Ultraljudsprovförberedelse för ELISA-analyser

Analyser som ELISA används i stor utsträckning för in vitro-diagnostik, sjukdomsrelaterad proteindetektion och kvalitetskontroll (t.ex. övervakning av livsmedelsallergener). Ultraljud provberedning är en snabb, pålitlig och reproducerbar teknik för att lysera cell och isolera intracellulära proteiner, DNA, RNA och organeller. Hielscher Ultrasonics erbjuder olika ultraljudslösningar för bekväm beredning av enstaka prover, flera ampuller samt för mikrotiterplattor och 96-brunnsplattor.

ELISA – Enzymkopplad immunadsorberande analys

ELISA står för enzymkopplad immunadsorberande analys och är en allmänt använd biokemisk analysteknik i kategorin ligandbindande analyser. I ELISA tillsätts ett vätskeprov till en stationär fast fas med speciella bindningsegenskaper. Normalt appliceras den stationära fasta fasen som beläggning på en brunnsplatta eller ELISA-platta. Därefter tillsätts olika flytande reagenser sekventiellt, inkuberas och tvättas, så att slutligen en optisk förändring (t.ex. färgutveckling av produkten av en enzymatisk reaktion) inträffar i den slutliga vätskan i brunnen. Den optiska förändringen gör det möjligt att mäta mängden analyt med en så kallad kvantitativ “läsning". För den kvantitativa avläsningen används en spektrofotometer, fluorometer eller luminometer för att detektera och mäta intensiteten hos det överförda ljuset. Detektionens känslighet påverkas av förstärkningen av signalen under de analytiska reaktionerna. Eftersom enzymreaktioner är väl undersökta och tillförlitliga amplifieringsprocesser, används enzymer för att skapa signalen. Enzymerna är kopplade till detektionsreagenserna i fasta proportioner för att möjliggöra noggrann kvantifiering, vilket också förklarar namnet "enzymkopplad" immunadsorberande analys.
Eftersom ELISA-analyser utförs i mikrotiterplattor / 96-brunnsplattor är det känt som plattbaserad analysteknik och används t.ex. inom klinisk in vitro-diagnostik, forskning, läkemedelsutveckling etc. för att detektera och kvantifiera antikroppar, peptider, proteiner och hormoner.
ELISA-tekniken används ofta som ett diagnostiskt verktyg inom medicin, bioteknik, växtpatologi och är också en viktig kvalitetskontrollmätning inom flera branscher.

Ultraljudsprovförberedelse före ELISA

Innan ELISA-analysen kan utföras kräver proverna steg av förberedelse såsom celllys och extraktion av intracellulära proteiner, DNA, RNA etc. Fördelen med ultraljudscelllys och proteinisolering är dess höga effektivitet, tillförlitlighet och reproducerbarhet. Alla dessa faktorer är viktiga för att få diagnos och forskningsresultat av hög kvalitet

Protokoll för pre-ELISA ultraljudscelllys

• För cellkulturer: Före ultraljudscelllysen, centrifugera cellerna i 5 minuter vid 270 x g i en mikrocentrifug. Avlägsna supernatanten genom aspiration och återsuspendera cellerna i 30 – 100 μl RIPA-buffert. Inkubera sedan cellpelleten på is i 30 minuter.
• Nu är cellprovet redo för ultraljudslys:
  Använd en ultraljudsapparat av sondtyp (t.ex. UP200Ht med S26d2-sond) eller en ultraljudsenhet med flera prover (t.ex. VialTweeter för samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 injektionsflaskor eller UIP400MPT för mikrotiterplattor / 96-brunnsplattor) beroende på mängden prover du behöver förbereda.
  För sond-typ ultraljudsbehandling av ett enda prov, placera cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
• Förinställ din ultraljudstid, total energitillförsel, cykelläge och/eller temperaturgränser i den digitala menyn på ultraljudaren. Detta säkerställer mycket tillförlitlig ultraljudsbehandling och repeterbarhet.
• Sätt in sonotroden och slå på ultraljudsapparaten. Flytta försiktigt mikrospetsen på ultraljudssonden genom provet för att sonikera provet enhetligt.
  För de flesta celler, ultraljud lys kommer att slutföras efter 2 -4 cykler av 10 sec ultraljudsbehandling.
• Efter ultraljudsbehandling, ta bort sonotrode från provet. Proverna ska inkuberas på is i 5 minuter. Centrifugera sedan vid 10 000 x g i 20 minuter för att pelletera skräpet. Överför supernatanterna till ett nytt mikrocentrifugrör. Märk analyterna och förvara dem vid -20 °C.
• Ultraljudet sonotrode kan rengöras genom att torka av det ordentligt med alkohol eller sonikerat i en bägare fylld med alkohol, t.ex. 70% etanol. Alla ultraljudssonder tillverkade av titan är autoklaverbara.

