Provberedning med ultraljud för ELISA-analyser

Analyser som ELISA används i stor utsträckning för in vitro-diagnostik, detektion av sjukdomsrelaterade proteiner och kvalitetskontroll (t.ex. övervakning av livsmedelsallergener). Provberedning med ultraljud är en snabb, tillförlitlig och reproducerbar teknik för att lysera celler och isolera intracellulära proteiner, DNA, RNA och organeller. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudslösningar för bekväm beredning av enskilda prover, flera provflaskor samt för mikrotiterplattor och 96-brunnsplattor.

ELISA – enzymkopplad immunadsorberande analys

ELISA står för enzymkopplad immunadsorberande analys och är en allmänt använd biokemisk analysteknik inom kategorin ligandbindningsanalyser. Vid ELISA tillsätts ett vätskeprov till en stationär fast fas med särskilda bindningsegenskaper. Vanligtvis appliceras den stationära fasta fasen som en beläggning på en brunnsplatta eller ELISA-platta. Därefter tillsätts olika flytande reagenser i tur och ordning, följt av inkubering och tvättning, så att en optisk förändring (t.ex. färgutveckling genom produkten från en enzymatisk reaktion) slutligen uppstår i den slutliga vätskan i brunnen. Den optiska förändringen gör det möjligt att mäta mängden analyt genom en så kallad kvantitativ ”avläsning”. För den kvantitativa avläsningen används en spektrofotometer, fluorometer eller luminometer för att detektera och mäta intensiteten hos det transmitterade ljuset. Detektionskänsligheten påverkas av signalförstärkningen under analysreaktionerna. Eftersom enzymreaktioner är väl undersökta och tillförlitliga förstärkningsprocesser används enzymer för att skapa signalen. Enzymerna kopplas till detektionsreagenserna i fasta proportioner för att möjliggöra noggrann kvantifiering, vilket också förklarar benämningen ”enzymkopplad” immunadsorberande analys.
Eftersom ELISA-analyser utförs i mikrotiterplattor / 96-brunnsplattor är ELISA känd som en plattbaserad analysteknik och används t.ex. inom klinisk in vitro-diagnostik, forskning och läkemedelsutveckling för att detektera och kvantifiera antikroppar, peptider, proteiner och hormoner.
ELISA-tekniken används ofta som ett diagnostiskt verktyg inom medicin, bioteknik och växtpatologi och är också en viktig kvalitetskontrollmetod inom flera branscher.

Provberedning med ultraljud före ELISA

Innan ELISA-analysen kan utföras kräver proverna beredningssteg såsom celllys och extraktion av intracellulära proteiner, DNA, RNA etc. Fördelen med celllys och proteinisolering med ultraljud är den höga effektiviteten, tillförlitligheten och reproducerbarheten. Alla dessa faktorer är viktiga för att uppnå diagnostik och forskningsresultat av hög kvalitet

Protokoll för celllys med ultraljud före ELISA

• För cellkulturer: Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 270 x g i en mikrocentrifug före celllysen med ultraljud. Avlägsna supernatanten genom aspiration och resuspendera cellerna i 30 – 100 μL RIPA-buffert. Inkubera därefter cellpelleten på is i 30 min.
• Nu är cellprovet klart för ultraljudslys:
  Använd en ultraljudsapparat av probtyp (t.ex. UP200Ht med S26d2-prob) eller en ultraljudsapparat för flera prover (t.ex. VialTweeter för samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 provflaskor eller UIP400MPT för mikrotiterplattor / 96-brunnsplattor), beroende på hur många prover du behöver bereda.
  För ultraljudsbehandling av ett enskilt prov med prob placeras cellerna i 1,5 mL mikrocentrifugrör.
• Förinställ ultraljudsbehandlingens varaktighet, den totala energitillförseln, cykelläget och/eller temperaturgränserna i ultraljudsapparatens digitala meny. Detta säkerställer mycket tillförlitlig ultraljudsbehandling och repeterbarhet.
• För in sonotroden och slå på ultraljudsapparaten. För försiktigt ultraljudssondens mikrospets genom provet för att ultraljudsbehandla provet jämnt.
  För de flesta celler är ultraljudslysen slutförd efter 2–4 cykler med 10 sec ultraljudsbehandling vardera.
• Ta bort sonotroden från provet efter ultraljudsbehandlingen. Proverna bör inkuberas på is i 5 min. Centrifugera därefter vid 10 000 x g i 20 min för att samla cellresterna i en pellet. Överför supernatanterna till ett nytt mikrocentrifugrör. Märk analyterna och förvara dem vid -20°C.
• Ultraljudssonotroden kan rengöras genom att torka av den noggrant med alkohol eller ultraljudsbehandla den i en bägare fylld med alkohol, t.ex. 70% etanol. Alla ultraljudssonder av titan kan autoklaveras.

