Hielscher ultraljud teknik

Ultraljud-DNA Shearing

  • Under DNA-och RNA-klippning bryts DNA-molekyler i mindre bitar. DNA/RNA-fragmentering är en av de viktiga exempel prep steg som krävs för att skapa bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS).
  • Ultraljud DNA klippning använder krafter akustisk kavitation att bryta DNA eller RNA i bitar av 100 – 5kb BP.
  • Ultraljud klippning möjliggör exakt DNA-fragmentering och anpassning till önskad DNA-längd.

 

Ultraljud-DNA Shearing

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljud-baserade lösningar för DNA, RNA och kromatin klippning. Välj mellan en sond-typ ultrasonicators (t. ex. UP100H) för direkt ultraljudsbehandling med hjälp av en microtip, eller använda VialTweeeter eller ultraljud cuphorn för indirekta DNA beredning av olika prover samtidigt. Hielscher erbjuder den idealiska enheten med tanke på dina behov: vädret du har 1 eller upp till 10 prover, volymer från mikroliter till liter volymer – Hielscher ultraljud processorer finns tillgängliga för att uppfylla dina krav för att förbereda DNA, RNA och kromatin fragment på rätt längd. Reproducerbarhet, enkel användning och exakt kontroll möjliggör ett tillförlitligt bibliotek för nästa generations sekvensering.
I motsats till enzymatisk DNA-fragmentering gäller ultraljud klippning rena mekaniska skjuvning krafter utan att lägga till några kemikalier. Genom den exakta inställningen av process parametrar producerar ultraljud klippning hög molekyl vikt DNA-fragment (Plasmid och genomisk DNA).
Renade nukleinsyror kan förstärkas före eller efter en fragmentering steg.
Ultraljudsbehandling parametrar (makt, puls cykel/skurar, tid och temperatur) kan styras säkert via program vara inställningar.

fördelar:

  • noggrann kontroll
  • ultraljudsbehandling cykler och tid exakt anpassningsbar till önskad DNA-storlek
  • DNA-fragment med hög molekyl vikt
  • temperaturkontroll
  • Snabb
  • Reproducerbara resultat
  • autoklaverbara
  • olika lösningar: Sond-typ, VialTweeter och Cuphorn

Protokoll för ultraljud DNA klippning

För Chromatin Immunoprecipidationsanalys

Kort, celler var klädd i 60mm-diameter rätter (400 000 per fat) och transfekterade med RhoA siRNA (som beskrivs); efter 72 timmar inkuberades de med formaldehyd (slut koncentration, 1%) 10 min vid 37 ° c för att korsa länk proteiner till DNA. Den tvärkopplande reaktionen släcktes genom tillsats av en tiondel av 1,25 mol/L glycin, vilket gav 125 mmol/L slutlig koncentration. Cellerna tvättades två gånger med iskaffe PBS, återsuspenderade i radioimmunoprecipitationsbuffert [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxicholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] innehåll ande 1 mmol/L Fenylmetylsulfonylfluorid, 1 AG/mL aprotinin och 1 AG/mL Pepstatin A och hålls på is i 30 min. Sedan, cell cellysater var sonicated på isen med en Hielscher UP200S ultraljud sonikator (3 x 40 s, amplitud 40%, cykel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) tills tvär bunden kromatiner var klippt att ge DNA-fragment mellan 200 och 1 000 BP. En tiondel av hela lysatet användes för att kvantifiera den mängd DNA som finns i olika prover och betraktas som “totala DNA-insatsen”. Supernatants inkuberades med lax spermier DNA/protein agarose-50% flyt gödsel för att minska ospecifik bakgrund. Immunutfällning gjordes sedan över natten vid 4 ° c med 5 AG av anti-NF-nB P65 (Upstate) eller utan anti kropp (negativ kontroll). Dessa slå samman supernatanterna kompletterades med 5 mol/L NaCl och uppvärmd över natten på 65 ° c för att återställa protein-DNA Cross-Links. Immunokomplexen behandlades vidare med DNase-och RNase-Free proteinas K, och DNA renades genom fenol/kloroformextraktion och etanol fällning. PCR utfördes med specifika primrar som motsvarade en sekvens inom Promotorn för genen Human iNOS (P1 primer: 5 ¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ¶; P2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier et al., 2008)

Studier av EGFP-uttryck

För uttrycks studier, den rekombinanta stammen L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (Jena Bioscience, Tyskland) med genen för EGFP (förstärkt grönt fluorescerande protein), kromosomal SSU integrerat, odlades i olika medier som beskrivs tidigare och dessutom kompletterat med 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under odlingen togs 1 ml prover, centrifugerade (2000 × g, 20 ° c, 10 min) och tvättades med 0,9% NaCl lösning. Pellet var resuspenderade i buffert (20 mm Hepes, 5 mm EDTA, 2 mm DTT) och desinfieras av ultraljudsbehandling med ultraljud processorn UP400S (tillämpning av energi ∼ 400 ws). Cellrester avlägsnades genom centrifugering (6000 × g, 4 ° c, 5 min) och analyserades med natriumdodecylsulfat – polyakrylamidelektrofores (SDS-PAGE) under Reduktions förhållanden enligt metoden för Laemmli (1970) med 12,5% polyacralamidgel. EGFP-uttryck granskades i upprörda kulturen. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher ' s UP100H användes för att förbereda EHEC DNA för chip array analys

Elektroforetiska analyser av genomiskt DNA hos E. coli EDL933 utsätts för 0 – 15 min ultraljud. L anger DNA Ladder. (Basselet et al. 2008)

Informationsförfrågan




Notera vår Integritetspolicy.


