillsattes till supernatanten som återvunnits för RNA-preparat. RNA renas användes som en mall för att syntetisera cDNA med hjälp av oligo dT, slumpmässiga hexamerer och SuperScript omvänd transkriptas III enligt tillverkarens protokoll.
(Cassale et al. 2019)

Ultraljud Lys för Kromatin Immunoprecipitation Assay

Chromatin immunoprecipitation was performed according to the method described by Menet with minor modifications. Approximately 20 mg ovaries from 0- to 1-day-old wild-type females were homogenized in 1 mL of NEB buffer (10 mM HEPES-Na at pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na at pH 8, 0.5 mM EDTA-Na at pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) with a homogenizer / immersion disperser 1 min (at 3000 rpm). The homogenate was transferred to a pre-chilled glass dounce and 15 full strokes were applied with a tight pestle. Free nuclei were then centrifuged at 6000xg for 10 min at 4°C. The nuclei-containing pellets were resuspended in 1 mL of NEB and centrifuged at 20000 × g for 20 min on sucrose gradient (0.65 mL of 1.6 M sucrose in NEB, 0.35 mL of 0.8 M sucrose in NEB). The pellet was resuspended in 1 mL of NEB and formaldehyde to a final concentration of 1%. Nuclei were cross-linked for 10 min at room temperature and quenched by adding 1/10 vol of 1.375 M glycine. The nuclei were collected by centrifugation at 6000 × g for 5 min. Nuclei were washed twice in 1 mL of NEB and resuspended in 1 mL of Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na at pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA at pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine and 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuclei were sonicated using a Hielscher Ultrasonic Processor UP100H (100 W, 30 kHz) sex gånger för 20 s på och 1 min på is. Sonicated atomkärnor centrifugeras vid 13000 × g i 4 min vid 4 ° C. Majoriteten av sonicated kromatin var 500 till 1000 bas par (bp) i längd. För varje immunoprecipitation inkuberades 15 μg kromatin i närvaro av 10 μg HP1 9A9 monoklonal antikropp (3 h vid 4° C i ett roterande hjul). Därefter tillsattes 50 μl dynabeads protein G och inkubationen fortsattes över natten vid 4°C. Supernatanterna kasserades och proverna tvättades två gånger i Lysbuffert (varje tvätt 15 min vid 4 °C) och två gånger i TE Buffert (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl vid pH 8). Kromatin eluerades från pärlor i två steg; först i 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl vid pH 8) vid 65°C i 15 min, följt av centrifugering och återvinning av supernatanten. Pärlor material åter extraherades i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det kombinerade eluatet (200 μl) inkuberades över natten vid 65°C för att vända korslänkar och behandlades med 50 μg/ml RNaseA i 15 min vid 65°C och med 500 μg/ml Proteinase K i 3 h vid 65°C. Prover var fenol–kloroform extraherade och etanol utfälld. DNA var resuspended i 25 μl vatten. För att maximera de molekylära analyserna med DNA-immunoprecipitated, förstärktes kandidatgener i par genom ett optimerat duplex-PCR-protokoll genom att använda två olika uppsättningar primers med liknande smälttemperaturer i en enda reaktion.
(Casale et al. 2019)

Högpresterande ultraljudscellsstörare för biologiska prover

Hielscher Ultrasonics är din länge erfarna partner när det gäller högpresterande ultrasonicators för cellavbrott, lys, proteinextraktion, DNA, RNA, och kromatin fragmentering samt andra pre-analytiska prov beredning steg. Erbjuder en omfattande portfölj av ultraljud lab homogenisatorer och prov beredning enheter, Hielscher har den idealiska ultraljud enhet för din biologiska tillämpning och krav.
Ultraljuds- ultraljuds- med mikro-tip för klassisk sond-typ som t.ex. UP200St (200W; se bilden till vänster) eller någon av de ultraljudsprovberedningsenheterna VialTweeter eller UP200St_TD_CupHorn med VialHolder är favoritmodeller inom forsknings- och analyslaboratorier. Den klassiska ultraljudssonden är idealisk, när du förbereder färre prover måste lysas, extraheras eller fragmenteras. Provberedningsenheterna VialTweeter och UP200St_TD_CupHorn möjliggör samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 respektive 5 injektionsflaska.
Om höga provnummer (t.ex. 96-brunnsplattor, mikrotiterplattor etc.) måste bearbetas, måste UIP400MTP är den idealiska ultraljudsbehandling setup. UIP400MTP fungerar som en större cuphorn, som är fylld med vatten och har tillräckligt med utrymme för att hålla mikro-väl plattor. Drivs av en 400 watt kraftfull ultraljud processor, UIP400MTP levererar en mycket enhetlig och intensiv ultraljudsbehandling av flera brunnsplattor för att störa celler, lyse prover, solubilize pellets, extrahera proteiner eller skjuvning DNA.

Precise Control via Smart Software

Alla Hielscher ultraljudsbehandling lösningar från 200 watt uppåt är utrustade med en digital färg touch-skärm och en intelligent programvara. Via den smarta data protocolling alla ultraljud processparametrar sparas automatiskt som CSV-fil på en inbyggd SD-kort så snart ultrasonicator startas. Detta gör forskning och protocolling så mycket bekvämare. Efter ultraljudsbehandling prövningar eller prov förberedelse, du kan helt enkelt granska ultraljudsbehandling parametrar för varje ultraljudsbehandling springa och jämföra dem.
Via the intuitive menu, numerous parameter can be preset before sonication: For instance, to control the temperature in the sample and to prevent its thermal degradation, an upper limit of sample temperature can be set. A pluggable temperature sensor, which comes with the ultrasonic unit, gives the ultrasonic processor feedback on the actual sonication temperature. When the upper temperature limit is reached, the ultrasonic device pauses until the lower limit of the set ∆T is reached and starts then automatically sonicating again.
Om ultraljudsbehandling med en specifik energi ingång krävs, kan du förinställa den slutliga ultraljud energi av ultraljudsbehandling köra. Naturligtvis kan ultraljudspulsering och cykelläge ställas in individuellt också.
För att åter använda dina mest framgångsrika ultraljudsbehandling parametrar, kan du spara olika ultraljudsbehandling lägen (t.ex. ultraljudsbehandling tid, intensitet, cykel läge etc.) som pre-set lägen, så att de kan vara lätt och snabbt igång igen.
För mer operativ bekvämlighet, alla digitala ultraljud enheter kan drivas via webbläsare fjärrkontroll i alla vanliga webbläsare (t.ex. InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). LAN-anslutningen är en enkel plug-n-play-inställning och kräver ingen ytterligare programinstallation.
Vi på Hielscher vet att den framgångsrika ultraljudsbehandling av biologiska prover kräver precision och repeterbarhet. Därför har vi utformat våra ultrasonicators som smarta enheter med alla funktioner som möjliggör en effektiv, tillförlitlig, reproducerbar och bekväm provberedning.

The table below gives you an indication of the approximate processing capacity of our ultrasonic systems from ultrasonic micro-tips and classic ultrasonic homogenizers to MultiSample ultrasonicators for the convenient, reliable preparation of numerous samples: