DNA-fragmentering med ultraljud

Vid skjuvning av DNA och RNA fragmenteras långa DNA-molekyler till mindre delar, vilket är ett avgörande steg i provberedningen inför konstruktion av bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS). DNA-fragmentering med ultraljud utnyttjar akustiska kavitationskrafter för att bryta ned DNA eller RNA till fragment från 100 bp till 5 kb. Metoden möjliggör exakt kontroll av fragmentstorleken, vilket underlättar anpassning till önskad DNA-längd för optimala sekvenseringsresultat.

DNA-fragmentering genom ultraljudsbehandling

Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudsbaserade lösningar för skjuvning av DNA, RNA och kromatin. Välj en ultraljudsapparat av sondtyp (t.ex. UP100H) för direkt ultraljudsbehandling med en mikrospets, eller använd VialTweeeter eller en ultraljudscuphorn för indirekt DNA-beredning av flera olika prover samtidigt. Hielscher erbjuder den idealiska apparaten utifrån dina behov: oavsett om du har 1 eller upp till 10 prover, med volymer från mikroliter till liter, uppfyller Hielschers ultraljudsapparater dina krav på att framställa DNA-, RNA- och kromatinfragment med rätt längd. Reproducerbarhet, enkel användning och exakt kontroll möjliggör ett tillförlitligt bibliotek för nästa generations sekvensering.
Till skillnad från enzymatisk DNA-fragmentering använder skjuvning med ultraljud rent mekaniska skjuvkrafter utan tillsats av kemikalier. Genom exakt inställning av processparametrarna ger skjuvning med ultraljud DNA-fragment med hög molekylvikt (plasmid-DNA och genomiskt DNA).
Renade nukleinsyror kan amplifieras före eller efter ett fragmenteringssteg.
Parametrarna för ultraljudsbehandlingen (effekt, pulscykel / pulståg, tid och temperatur) kan styras säkert via programvaruinställningar.

Protokoll för DNA-fragmentering med ultraljud

För kromatinimmunoprecipitationsanalys

I korthet såddes celler i skålar med en diameter på 60mm (400 000 per skål) och transfekterades med RhoA-siRNA (enligt beskrivningen); efter 72 h inkuberades de med formaldehyd (slutkoncentration 1%) i 10 min vid 37°C för att tvärbinda proteiner till DNA. Tvärbindningsreaktionen stoppades genom tillsats av en tiondels volym 1,25 mol/L glycin, vilket gav en slutkoncentration på 125 mmol/L. Cellerna tvättades två gånger med iskall PBS, resuspenderades i buffert för radioimmunoprecipitationsanalys [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxicholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] innehållande 1 mmol/L fenylmetylsulfonylfluorid, 1 Ag/mL aprotinin och 1 Ag/mL pepstatin A, och hölls på is i 30 min. Därefter ultraljudsbehandlades celllysaten på is med en ultraljudsapparat av modellen Hielscher UP200S (3 x 40 s, amplitud 40%, cykel 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) tills tvärbundet kromatin hade skjuvats till DNA-fragment mellan 200 och 1 000 bp. En tiondel av det totala lysatet användes för att kvantifiera mängden DNA i olika prover och betraktades som ”totalt ingående DNA”. Supernatanterna inkuberades med en 50% suspension av laxspermie-DNA/proteinagaros för att minska ospecifik bakgrund. Immunoprecipitation utfördes därefter över natten vid 4°C med 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) eller utan antikropp (negativ kontroll). Dessa supernatanter kompletterades med 5 mol/L NaCl och värmdes över natten vid 65°C för att häva tvärbindningarna mellan protein och DNA. Immunkomplexen behandlades därefter med DNas- och RNas-fritt proteinas K, och DNA renades genom fenol-/kloroformextraktion och etanolutfällning. PCR utfördes med specifika primrar motsvarande en sekvens inom promotorregionen i den humana iNOS-genen (p1-primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studier av EGFP-uttryck

