Ultraljudslys av Drosophila melanogaster-prover

Drosophila melanogaster används ofta som modellorganism i laboratorier. Därför måste preanalytiska beredningssteg såsom lys, celldisruption, proteinextraktion och skjuvning av DNA i Drosophila melanogaster-prover utföras ofta. Ultraljudsdisintegratorer är tillförlitliga och effektiva och kan enkelt användas för olika uppgifter såsom lys, proteinextraktion eller DNA-fragmentering genom att endast justera ultraljudsprocessens parametrar. Ultraljudshomogenisatorer är därmed flexibla verktyg med ett brett användningsområde.

Ultraljudslys och proteinextraktion

Lys, cellsolubilisering, vävnadshomogenisering och proteinextraktion är typiska uppgifter för ultraljudsdisintegratorer i biologiska laboratorier. Ultraljudsdisintegratorer och celldisruptorer är väl lämpade för att homogenisera djurvävnader, insekter (t.ex. Drosophila melanogaster, C. elegans) eller växtprover. Efterföljande tillämpningar av ultraljudsbehandling är lys av cellsuspensioner och pellets samt extraktion av intracellulära proteiner.
Ultraljudslys och proteinextraktion är mycket tillförlitliga och reproducerbara processer som kan utföras utifrån etablerade protokoll. Eftersom ultraljudsprocessens intensitet kan justeras exakt via ultraljudsparametrar såsom amplitud, cykel- / pulsläge, temperatur och provvolym, kan väl beprövade protokoll upprepas med samma resultat gång på gång.

Fragmentering av DNA och RNA med ultraljud

Efter celllys och proteinextraktion är skjuvning och fragmentering av DNA, RNA och kromatin ett vanligt nödvändigt steg i provberedningen, t.ex. före kromatinimmunoprecipitation (ChIP). DNA- och RNA-fragmentering kan åstadkommas tillförlitligt genom att med fysikaliska krafter bryta de kovalenta bindningar som håller samman DNA. Vid fysikalisk skjuvning, såsom ultraljudsbehandling, bryts först DNA-strängarna, varefter DNA fragmenteras i mindre bitar.
DNA-fragmentering med ultraljud är tillförlitlig och effektiv för att skjuva DNA till en avsedd längd, t.ex. 500bp (baspar). De främsta fördelarna med DNA-fragmentering med ultraljud omfattar den exakta kontrollen av ultraljudsprocessens parametrar och intensitet. Ultraljudsprocessens parametrar kan justeras genom att noggrant ställa in ultraljudsbehandlingens intensitet, cykler och tid. Detta gör det möjligt att skapa önskade DNA-storlekar, och den avsedda DNA-längden kan både produceras och reproduceras tillförlitligt. DNA-skjuvning med ultraljud är också idealisk för att skapa DNA-fragment med hög molekylvikt.

Protokoll för ultraljudslys av Drosophila melanogaster

Nedan hittar du olika protokoll för ultraljudsassisterad lys, proteinextraktion och fragmentering av DNA eller kromatin i Drosophila-prover.

Ultraljudslys för analys med korsbindningsimmunoprecipitation (CLIP)

CLIP-analysen utfördes enligt tidigare beskrivning med vissa modifieringar. Cirka 20 mg äggstockar från 0 till 1 dygn gamla honor av vildtyp korsbands med UV-ljus (3 × 2000 μJ/cm2), homogeniserades på is i 1 mL RCB-buffert (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sackaros, 1 mM DTT, 1× EDTA-fria Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) med tillsats av 300 U RNAseOUT och placerades på is i 30 min. Homogenatet ultraljudsbehandlades på is vid 80% effekt, fem gånger i 20 s långa pulser med 60 s paus mellan pulserna, med Hielschers ultraljudsprocessor UP100H (100 W, 30 kHz) och centrifugerades (16 000 × g i 5 min vid 4°C). Det lösliga extraktet förrenades med 20 μl Protein-G dynabeads i 20 min vid 4°C. Efter att prover tagits ut för immunblottning och kvantifiering av ingående RNA (1%) immunprecipiterades HP1 med anti-HP1 9A9-antikropp från 450 μl förrenat extrakt genom inkubering i 4 h med 50 μl Protein-G dynabeads. Immunprecipitaten tvättades 4 gånger med RCB. För att eluera de immunprecipiterade RNA-molekylerna kokades de pelleterade kulorna i 100 μL UltraPure DEPC-behandlat vatten i 5 min. 900 μL Qiazol Reagent tillsattes till den supernatant som samlats in för RNA-preparering. Det renade RNA:t användes som mall för att syntetisera cDNA med oligo dT, slumpmässiga hexamerer och SuperScript omvänt transkriptas III enligt tillverkarens protokoll.
(Cassale et al. 2019)

