Ultraljud Prov Prep för ELISA analyser

Elisa – Enzym-Linked Immunosorbent Assay

ELISA står för enzym-linked immunosorbent assay och är en allmänt använd biokemisk analys teknik av kategorin ligand-bindande analyser. I ELISA tillsätts ett vätskeprov på en stationär fast fas med speciella bindningsegenskaper. Normalt appliceras den stationära fasta fasen som beläggning på en brunnsplatta eller ELISA-platta. Sedan tillsätts olika flytande reagenser sekventiellt, inkuberas och tvättas, så att slutligen en optisk förändring (t.ex. färgutveckling genom produkten av en enzymatisk reaktion) sker i den slutliga vätskan i brunnen. Den optiska förändringen gör det möjligt att mäta mängden av analyten genom en så kallad kvantitativ “läsa". För den kvantitativa avläsningen används en spektrofotometer, fluorometer eller luminometer för att detektera och mäta det överförda ljusets intensitet. Detektionens känslighet påverkas av förstärkningen av signalen under de analytiska reaktionerna. Eftersom enzymreaktioner är väl undersökta och tillförlitliga amplifieringsprocesser, används enzymer för att skapa signalen. Enzymerna är kopplade till detektionsreagenserna i fasta proportioner för att möjliggöra korrekt kvantifiering, vilket också förklarar namnet "enzymlänkad" immunsorbentanalys.
Som ELISA analyser utförs i mikrotiter plattor / 96-brunn plattor, Det är känt som plåt-baserad analys teknik och används t ex i klinisk in-vitro-diagnostik, forskning, läkemedelsutveckling etc. för att upptäcka och kvantifiera antikroppar, peptider, proteiner, och hormoner.
ELISA-tekniken används ofta som ett diagnostiskt verktyg inom medicin, bioteknik, växtpatologi och är också en viktig kvalitetskontrollmätning inom flera branscher.

Ultraljud Prov Prep innan ELISA

Innan ELISA-analysen kan utföras kräver proverna steg av beredning sådan celllys och extraktion av intracellulära proteiner, DNA, RNA etc. Fördelen med ultraljud cell lysis och protein isolering är dess höga effektivitet, tillförlitlighet och reproducerbarhet. Alla dessa faktorer är viktiga för att få diagnostisk och forskningsresultat av hög kvalitet

Protokoll för Pre-ELISA UltraljudsCell Lysis

• För CellKulturer: Innan ultraljud cell lysis, centrifug celler för 5 minuter vid 270 x g i en microcentrifug. Avlägsna supernatanten genom aspiration och återanvänd celler i 30 – 100 μL RIPA-buffert. Sedan, ruva cellen pelleten på is i 30 min.
• Nu, cellprovet är redo för ultraljud lys:
  Använd en ultraljudsator av sondtyp (t.ex. Uf200 ः t med S26d2-sond) eller en ultraljuds flerprovsenhet (t.ex. VialTweeter för samtidig ultraljudsbehandling av upp till 10 injektionsflaska eller UIP400MPT för mikrotiterplattor / 96-brunnsplattor) beroende på den mängd prover du behöver för att förbereda.
  För den probe-typ ultraljudsbehandling av ett enda prov, placera cellerna i 1,5 mL mikrocentrifugrör.
• Förinställda din ultraljudslängd, total energiinmatning, cykelläge och/eller temperaturgränser i ultrasonicatorns digitala meny. Detta säkerställer mycket tillförlitlig ultraljudsbehandling och repeterbarhet.
• Inset sonotrode och slå på ultraljud enheten. Flytta försiktigt mikro-spetsen av ultraljudssonden genom provet för att sonikera provet jämnt.
  För de flesta celler, ultraljud lys kommer att slutföras efter 2 -4 cykler av 10 sek ultraljudsbehandling.
• Efter ultraljudsbehandling, ta bort sonotrode från provet. Proverna ska inkuberas på is i 5 min. Sedan centrifug vid 10.000 x g för 20 min att pelleten skräp. Överför supernatanterna till ett nytt mikrocentrifugrör. Märk analyterna och förvara vid -20°C.
• Ultraljudssonotroden kan rengöras genom att torka av den ordentligt med alkohol eller sonikera i en bägare fylld med alkohol, t ex 70% etanol. Alla ultraljud sonder gjorda av titan är autoklaverbara.