För expressionsstudier odlades den rekombinanta stammen L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Tyskland), med genen för EGFP (förstärkt grönt fluorescerande protein) integrerad i kromosomalt ssu, i de olika medierna enligt tidigare beskrivning och med ytterligare tillsats av 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under odlingen togs prover om 1 ml, som centrifugerades (2000 × g, 20°C, 10 min) och tvättades med 0,9% NaCl-lösning. Pelleten resuspenderades i buffert (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) och sönderdelades genom ultraljudsbehandling med ultraljudsprocessorn UP400S (tillförd energi ∼ 400 Ws). Cellrester avlägsnades genom centrifugering (6000 × g, 4°C, 5 min) och analyserades med natriumdodecylsulfat–polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) under reducerande förhållanden enligt Laemmlis metod (1970) med 12,5% polyakrylamidgeler. EGFP-uttrycket undersöktes i skakad kultur. (Fritsche et al. 2007)

Kromatinimmunoprecipitation

Analysen med kromatinimmunoprecipitation utfördes med ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar med vissa modifieringar. I korthet tvärbands differentierade humana podocyter med 1% formaldehyd i 10 min vid rumstemperatur. Cellerna tvättades med iskall PBS och fixeringsreaktionen stoppades genom tillsats av 0,125 M glycin i 5 min vid rumstemperatur. Cellerna tvättades återigen med iskall PBS och skrapades loss från skålen. Cellerna pelleterades genom centrifugering och resuspenderades i lysbufferten. Efter centrifugering resuspenderades de pelleterade cellkärnorna i fragmenteringsbufferten, inkuberades på is i 30 min och kromatinet fragmenterades genom ultraljudsbehandling med t.ex. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) vid 25% effekt med 5 pulser om 20 sekunder vardera på is till fragment om cirka 200–600 bp. Det fragmenterade kromatinet centrifugerades sedan och supernatanten samlades upp. För immunoprecipitationerna inkuberades 60 μl kromatin med 1 μg antikroppar mot Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Storbritannien) eller NF-κB p50 (Abcam), eller med kanin-IgG (Zymed Laboratories) som negativ kontroll, över natten vid 4°C under försiktig rotation. Immunkomplex bundna till magnetiska kulor samlades upp med ett magnetstativ och tvättades noggrant, varefter protein/DNA-tvärbindningarna löstes upp och DNA eluerades för realtids-PCR-analys. (Ristola et al. 2009)

Beredning av EHEC-DNA för chiparrayanalys

Iordningställande av celllysat och extraherat DNA
Bakteriepelletar suspenderade i PBS till önskad slutkoncentration behandlades med ultraljudsdisruptorn UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) utrustad med en mikrospets MS1 (1mm i diameter). Arbetsfrekvensen var 30 kHz och den effektiva uteffekten var 100 W. Under behandlingen kyldes proverna i ett isvattenbad, blandades och centrifugerades. Proverna användes för flödescytometriska studier, medan prover för senare hantering värmebehandlades (95°C, 5 min). De råa cellysaten behandlades med en blandning av fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1). En lika stor volym av denna blandning tillsattes till lysatprovet, lösningen vortexblandades kraftigt i 15 s och centrifugerades vid 15 000 x g i 2 min vid rumstemperatur (RT), omkring 22°C. Den övre vattenfasen som innehöll genomiskt DNA separerades försiktigt och samlades upp i ett nytt sterilt Eppendorf-rör.
Därefter ultraljudsbehandlades proverna för att fragmentera DNA:t. Ultraljudsbehandlingen genomfördes under samma förhållanden som beskrivits ovan. För att utvärdera fragmenteringens effekter på det genomiska DNA:t analyserades proverna med agarosgelelektrofores.
(…) De prover som tidigare ultraljudsbehandlats i 2,5 min genomgick ett extraktionssteg efter värmebehandling och centrifugering. Frigjort DNA extraherades två gånger med en blandning av fenol:kloroform:isoamylalkohol och genomgick därefter en andra ultraljudsbehandling i 0 – 15 min. Agarosgelelektrofores användes för att bestämma storleksfördelningen hos DNA som utsatts för ultraljudsfragmentering efter extraktion (figuren uppe till höger). Förekomsten av ett diffust DNA-utstryk i stället för band med hög molekylvikt visade att DNA:t var kraftigt fragmenterat; dessa band försvann från prover som ultraljudsbehandlats i 2,5 min eller längre. Längre ultraljudsbehandling minskade gradvis fragmentlängderna till cirka 150 – 600 bp, och ultraljudsbehandling i 15 min bröt ned dessa fragment ytterligare, vilket främst kan ses i den övre delen av utstryket. Den genomsnittliga DNA-fragmentstorleken minskade således gradvis med ultraljudsbehandlingstiden, och behandlingen i 5 min gjorde det möjligt att erhålla de DNA-fragmentstorlekar som var bäst lämpade för chiparrayanalyser. Slutligen fastställdes ett förfarande för beredning av DNA-analyten som omfattade först 2 min ultraljudsbehandling, DNA-extraktion (2×) och därefter 5 min ultraljudsbehandling. (Basselet et al. 2008)