Kromatin immunnederbörd

Ultraljud cellstörande UP100H (100W) för Lys, cell störningar och DNA klippning.Kromatin immunoprecipidationsanalysen utfördes med hjälp av ChIP-IT-Tm Express (Active motif, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner med vissa modifieringar. Kortfattat, differentierade mänskliga podocyter var tvär bunden med 1% formaldehyd för 10 min i rums temperatur. Cellerna tvättades med iskallt PBS och fixeringreaktionen stoppades genom att tillsätta 0,125 M glycin i 5 min vid rums temperatur. Cellerna tvättades igen med iskalla PBS och skrapades från skålen. Cellerna pelleterades genom centrifugering och återsuspenderas i lyseringsbufferten. Efter centrifugering återsuspenderade pelleterade kärnor i skjuvning buffert, inkuberas på is i 30 min och kromatin var klippt av ultraljudsbehandling, t. ex. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) på 25% makt 5 pulser av 20 SEK vardera på isen i fragment av cirka 200-600 BP. Den utklippt kromatin centrifugerades sedan och supernatanten samlades in. För immunoprecipitationer inkuberades 60 μl kromatin med 1 μg SP1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB P65 (Abcam, Cambridge, UK) eller NF-κB P50 (Abcam) anti kroppar eller med kanin IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, Kalifornien, USA), som en negativ kontroll, över natten vid 4 ° c med skonsam rotation. Immunokomplex bundna till magnetiska pärlor samlades in med hjälp av ett magnetiskt stativ, tvättade i stor utsträckning, och protein/DNA-antipyridinantikropp var omvänd och DNA eluerade för realtids-PCR-analys. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA förberedelse för chip array analys

Placering av celllysater och extraherade DNAs
Bakterie pellets som suspenderade i PBS till önskad slutlig koncentration behandlades med ultraljud störande UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) utrustad med en microtip MS1 (1mm i diameter). Drift frekvensen var 30 kHz och den effektiva uteffekten var 100 W. Under operationen kyls proverna i ett isvattenbad, blandat och centrifugeras. Proverna utnyttjades för flödescytometri studier, medan för senare hantering, prover utsattes för en värmebehandling (95 ° c, 5 min). De obearbetade celllysatesna bearbetades med en blandning av fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1). En lika stor volym av denna blandning lades till det lysate provet, lösningen var vortexed kraftigt för 15 s och centrifugeras vid 15 000 x g för 2 min i rums temperatur (RT) runt 22 ° c. Den översta vatten fasen med genomiskt DNA avskiljdes omsorgsfullt och samlades in i ett nytt sterilt Eppendorf-rör.
Därefter var prover sonicated att fragmentera DNA. Ultraljudsbehandling steg realiserades på samma villkor som beskrivits ovan. För att utvärdera fragmenteringseffekterna på genomiskt DNA analyserades proverna med hjälp av AGA ros-gelelektrofores.
(…) Proverna sonicated tidigare för 2,5 min utsattes för ett extraktionssteg efter värmebehandling och centrifugering. DNA släpptes två gånger med en fenol: kloroform: isoamyl alkohol mix, och efteråt utsätts för andra ultraljudsbehandling för 0-15 min. agarose gel elektrofores användes för att bestämma storleken fördelningen av DNA utsätts för efter extraktion ultraljud fragmentering (Fig. längst upp till höger). Mycket fragmenterad DNA var uppenbar från närvaron av ett DNA-utstryk snarare än hög molekyl ära vikt band som eliminerades från prover sonicated för 2,5 min eller längre. Längre ultraljudsbehandling gradvis minskat fragment längder till cirka 150-600 BP, och ultraljudsbehandling för 15 min ytterligare degraderat dessa fragment, som kan ses mesta dels av den övre delen av utstryk. Sålunda, den genomsnittliga DNA-fragment storlek gradvis sjönk med ultraljud tid och 5 min behandling tillåtet att få storlekar av DNA-fragment mest lämpade för chip array analyser. Till, den DNA-analyten förberedelse förfarande som består av första 2 min av ultraljud behandling, DNA-extraktion (2 ×), och efterföljande 5 min sonication, fastställdes. (Basselet et al. 2008)

Kromatin Immunnederbörd (ChIP)

