Ultraljud-DNA Shearing

• Under DNA- och RNA-shearing bryts DNA-molekyler i mindre bitar. DNA / RNA-fragmentering är ett av de viktiga provförberedande steg som krävs för att skapa bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS).
• Ultraljud DNA klippning använder krafter akustisk kavitation att bryta DNA eller RNA i bitar av 100 – 5kb BP.
• Ultraljud klippning möjliggör exakt DNA-fragmentering och anpassning till önskad DNA-längd.

DNA-shearing med ultraljud

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljud-baserade lösningar för DNA, RNA och kromatin klippning. Välj mellan en sond-typ ultrasonicators (t. ex. UP100H) för direkt ultraljudsbehandling med hjälp av en microtip, eller använda VialTweeeter eller ultraljud cuphorn för indirekta DNA beredning av olika prover samtidigt. Hielscher erbjuder den idealiska enheten med tanke på dina behov: vädret du har 1 eller upp till 10 prover, volymer från mikroliter till liter volymer – Hielscher ultraljud processorer finns tillgängliga för att uppfylla dina krav för att förbereda DNA, RNA och kromatin fragment på rätt längd. Reproducerbarhet, enkel användning och exakt kontroll möjliggör ett tillförlitligt bibliotek för nästa generations sekvensering.
I motsats till enzymatisk DNA-fragmentering gäller ultraljud klippning rena mekaniska skjuvning krafter utan att lägga till några kemikalier. Genom den exakta inställningen av process parametrar producerar ultraljud klippning hög molekyl vikt DNA-fragment (Plasmid och genomisk DNA).
Renade nukleinsyror kan förstärkas före eller efter en fragmentering steg.
Ultraljudsbehandling parametrar (makt, puls cykel/skurar, tid och temperatur) kan styras säkert via program vara inställningar.

Protokoll för ultraljud DNA klippning

För Chromatin Immunoprecipidationsanalys

Kort, celler var klädd i 60mm-diameter rätter (400 000 per fat) och transfekterade med RhoA siRNA (som beskrivs); efter 72 timmar inkuberades de med formaldehyd (slut koncentration, 1%) 10 min vid 37 ° c för att korsa länk proteiner till DNA. Den tvärkopplande reaktionen släcktes genom tillsats av en tiondel av 1,25 mol/L glycin, vilket gav 125 mmol/L slutlig koncentration. Cellerna tvättades två gånger med iskaffe PBS, återsuspenderade i radioimmunoprecipitationsbuffert [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxicholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] innehåll ande 1 mmol/L Fenylmetylsulfonylfluorid, 1 AG/mL aprotinin och 1 AG/mL Pepstatin A och hålls på is i 30 min. Sedan, cell cellysater var sonicated på isen med en Hielscher UP200S ultraljud sonikator (3 x 40 s, amplitud 40%, cykel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) tills tvär bunden kromatiner var klippt att ge DNA-fragment mellan 200 och 1 000 BP. En tiondel av hela lysatet användes för att kvantifiera den mängd DNA som finns i olika prover och betraktas som “totala DNA-insatsen”. Supernatants inkuberades med lax spermier DNA/protein agarose-50% flyt gödsel för att minska ospecifik bakgrund. Immunutfällning gjordes sedan över natten vid 4 ° c med 5 AG av anti-NF-nB P65 (Upstate) eller utan anti kropp (negativ kontroll). Dessa slå samman supernatanterna kompletterades med 5 mol/L NaCl och uppvärmd över natten på 65 ° c för att återställa protein-DNA Cross-Links. Immunokomplexen behandlades vidare med DNase-och RNase-Free proteinas K, och DNA renades genom fenol/kloroformextraktion och etanol fällning. PCR utfördes med specifika primrar som motsvarade en sekvens inom Promotorn för genen Human iNOS (P1 primer: 5 ¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ¶; P2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶). (Doublier et al., 2008)