Kromatinimmunoprecipitation (ChIP)

HEK293-celler odlades enligt beskrivningen ovan och fixerades med 2 mM disuccinimidylglutarat i 45 min vid rumstemperatur. Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS. Kromatin tvärbands i 10 min vid rumstemperatur med 1% (v/v) formaldehyd och tvättades två gånger med iskall PBS. Tvärbindningsreaktionen stoppades genom inkubation med glycin vid en slutkoncentration på 0,125 M i 5 min vid rumstemperatur. Efter inkubation med trypsin skrapades cellerna loss från cellodlingsskålen och tvättades två gånger med PBS. Cellpelleten resuspenderades i lysbuffert (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl och 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkuberades på is i 10 min och homogeniserades med en Dounce-homogenisator. Därefter pelleterades cellkärnorna genom centrifugering (3500 x g, 5 min, 4 °C) och resuspenderades i kärnbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA och 1% (w/v) SDS). Cellkärnorna sönderdelades genom ultraljudsbehandling med tre pulser på vardera 20 s i en UP50H-sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) med cykelinställningen 0,5 och amplituden 30%, vilket gav genomiska DNA-fragment huvudsakligen i storleksintervallet 200 – 1000 bp. För ChIP späddes 50g DNA 4 gånger i immunoprecipitationsbuffert (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 och 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analys av histonmodifieringar med kromatinimmunoprecipitation (ChIP)

I korthet: 6 x 10⁶ celler tvättades två gånger med PBS och tvärbands på odlingsplattan i 15 min vid rumstemperatur i närvaro av 0,5% formaldehyd. Tvärbindningsreaktionen stoppades genom tillsats av 0,125 M glycin. Alla efterföljande steg utfördes vid 48°C. Alla buffertar var förkylda och innehöll proteashämmare (Complete Mini, Roche). Cellerna tvättades två gånger med PBS och skrapades sedan loss. De insamlade pelletarna löstes upp i 1 ml lysbuffert (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) och ultraljudsbehandlades i ett kallt etanolbad under 10 cykler vid 100% amplitud med en ultraljudsapparat UP50H (Hielscher, Teltow, Tyskland). Kromatinfragmenteringen visualiserades i 1% agarosgel. De erhållna fragmenten låg i intervallet 200–500pb. Lösligt kromatin erhölls genom centrifugering av de ultraljudsbehandlade proverna vid 14 000g i 10 min vid 48°C. Den lösliga fraktionen späddes 1/10 i spädningsbuffert (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), delades sedan upp i alikvoter och förvarades vid 80°C fram till användning. (Rodriguez et al. 2008)