Ultrasonic processor UP100H for DNA, RNA and chromatin shearing. (Click to enlarge!)HEK293 celler var odlade som beskrivits ovan och fast med 2 mM disuccinimidyl-glutarat för 45 min i rums temperatur. Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS. Chromatin var tvär bunden för 10 min i rums temperatur med 1% (v/v) formaldehyd och tvättas två gånger med iskalla PBS. Den tvärkopplande reaktionen stoppades genom inkubation med glycin vid en koncentration på 0,125 M i 5 min vid rums temperatur. Efter inkubation med trypsin, var cellerna skrapas från cell kultur skålen och tvättas två gånger med PBS. Cellpelleten återsuspenderas i lyseringsbuffert (5 mM rör, pH 8,0, 85 mM KCl, och 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkuberas på is i 10 min, och homogeniseras med en Dounce Homogenisatorer. Därefter pelleterades kärnor genom centrifugering (3500 x g, 5 min, 4 ° c) och återsuspenderas i nuklei-buffert (50 mm Tris-HCl, pH 8,1, 10 mm EDTA och 1% (w/v) SDS). Nuclei stördes av ultraljudsbehandling med 3 20-s pulser i en UP50H någon sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) vid en inställning av cykel 0,5 och amplitud 30%, vilket ger genomisk DNA-fragment med en bulk storlek på 200-1000 BP. För ChIP, 50 g av DNA späddes 4-faldigt i immunutfällning buffert (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, och 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histone modifiering analys av kromatin immunnederbörd (ChIP)

Kort, 6 x 106 celler tvättades två gånger med PBS och tvär bunden på odlings plattan i 15 minuter vid rums temperatur i närvaro av 0,5% formaldehyd. Kors länkning reaktion stoppades genom att lägga till 0,125 M glycin. Alla efterföljande steg utfördes vid 48 ° c. Alla buffertar var pre-kylda och innehöll proteashämmare (Complete mini, Roche). Cellerna tvättades två gånger med PBS och sedan skrapade. Insamlade pellets Upplös tes i 1 ml lyseringsbuffert (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM tris pH 8) och var sonicated i en kall etanol bad för 10 cykler på 100% amplitud med hjälp av en UP50H någon sonikator (Hielscher, Teltow, Tyskland). Chromatin fragmentering visualiserades i 1% AGA ros gel. Erhållna fragment fanns i intervallet 200 – 500pb. Löslig kromatin erhölls genom centrifugering av sonicated prover på 14000g för 10 min vid 48 ° c. Den lösliga fraktionen späddes 1/10 i spädnings buffert (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM tris pH 8, 150 mM NaCl) sedan aliciterad och förvaras vid 80 ° c till användning. (Rodriguez et al. 2008)

Enhet Strömförsörjning [W] Typ Volym [mL]
VialTweeter 200 Fristående 05. den femte 1,5
UP50H 50 handhållen eller standmonterad 0.01 250
UP100H 100 handhållen eller standmonterad 0.01 500
Uf200 ः t 200 handhållen eller standmonterad 0den första. 1 1000
UP200St 200 standmonterad 0den första. 1 1000
UP400St 400 standmonterad 5,0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 kontamineringsfri flödescell

Informationsförfrågan




Notera vår Integritetspolicy.


Hielschers VialTweeter är är affären för samtidig beredning av flera prover

VialTweeter för ultraljud prov prep

Kontakta oss! / Fråga oss!

Be om mer information

Använd formuläret nedan om du vill begära ytterligare information om ultraljud homogenisering. Vi ska vara glada att kunna erbjuda dig ett ultraljud system som uppfyller dina krav.









Observera att våra Integritetspolicy.


Litteratur / Referenser

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): prov bearbetning för DNA-chip array-baserad analys av enterohemorragisk Escherichia coli (EHEC). Mikrobiella cell fabriker 7:29. på 2008.
  • Doublier S., Riganti ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts motståndet mot doxorubicin i mänskliga kolon cancer celler. Molekylär cancer forskning 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen m., Börjes son T., spliid N.H.H., Simons son M. (2008): metod utvärdering av Fusarium DNA-extraktion från mycelier och vete för Down-Stream realtids-PCR-kvantifiering och korrelation till mykotoxinhalten. Tid skrift av mikrobiologiska metoder 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): karakterisering av tillväxt beteendet hos Leishmania tarentolae – ett nytt uttrycks system för rekombinanta proteiner. Tidning grundläggande mikrobiologi 47, 2007. 384 – 393.
  • Ristola M., arpiainen S., saleem M. A., Mathieson P. W., Walesiska G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): reglering av Neph3 genen i podocytes-nyckel-roller av transkriptionsfaktorerna NF-κB och SP1. BMC molekylär biologi 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): genomtäckande spårning av unmethylated DNA alu repetitioner i normala och cancer celler. Nukleinsyror forskning Vol. 36, nr 3, 2008. på 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): den Histidine triad protein Hint1 triggers apoptos oberoende av dess enzymatiska aktivitet. Journalen för biologisk kemi. Vol. 281, nr. 37, 2006. 27356-27366.


Fakta Värt att veta

Ultraljud/akustisk kavitation skapar mycket intensiva krafter som främjar kristallisation och nederbörd processer (Klicka för att förstora!)

Ultraljud DNA klippning är baserad på akustisk kavitation och dess hydrodynamiska skjuvning krafter