Ultraljud DNA-klippning

Under DNA- och RNA-skjuvning fragmenteras långa DNA-molekyler i mindre bitar, ett avgörande steg för att förbereda prover för konstruktion av nästa generations sekvenseringsbibliotek (NGS). Ultraljuds-DNA-skjuvning använder akustiska kavitationskrafter för att bryta DNA eller RNA i fragment som sträcker sig från 100 bp till 5 kb. Denna metod möjliggör exakt kontroll över fragmentstorleken, vilket underlättar anpassning till önskad DNA-längd för optimala sekvenseringsresultat.

DNA-skjuvning med ultraljud

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade lösningar för DNA-, RNA- och kromatinskjuvning. Välj mellan en sond-typ ultraljudsapparater (t.ex. UP100H) för direkt ultraljudsbehandling med hjälp av en mikrospets, eller använd VialTweeeter eller ultraljud kopphorn för indirekt DNA-beredning av olika prover samtidigt. Hielscher erbjuder den perfekta enheten med tanke på dina behov: oavsett om du har 1 eller upp till 10 prover, volymer från mikroliter till litervolymer – Hielscher sonikatorer kommer att uppfylla dina krav för att förbereda DNA, RNA och kromatinfragment i rätt längd. Reproducerbarhet, enkel användning och exakt kontroll möjliggör ett tillförlitligt bibliotek för nästa generations sekvensering.
Till skillnad från enzymatisk DNA-fragmentering applicerar ultraljudsskjuvning rena mekaniska skjuvkrafter utan att tillsätta några kemikalier. Genom den exakta inställningen av processparametrar producerar ultraljudsskjuvning DNA-fragment med hög molekylvikt (plasmid och genomiskt DNA).
Renade nukleinsyror kan amplifieras före eller efter ett fragmenteringssteg.
Ultraljudsbehandling parametrar (effekt, pulscykel / skurar, tid och temperatur) kan kontrolleras säkert via programvaruinställningar.

Protokoll för ultraljud DNA-skjuvning

För analys av kromatinimmunoprecipitation

Kortfattat pläterades cellerna i skålar med en diameter på 60 mm (400 000 per skål) och transfekterades med RhoA siRNA (som beskrivits); Efter 72 timmar inkuberades de med formaldehyd (slutlig koncentration, 1 %) i 10 minuter vid 37 °C för att tvärbinda proteiner till DNA. Tvärbindningsreaktionen släcktes genom tillsats av en tiondels volym av 1,25 mol/L glycin, vilket gav en slutlig koncentration på 125 mmol/L. Cellerna tvättades två gånger med iskall PBS, återsuspenderades i radioimmunprecipitationsanalysbuffert [150 mmol/L NaCl, 1 % NP40, 0,5 % deoxikolat, 0,1 % SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] innehållande 1 mmol/l fenylmetylsulfonylfluorid, 1 Ag/ml aprotinin och 1 Ag/ml pepstatin A, och hölls på is i 30 minuter. Sedan, celllysat sonikerades på is med en Hielscher UP200S ultraljud sonikator (3 x 40 s, amplitud 40%, cykel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) tills tvärbundna kromatiner skjuvades för att ge DNA-fragment mellan 200 och 1 000 bp. En tiondel av hela lysatet användes för att kvantifiera mängden DNA som fanns i olika prover och ansågs vara “totalt inmatat DNA”. Supernatanterna inkuberades med laxspermie-DNA/protein agaros-50% slurry för att minska ospecifik bakgrund. Immunoprecipitering gjordes sedan över natten vid 4°C med 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) eller utan antikropp (negativ kontroll). Dessa supernatanter kompletterades med 5 mol/L NaCl och värmdes upp över natten vid 65 °C för att återställa protein-DNA-tvärbindningar. Immunkomplexen behandlades vidare med DNas- och RNas-fritt proteinas K, och DNA renades genom fenol/kloroformextraktion och etanolutfällning. PCR gjordes med specifika primers som motsvarar en sekvens inom promotorregionen för den humana iNOS-genen (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studier av EGFP-uttryck