Studier av EGFP-uttryck

För uttrycks studier, den rekombinanta stammen L. tarentolae P10:: F9Begfp 1.4 dBsat # 12 (Jena Bioscience, Tyskland) med genen för EGFP (förstärkt grönt fluorescerande protein), kromosomal SSU integrerat, odlades i olika medier som beskrivs tidigare och dessutom kompletterat med 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under odlingen togs 1 ml prover, centrifugerade (2000 × g, 20 ° c, 10 min) och tvättades med 0,9% NaCl lösning. Pellet var resuspenderade i buffert (20 mm Hepes, 5 mm EDTA, 2 mm DTT) och desinfieras av ultraljudsbehandling med ultraljud processorn UP400S (tillämpning av energi ∼ 400 ws). Cellrester avlägsnades genom centrifugering (6000 × g, 4 ° c, 5 min) och analyserades med natriumdodecylsulfat – polyakrylamidelektrofores (SDS-PAGE) under Reduktions förhållanden enligt metoden för Laemmli (1970) med 12,5% polyacralamidgel. EGFP-uttryck granskades i upprörda kulturen. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin immunnederbörd

Kromatin immunoprecipidationsanalysen utfördes med hjälp av ChIP-IT-^Tm Express (Active motif, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner med vissa modifieringar. Kortfattat, differentierade mänskliga podocyter var tvär bunden med 1% formaldehyd för 10 min i rums temperatur. Cellerna tvättades med iskallt PBS och fixeringreaktionen stoppades genom att tillsätta 0,125 M glycin i 5 min vid rums temperatur. Cellerna tvättades igen med iskalla PBS och skrapades från skålen. Cellerna pelleterades genom centrifugering och återsuspenderas i lyseringsbufferten. Efter centrifugering återsuspenderade pelleterade kärnor i skjuvning buffert, inkuberas på is i 30 min och kromatin var klippt av ultraljudsbehandling, t. ex. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) på 25% makt 5 pulser av 20 SEK vardera på isen i fragment av cirka 200-600 BP. Den utklippt kromatin centrifugerades sedan och supernatanten samlades in. För immunoprecipitationer inkuberades 60 μl kromatin med 1 μg SP1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB P65 (Abcam, Cambridge, UK) eller NF-κB P50 (Abcam) anti kroppar eller med kanin IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, Kalifornien, USA), som en negativ kontroll, över natten vid 4 ° c med skonsam rotation. Immunokomplex bundna till magnetiska pärlor samlades in med hjälp av ett magnetiskt stativ, tvättade i stor utsträckning, och protein/DNA-antipyridinantikropp var omvänd och DNA eluerade för realtids-PCR-analys. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA förberedelse för chip array analys

Placering av celllysater och extraherade DNAs
Bakterie pellets som suspenderade i PBS till önskad slutlig koncentration behandlades med ultraljud störande UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) utrustad med en microtip MS1 (1mm i diameter). Drift frekvensen var 30 kHz och den effektiva uteffekten var 100 W. Under operationen kyls proverna i ett isvattenbad, blandat och centrifugeras. Proverna utnyttjades för flödescytometri studier, medan för senare hantering, prover utsattes för en värmebehandling (95 ° c, 5 min). De obearbetade celllysatesna bearbetades med en blandning av fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1). En lika stor volym av denna blandning lades till det lysate provet, lösningen var vortexed kraftigt för 15 s och centrifugeras vid 15 000 x g för 2 min i rums temperatur (RT) runt 22 ° c. Den översta vatten fasen med genomiskt DNA avskiljdes omsorgsfullt och samlades in i ett nytt sterilt Eppendorf-rör.
Därefter var prover sonicated att fragmentera DNA. Ultraljudsbehandling steg realiserades på samma villkor som beskrivits ovan. För att utvärdera fragmenteringseffekterna på genomiskt DNA analyserades proverna med hjälp av AGA ros-gelelektrofores.
(…) Proverna sonicated tidigare för 2,5 min utsattes för ett extraktionssteg efter värmebehandling och centrifugering. DNA släpptes två gånger med en fenol: kloroform: isoamyl alkohol mix, och efteråt utsätts för andra ultraljudsbehandling för 0-15 min. agarose gel elektrofores användes för att bestämma storleken fördelningen av DNA utsätts för efter extraktion ultraljud fragmentering (Fig. längst upp till höger). Mycket fragmenterad DNA var uppenbar från närvaron av ett DNA-utstryk snarare än hög molekyl ära vikt band som eliminerades från prover sonicated för 2,5 min eller längre. Längre ultraljudsbehandling gradvis minskat fragment längder till cirka 150-600 BP, och ultraljudsbehandling för 15 min ytterligare degraderat dessa fragment, som kan ses mesta dels av den övre delen av utstryk. Sålunda, den genomsnittliga DNA-fragment storlek gradvis sjönk med ultraljud tid och 5 min behandling tillåtet att få storlekar av DNA-fragment mest lämpade för chip array analyser. Till, den DNA-analyten förberedelse förfarande som består av första 2 min av ultraljud behandling, DNA-extraktion (2 ×), och efterföljande 5 min sonication, fastställdes. (Basselet et al. 2008)