Ultraljudslys för kromatinimmunprecipitationsanalys

Kromatinimmunprecipitation utfördes enligt den metod som beskrivits av Menet, med mindre modifieringar. Cirka 20 mg ovarier från 0–1 dagar gamla vildtypshonor homogeniserades i 1 mL NEB-buffert (10 mM HEPES-Na vid pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na vid pH 8, 0,5 mM EDTA-Na vid pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-fria Complete Protease Inhibitors) med en homogenisator / nedsänkningsdispergerare i 1 min (vid 3000 rpm). Homogenatet överfördes till en förkyld Dounce-homogenisator av glas och bearbetades med 15 fullständiga slag med en tättslutande pistill. Fria cellkärnor centrifugerades därefter vid 6000xg i 10 min vid 4°C. Pelletarna som innehöll cellkärnor resuspenderades i 1 mL NEB och centrifugerades vid 20 000 × g i 20 min på en sackarosgradient (0,65 mL 1,6 M sackaros i NEB, 0,35 mL 0,8 M sackaros i NEB). Pelleten resuspenderades i 1 mL NEB och formaldehyd till en slutkoncentration på 1%. Cellkärnorna tvärbands i 10 min vid rumstemperatur och reaktionen stoppades genom tillsats av 1/10 volym 1,375 M glycin. Cellkärnorna samlades in genom centrifugering vid 6000 × g i 5 min. Cellkärnorna tvättades två gånger i 1 mL NEB och resuspenderades i 1 mL lysbuffert (15 mM HEPES-Na vid pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA vid pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarkosin och 1× EDTA-fria Complete Protease Inhibitors). Cellkärnorna ultraljudsbehandlades med en ultraljudsprocessor från Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) sex gånger med 20 s aktiv behandling och 1 min på is. De ultraljudsbehandlade cellkärnorna centrifugerades vid 13 000 × g i 4 min vid 4°C. Merparten av det ultraljudsbehandlade kromatinet hade en längd på 500 till 1000 baspar (bp). För varje immunprecipitation inkuberades 15 μg kromatin i närvaro av 10 μg monoklonal HP1 9A9-antikropp (3 h vid 4°C på ett roterande hjul). Därefter tillsattes 50 μl dynabeads protein G och inkuberingen fortsatte över natten vid 4°C. Supernatanterna kasserades och proverna tvättades två gånger i lysbuffert (varje tvätt i 15 min vid 4 °C) och två gånger i TE-buffert (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl vid pH 8). Kromatin eluerades från kulorna i två steg; först i 100 μl elueringsbuffert 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl vid pH 8) vid 65°C i 15 min, följt av centrifugering och insamling av supernatanten. Kulmaterialet extraherades på nytt i 100 μl TE + 0,67% SDS. Det sammanslagna eluatet (200 μl) inkuberades över natten vid 65°C för att häva tvärbindningarna och behandlades med 50 μg/ml RNaseA i 15 min vid 65°C och med 500 μg/ml proteinas K i 3 h vid 65°C. Proverna extraherades med fenol–kloroform och fälldes med etanol. DNA resuspenderades i 25 μl vatten. För att maximera de molekylära analyserna med immunprecipiterat DNA amplifierades kandidatgener parvis enligt ett optimerat duplex-PCR-protokoll genom användning av två olika primeruppsättningar med liknande smälttemperaturer i en enda reaktion.
(Casale et al. 2019)
 