För expressionsstudier odlades den rekombinanta stammen L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Tyskland) med genen för EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromosomalt ssu integrerat, i de olika medierna som beskrivits tidigare och kompletterades dessutom med 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under odlingen togs 1 ml prover, centrifugerades (2000 × g, 20°C, 10 min) och tvättades med 0,9% NaCl-lösning. Pelleten återsuspenderades i buffert (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) och sönderdelades genom sonifiering med ultraljudsprocessorn UP400S (tillförsel av energi ∼ 400 Ws). Cellrester avlägsnades genom centrifugering (6000 × g, 4°C, 5 min) och analyserades med natriumdodecylsulfat – polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) under reduktionsförhållanden enligt metoden av Laemmli (1970) med 12,5 % polyabralamidgeler. EGFP-uttryck undersöktes i agiterad kultur. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin immunprecipitering

Kromatinimmunoprecipitionsanalysen utfördes med hjälp av ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner med vissa modifieringar. Kortfattat var differentierade humana podocyter tvärbundna med 1% formaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur. Cellerna tvättades med iskall PBS och fixeringsreaktionen stoppades genom att 0,125 M glycin tillsattes under 5 minuter vid rumstemperatur. Cellerna tvättades igen med iskall PBS och skrapades ur skålen. Cellerna pelleterades genom centrifugering och återsuspenderades i lysbufferten. Efter centrifugering suspenderades pelleterade kärnor på nytt i skjuvbufferten, inkuberades på is i 30 minuter och kromatinet skjuvades genom ultraljudsbehandling, t.ex. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) vid 25 % effekt 5 pulser på 20 sekunder vardera på is i fragment på cirka 200–600 bp. Det klippta kromatinet centrifugerades sedan och supernatanten samlades in. För immunprecipitulationer inkuberades 60 μl kromatin med 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) eller NF-κB p50 (Abcam) antikroppar eller med kanin IgG (Zymed Laboratories), som en negativ kontroll, över natten vid 4 °C med försiktig rotation. Immunkomplex bundna till magnetiska kulor samlades in med hjälp av ett magnetiskt stativ, tvättades i stor utsträckning, och protein/DNA-tvärbindningarna vändes och DNA eluerades för PCR-analys i realtid. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA-förberedelse för analys av chipmatriser

Arrangemang av celllysat och extraherat DNA
Bakteriella pellets suspenderade i PBS till önskad slutlig koncentration behandlades med ultraljudsstörare UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) utrustad med en mikrospets MS1 (1 mm i diameter). Driftfrekvensen var 30 kHz och den effektiva uteffekten var 100 W. Under operationen kyldes proverna i ett isvattenbad, blandades och centrifugerades. Proverna användes för flödescytometristudier, medan proverna för senare hantering utsattes för en värmebehandling (95°C, 5 min). Råcelllysaten bearbetades med en blandning av fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1). En lika stor volym av denna blandning tillsattes till lysatprovet, lösningen virvlades kraftigt i 15 s och centrifugerades vid 15 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur (RT) runt 22 °C. Den översta vattenfasen som innehåller det genomiska DNA:t separerades noggrant och samlades in i ett nytt sterilt Eppendorf-rör.
Därefter sonikerades prover för att fragmentera DNA. Ultraljudsbehandlingen steg realiserades under samma förhållanden som beskrivits ovan. För att utvärdera fragmenteringseffekterna på det genomiska DNA:t analyserades proverna med hjälp av agarosgelelektrofores.
(…) Proverna ultraljudsbehandlade tidigare i 2,5 minuter utsattes för ett extraktionssteg efter värmebehandling och centrifugering. DNA som frigjordes extraherades två gånger med en fenol:kloroform:isoamylalkoholblandning och utsattes därefter för andra ultraljudsbehandling i 0 – 15 minuter. Agarosgelelektrofores användes för att bestämma storleksfördelningen av DNA som utsattes för ultraljudsfragmentering efter extraktion (fig. längst upp till höger). Mycket fragmenterat DNA var uppenbart från närvaron av ett DNA-utstryk snarare än högmolekylära viktband som eliminerades från prover ultraljudsbehandlade i 2,5 minuter eller längre. Längre ultraljudsbehandling minskade gradvis fragmentlängder till cirka 150 – 600 bp, och ultraljudsbehandling i 15 minuter ytterligare försämrade dessa fragment, vilket kan ses mest av den övre delen av utstryket. Således minskade den genomsnittliga DNA-fragmentstorleken gradvis med ultraljudstid och 5 minuters behandling gjorde det möjligt att erhålla storlekarna på DNA-fragment som är mest lämpliga för chiparrayanalyser. Äntligen etablerades DNA-analytberedningsförfarandet som omfattar de första 2 minuterna av ultraljudsbehandling, DNA-extraktion (2×) och efterföljande 5 minuters ultraljudsbehandling. (Basselet et al. 2008)