Kromatin Immunnederbörd (ChIP)

HEK293 celler var odlade som beskrivits ovan och fast med 2 mM disuccinimidyl-glutarat för 45 min i rums temperatur. Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS. Chromatin var tvär bunden för 10 min i rums temperatur med 1% (v/v) formaldehyd och tvättas två gånger med iskalla PBS. Den tvärkopplande reaktionen stoppades genom inkubation med glycin vid en koncentration på 0,125 M i 5 min vid rums temperatur. Efter inkubation med trypsin, var cellerna skrapas från cell kultur skålen och tvättas två gånger med PBS. Cellpelleten återsuspenderas i lyseringsbuffert (5 mM rör, pH 8,0, 85 mM KCl, och 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkuberas på is i 10 min, och homogeniseras med en Dounce Homogenisatorer. Därefter pelleterades kärnor genom centrifugering (3500 x g, 5 min, 4 ° c) och återsuspenderas i nuklei-buffert (50 mm Tris-HCl, pH 8,1, 10 mm EDTA och 1% (w/v) SDS). Nuclei stördes av ultraljudsbehandling med 3 20-s pulser i en UP50H någon sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) vid en inställning av cykel 0,5 och amplitud 30%, vilket ger genomisk DNA-fragment med en bulk storlek på 200-1000 BP. För ChIP, 50 g av DNA späddes 4-faldigt i immunutfällning buffert (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100, och 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histone modifiering analys av kromatin immunnederbörd (ChIP)

Kort, 6 x 10⁶ celler tvättades två gånger med PBS och tvär bunden på odlings plattan i 15 minuter vid rums temperatur i närvaro av 0,5% formaldehyd. Kors länkning reaktion stoppades genom att lägga till 0,125 M glycin. Alla efterföljande steg utfördes vid 48 ° c. Alla buffertar var pre-kylda och innehöll proteashämmare (Complete mini, Roche). Cellerna tvättades två gånger med PBS och sedan skrapade. Insamlade pellets Upplös tes i 1 ml lyseringsbuffert (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM tris pH 8) och var sonicated i en kall etanol bad för 10 cykler på 100% amplitud med hjälp av en UP50H någon sonikator (Hielscher, Teltow, Tyskland). Chromatin fragmentering visualiserades i 1% AGA ros gel. Erhållna fragment fanns i intervallet 200 – 500pb. Löslig kromatin erhölls genom centrifugering av sonicated prover på 14000g för 10 min vid 48 ° c. Den lösliga fraktionen späddes 1/10 i spädnings buffert (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM tris pH 8, 150 mM NaCl) sedan aliciterad och förvaras vid 80 ° c till användning. (Rodriguez et al. 2008)