• Skölj vävnaden med iskall PBS (0,01 M, pH = 7,4) för att avlägsna överflödigt hemolysblod noggrant.
• Väg vävnaden (njure, hjärta, lunga, mjälte etc.) och macerera den i små bitar, som homogeniseras i PBS. Volymen PBS som krävs är relaterad till vävnadens vikt. En tumregel är att 1 g vävnad kräver ca 9 ml PBS. Det rekommenderas att lägga till en del proteashämmare till PBS. (RIPA eller hypoton lysbuffert innehållande proteas och fosfatashämmare kan användas alternativt.)
• Beroende på vävnadens storlek kan en kort virvelbehandling (ca 1-2 minuter på 15 sek. pulser) vara till hjälp för att förbehandla vävnaden.
• Montera en mikrospets, t.ex. S26d2, på din ultraljudsapparat. Placera provröret med näsduken i ett isbad.
• Ultraljudsbehandla provet med din ultraljudsapparat, t.ex. UP200St (80% amplitud) i 1 minut i pulsläge (15 sek på, 15 sek paus). Förvara provet i isbadet.
• Homogenaten centrifugeras sedan för att erhålla specifika pooler (cytosoliska, nukleära, mitokondriella eller lysosomala) för att berika proteinet för analys. Genom att centrifugera provet i 5 minuter vid 5000×g erhålls supernatanten.

Pålitlig temperaturkontroll under ultraljudsbehandling

Temperatur är en avgörande processpåverkande faktor som är särskilt viktig för behandling av biologiska prover, t.ex. för att förhindra termisk nedbrytning av proteiner. Som alla mekaniska provberedningstekniker skapar ultraljudsbehandling värme. Temperaturen på proverna kan dock kontrolleras väl när du använder Hielscher Ultrasonics-enheter. Vi presenterar dig olika alternativ för att övervaka och kontrollera temperaturen på dina prover samtidigt som du förbereder dem med en sond-typ ultraljud eller VialTweeter pre-analytiskt.

1. Övervakning av provtemperaturen: Alla Hielscher digitala ultraljudsprocessorer är utrustade med en intelligent programvara och en pluggbar temperatursensor. Anslut temperatursensorn till ultraljudsenheten (t.ex. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Ultraljudsbehandling med flera brunnar för plattor UIP400MTP) och sätt in spetsen på temperatursensorn i ett av provrören. Via digital färgad pekskärm kan du ställa in i menyn på ultraljudsprocessorn ett specifikt temperaturområde för ditt prov ultraljudsbehandling. Ultraljudaren stannar automatiskt när maxtemperaturen uppnås och pausar tills provtemperaturen är nere på det lägre värdet på den inställda temperaturen ∆. Då börjar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
2. När det gäller ultraljudsmultiprovenheten VialTweeter kan titanblocket, som håller provrören, förkylas. Sätt VialTweeter-blocket (endast sonotrode utan givare!) i kylen eller frysen för att förkyla, titanblocket hjälper till att skjuta upp temperaturökningen i provet. Om möjligt kan själva provet också förkylas.
3. Använd ett isbad eller torris för att svalna under ultraljudsbehandling. Placera dina provrör under ultraljudsbehandling i ett isbad. För VialTweeter, använd en grund bricka fylld med torris och placera VialTweeter på torrisen så att värmen snabbt kan skingras.

Kunder över hela världen använder Hielscher sond-typ ultraljudsapparater samt multi-prov ultraljudsbehandlingsenheter VialTweeter och UIP400MTP för deras dagliga provberedningsarbete i biologiska, biokemiska, medicinska och kliniska laboratorier. Den intelligenta programvaran och temperaturkontrollen hos Hielscher-processorerna, temperaturen kontrolleras på ett tillförlitligt sätt och värmeinducerad provnedbrytning undviks. Ultraljudsprovberedning med Hielscher ultraljudslösningar ger mycket tillförlitliga och reproducerbara resultat!
Läs mer om ultraljudsbehandling med hög genomströmning med hjälp av multi-well platta sonikator UIP400MTP för analyser!