• Skölj vävnaden med iskall PBS (0,01M, pH=7,4) för att noggrant avlägsna överskott av hemolyserat blod.
• Väg vävnaden (njure, hjärta, lunga, mjälte osv.) och finfördela den i små bitar som homogeniseras i PBS. Den volym PBS som krävs beror på vävnadens vikt. Som tumregel kräver 1g vävnad cirka 9mL PBS. Det rekommenderas att tillsätta någon proteashämmare till PBS. (Alternativt kan RIPA eller hypoton lysbuffert som innehåller en blandning av proteas- och fosfatashämmare användas.)
• Beroende på vävnadens storlek kan en kort vortexbehandling (cirka 1–2 min. i pulser om 15 sec) vara till hjälp för att förbehandla vävnaden.
• Montera en mikrospets, t.ex. S26d2, på ultraljudsapparaten. Placera provröret med vävnaden i ett isbad.
• Ultraljudsbehandla provet med ultraljudsapparaten, t.ex. UP200St (80% amplitud), i 1 min. i pulsläge (15sec på, 15sec paus). Håll provet i isbadet.
• Homogenaten centrifugeras därefter för att erhålla specifika fraktioner (cytosoliska, nukleära, mitokondriella eller lysosomala) i syfte att anrika proteinet för analys. Genom att centrifugera provet i 5 minuter vid 5000×g erhålls supernatanten.

Tillförlitlig temperaturkontroll under ultraljudsbehandling

Temperaturen är en avgörande faktor som påverkar processen och är särskilt viktig vid behandling av biologiska prover, t.ex. för att förhindra termisk nedbrytning av proteiner. Liksom alla mekaniska provberedningstekniker alstrar ultraljudsbehandling värme. Provernas temperatur kan dock kontrolleras väl när apparater från Hielscher Ultrasonics används. Vi presenterar olika alternativ för att övervaka och reglera provernas temperatur under preanalytisk beredning med en ultraljudsapparat av sondtyp eller VialTweeter.

1. Övervakning av provtemperaturen: Alla digitala ultraljudsprocessorer från Hielscher är utrustade med intelligent programvara och en anslutningsbar temperaturgivare. Anslut temperaturgivaren till ultraljudsapparaten (t.ex. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor) och för in temperaturgivarens spets i ett av provrören. Via den digitala pekskärmen i färg kan du ställa in ett specifikt temperaturintervall för ultraljudsbehandlingen av provet i ultraljudsprocessorns meny. Ultraljudsapparaten stannar automatiskt när maxtemperaturen uppnås och pausar tills provtemperaturen har sjunkit till det lägre värdet i det inställda temperaturintervallet ∆. Därefter startar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
2. För ultraljudsapparaten VialTweeter för flera prover kan titanblocket som håller provrören förkylas. Placera VialTweeter-blocket (endast sonotroden utan ultraljudsomvandlare!) i kylskåp eller frys för att förkyla titanblocket, vilket hjälper till att fördröja temperaturökningen i provet. Om möjligt kan även själva provet förkylas.
3. Använd ett isbad eller torris för kylning under ultraljudsbehandlingen. Placera provröret eller provrören i ett isbad under ultraljudsbehandlingen. För VialTweeter använder du en grund bricka fylld med torris och placerar VialTweeter på torrisen så att värmen snabbt kan avledas.

Kunder över hela världen använder Hielschers ultraljudsapparater av sondtyp samt enheterna VialTweeter och UIP400MTP för ultraljudsbehandling av flera prover i sitt dagliga provberedningsarbete i biologiska, biokemiska, medicinska och kliniska laboratorier. Med Hielscher-processorernas intelligenta programvara och temperaturreglering regleras temperaturen tillförlitligt och värmeinducerad nedbrytning av proverna undviks. Ultraljudsbaserad provberedning med Hielschers ultraljudslösningar ger mycket tillförlitliga och reproducerbara resultat!
Läs mer om ultraljudsbehandling med hög provgenomströmning med hjälp av ultraljudsapparaten UIP400MTP för analys i flerbrunnsplattor!