Kromatin immunprecipitering (ChIP)

HEK293-celler odlades enligt beskrivningen ovan och fixerades med 2 mM disuccinimidylglutarat i 45 minuter vid rumstemperatur. Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS. Kromatin tvärbands i 10 minuter vid rumstemperatur med 1 % (v/v) formaldehyd och tvättades två gånger med iskall PBS. Tvärbindningsreaktionen stoppades genom inkubation med glycin vid en slutlig koncentration av 0,125 M i 5 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation med trypsin skrapades cellerna från cellodlingsskålen och tvättades två gånger med PBS. Cellpelleten återsuspenderades i lysbuffert (5 mM rör, pH 8,0, 85 mM KCl och 0,5 % (v/v) Nonidet P-40), inkuberades på is i 10 minuter och homogeniserades med en Dounce homogenisator. Därefter pelleterades kärnorna genom centrifugering (3500 x g, 5 min, 4 °C) och återsuspenderades i kärnbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA och 1 % (w/v) SDS). Kärnor stördes av ultraljudsbehandling med tre 20-s pulser i en UP50H ultraljudsbehandling (Hielscher Ultraschall Technologie) vid en inställning av cykel 0,5 och amplitud 30%, vilket ger genomiska DNA-fragment med en bulkstorlek på 200 – 1000 bp. För ChIP späddes 50 g DNA 4-faldigt i immunprecipitationsbuffert (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 och 0,01 % (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analys av histonmodifiering med kromatinimmunprecipitering (ChIP)

Kortfattat, 6 x 10⁶ cellerna tvättades två gånger med PBS och tvärbands på odlingsplattan i 15 minuter vid rumstemperatur i närvaro av 0,5 % formaldehyd. Tvärbindningsreaktionen stoppades genom tillsats av 0,125 M glycin. Alla efterföljande steg utfördes vid 48 °C. Alla buffertar var förkylda och innehöll proteashämmare (Complete Mini, Roche). Cellerna tvättades två gånger med PBS och skrapades sedan. Insamlade pellets löstes upp i 1 ml lysbuffert (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) och sonikerades i ett kallt etanolbad i 10 cykler vid 100% amplitud med hjälp av en UP50H ultraljudsbehandling (Hielscher, Teltow, Tyskland). Kromatinfragmentering visualiserades i 1% agarosgel. Erhållna fragment låg i intervallet 200–500 pb. Lösligt kromatin erhölls genom centrifugering av de sonikerade proverna vid 14 000 g i 10 minuter vid 48 °C. Den lösliga fraktionen späddes 1:10 i spädningsbuffert (1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) och aliquoted och förvarades vid 80 °C fram till användning. (Rodriguez et al. 2008)