För Vävnadshomogenater:

• Skölj vävnaden med iskall PBS (0,01M, pH=7,4) för att avlägsna överflödigt hemolysblod noggrant.
• Väg vävnaden (njure, hjärta, lunga, mjälte etc.) och macerate det i små bitar, som homogeniseras i PBS. Den volym PBS som krävs är relaterad till vävnadens vikt. Som en tumregel kräver 1g vävnad ca. 9mL PBS. Det rekommenderas att lägga till några proteashämmare till PBS. (RIPA eller hypotonisk lysbuffert som innehåller proteas och fosfatashämmare cocktail kan användas alternativt.)
• Beroende på vävnadsstorleken kan en kort virvelbehandling (ca 1-2 min. i 15 sek. pulser) vara till hjälp för att förbehandla vävnaden.
• Montera en mikro-tip, t ex S26d2, till din ultraljudsator. Placera provröret med vävnaden i ett isbad.
• Sonikera provet med din ultraljudsbehandling, t ex UP200St (80% amplitud) i 1 min. i pulsläge (15sek på, 15sek paus). Förvara provet i isbadet.
• Homogenatena centrifugeras därefter för att erhålla specifika pooler (cytosolic, kärn- , mitokondrie eller lysosomalt) för att berika proteinet för analys. Genom att centrifugera provet i 5 minuter vid 5000×g, hämtas supernatanten.

Tillförlitlig temperaturkontroll under ultraljudsbehandling

Temperatur är en avgörande processpåverkande faktor som är särskilt viktig för behandling av biologiska prover, t ex för att förhindra termisk nedbrytning av proteiner. Som alla mekaniska prov beredning tekniker, skapar ultraljudsbehandling värme. Dock kan proverna temperatur kontrolleras väl vid användning av Hielscher Ultrasonics-apparaterna. Vi presenterar olika alternativ för att övervaka och kontrollera temperaturen på dina prover samtidigt som du förbereder dem med en sond-typ ultraljudsmätare eller VialTweeter pre-analytiskt.

1. Övervakning av provtemperaturen: Alla Hielscher digitala ultraljud processorer är utrustade med en intelligent programvara och en pluggable temperatursensor. Koppla in temperatursensorn i ultraljudsenheten (t.ex. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) och sätt in temperaturgivarens spets i ett av provrören. Via digital färgad touch-display, kan du ställa in i menyn av ultraljud processorn ett specifikt temperaturområde för ditt prov ultraljudsbehandling. Ultraljudstorn kommer automatiskt att stanna när maxtemperaturen uppnås och pausa tills provtemperaturen är nere på det lägre värdet av den inställda ∆. Då startar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
2. Angående ultraljuds multiprovenheten VialTweeter kan titanblocket, som håller provrören, förkylas. Sätt i VialTweeter-blocket (endast sonotroden utan givare!) i kylen eller frysen för att förkyla titanblocket hjälper det till att skjuta upp temperaturökningen i provet. Om möjligt kan själva provet förkylas också.
3. Använd ett isbad eller torris för att svalna under ultraljudsbehandling. Placera ditt prov rör (s) under ultraljudsbehandling i ett isbad. För VialTweeter, använd en grund bricka fylld med torris och placera VialTweeter på torrisen så att värmen snabbt kan avledas.

Kunder över hela världen använder Hielscher sond-ultrasonicators samt flera prov ultraljudsbehandling enheter VialTweeter och UIP400MTP för deras dagliga prov beredning arbete i biologiska, biokemiska, medicinska och kliniska laboratorier. Den intelligenta programvara och temperaturkontroll av Hielscher processorerna, temperatur är tillförlitligt kontrollerad och värmeinducerad prov nedbrytning undvikas. Ultraljud prov beredning med Hielscher ultraljud lösningar levererar mycket tillförlitliga och reproducerbara resultat!