Högpresterande ultraljudscelldisruptorer för biologiska prover

Hielscher Ultrasonics är din partner med lång erfarenhet när det gäller högpresterande ultraljudsapparater för celldisruption, lys, proteinextraktion, fragmentering av DNA, RNA och kromatin samt andra steg i preanalytisk provberedning. Med ett omfattande utbud av ultraljudshomogenisatorer för laboratorier och provberedningsenheter har Hielscher den idealiska ultraljudsapparaten för din biologiska tillämpning och dina krav.
Klassiska ultraljudsapparater av sondtyp med mikrospets, såsom UP200St (200W; se bilden till vänster), eller någon av ultraljudsenheterna för provberedning VialTweeter eller UP200ST_TD_CupHorn med VialHolder är populära modeller i forsknings- och analyslaboratorier. Den klassiska ultraljudssonden är idealisk när ett mindre antal prover behöver lyseras, extraheras eller fragmenteras. Provberedningsenheterna VialTweeter och UP200St_TD_CupHorn möjliggör samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 respektive 5 provflaskor.
Om stora antal prover (t.ex. plattor med 96 brunnar, mikrotiterplattor etc.) måste bearbetas är UIP400MTP den idealiska utrustningen för ultraljudsbehandling. UIP400MTP fungerar som ett större kopphorn som fylls med vatten och har tillräckligt med utrymme för plattor med mikrobrunnar. UIP400MTP drivs av en kraftfull ultraljudsprocessor på 400 watt och ger en mycket jämn och intensiv ultraljudsbehandling av flerbrunnsplattor för att sönderdela celler, lysera prover, solubilisera pellets, extrahera proteiner eller skjuva DNA.

Precis styrning med smart programvara

Alla Hielschers lösningar för ultraljudsbehandling från 200 watt och uppåt är utrustade med en digital pekskärm i färg och intelligent programvara. Genom den smarta dataloggningen sparas alla ultraljudsprocessparametrar automatiskt som en CSV-fil på ett inbyggt SD-kort så snart ultraljudsapparaten startas. Detta gör forskning och dokumentation mycket smidigare. Efter ultraljudsförsöken eller provberedningen kan du enkelt granska och jämföra parametrarna för varje ultraljudskörning.
Via den intuitiva menyn kan många parametrar förinställas före ultraljudsbehandlingen: För att exempelvis styra temperaturen i provet och förhindra termisk nedbrytning kan en övre gräns för provtemperaturen ställas in. En anslutningsbar temperatursensor, som medföljer ultraljudsenheten, ger ultraljudsprocessorn återkoppling om den faktiska temperaturen under ultraljudsbehandlingen. När den övre temperaturgränsen nås pausar ultraljudsapparaten tills den nedre gränsen för det inställda ∆T nås och börjar sedan automatiskt ultraljudsbehandla igen.
Om ultraljudsbehandling med en specifik energitillförsel krävs kan du förinställa den totala ultraljudsenergin för körningen. Naturligtvis kan även ultraljudspulsering och cykelläge ställas in individuellt.
För att återanvända dina mest framgångsrika ultraljudsparametrar kan du spara olika ultraljudsinställningar (t.ex. behandlingstid, intensitet, cykelläge etc.) som förinställda lägen, så att de enkelt och snabbt kan startas igen.
För bekvämare användning kan alla digitala ultraljudsenheter fjärrstyras via valfri vanlig webbläsare (t.ex. InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). LAN-anslutningen är enkel att konfigurera med plug-and-play och kräver ingen ytterligare programvaruinstallation.
Vi på Hielscher vet att framgångsrik ultraljudsbehandling av biologiska prover kräver precision och repeterbarhet. Därför har vi utformat våra ultraljudsapparater som smarta enheter med alla funktioner som möjliggör effektiv, tillförlitlig, reproducerbar och bekväm provberedning.

Tabellen nedan ger en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem, från ultraljudsmikrospetsar och klassiska ultraljudshomogenisatorer till MultiSample-ultraljudsapparater för bekväm och tillförlitlig beredning av ett stort antal prover: