Celllys av BL21-celler genom ultraljud
BL21-celler är en stam av E. coli som används i stor utsträckning i forskningslaboratorier, bioteknik och industriell produktion på grund av deras förmåga att uttrycka proteiner mycket effektivt. Ultraljudscellstörning, lys och proteinextraktion är den vanliga metoden för att isolera och samla in de riktade proteinerna från det cellulära inre av BL21-celler. Ultraljud stör cellen helt och släpper ut alla instängda proteiner, vilket gör 100% av proteinet tillgängligt.
BL21 Celler för proteinuttryck
BL21-cell är en kemiskt kompetent E. coli-bakteriestam som är lämplig för omvandling och proteinuttryck på hög nivå med hjälp av ett T7 RNA-polymeras-IPTG-induktionssystem. BL21-celler tillåter högeffektivt proteinuttryck av alla gener som kontrolleras av en T7-promotor. E. coli-stammen BL21(DE3) är en T7 RNA-polymerasbaserad proteinproduktionsstam kombinerad med T7-promotorbaserade uttrycksvektorer och används i stor utsträckning i laboratorier och industri för att producera rekombinanta proteiner. I BL21(DE3) transkriberas uttrycket av genen som kodar för det rekombinanta proteinet av det kromosomalt kodade T7 RNA-polymeraset (T7 RNAP), som transkriberas åtta gånger snabbare än konventionell E. coli RNAP. Detta gör stammen BL21(DE3) mycket effektiv och gör den till ett av de mest föredragna cellsystemen för proteinuttryck.
Protokoll för ultraljudslys och proteinextraktion från BL21-celler
Celllys av BL21-celler utförs mestadels med hjälp av ultraljud i kombination med natrium lauroylsarcosinat (även känd som sarkosyl) som lysbuffert. Fördelarna med ultraljud cell störning och protein extraktion ligger i tillförlitligheten, reproducerbarheten samt enkel, säker och snabb drift av ultraljudsapparater. Protokollet nedan ger en steg-för-steg-riktning för ultraljud BL21-celllys:
- För att avlägsna chaperonproteinerna återsuspenderades BL21 bakteriepellets i 50 ml iskall Sodium Tris-EDTA (STE) buffert (bestående av 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl kompletterat med 100 mM PMSF).
- De 500 ul lysozym (10 mg/ml) tillsätts och cellerna inkuberas på is i 15 minuter.
- Därefter tillsätts 500 ul DTT och 7 ml sarkosyl (10 % (vikt/volym) i STE-buffert).
- Det är viktigt att hålla alla reningsbuffertar iskalla och att hålla proverna på is hela tiden. Alla reningssteg bör utföras i kylrummet om möjligt.
- För ultraljudslys och proteinextraktion är proverna sonikerade i VialTweeter MultiSample Ultrasonicator För 4 x 30 sek vid 100% amplitud med ett 2 minuters intervall mellan varje ultraljudsbehandling. Alternativt kan en ultraljudshomogenisator av sondtyp med mikrospets, t.ex. UP200Ht med S26d2 (3 x 30 sek, 2 min. paus mellan ultraljudscykler, 80 % amplitud) kan användas.
- För ytterligare reningssteg måste proverna förvaras på is eller alternativt förvaras vid -80 °C tills vidare bearbetning.
Ultraljud cellstörare UP200St med mikrospets S26d2 för lys och proteinextraktion
Ultraljudslys under Prescise temperaturkontroll
Den exakta och tillförlitliga temperaturkontrollen är avgörande vid hantering av biologiska prover. Höga temperaturer initierar termiskt inducerad proteinnedbrytning i prover.
Som alla mekaniska provberedningstekniker skapar ultraljudsbehandling värme. Temperaturen på proverna kan dock kontrolleras väl när du använder VialTweeter. Vi presenterar olika alternativ för att övervaka och kontrollera temperaturen på dina prover samtidigt som du förbereder dem med VialTweeter och VialPress för analys.
- Övervakning av provtemperaturen: Ultraljudsprocessorn UP200St, som driver VialTweeter, är utrustad med en intelligent programvara och en pluggbar temperatursensor. Anslut temperatursensorn till UP200St och sätt in spetsen på temperatursensorn i ett av sample rör. Via digital färgad pekskärm kan du ställa in i menyn för UP200St ett specifikt temperaturområde för ditt prov ultraljudsbehandling. Ultraljudaren stannar automatiskt när maxtemperaturen uppnås och pausar tills provtemperaturen är nere på det lägre värdet på den inställda temperaturen ∆. Sedan börjar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
- VialTweeter-blocket kan förkylas. Sätt VialTweeter-blocket (endast sonotrode utan givare!) i kylen eller frysen för att förkyla, titanblocket hjälper till att skjuta upp temperaturökningen i provet. Om möjligt kan själva provet också förkylas.
- Använd torris för att svalna under ultraljudsbehandling. Använd en grund bricka fylld med torris och placera VialTweeter på isen så att värmen snabbt kan skingras.
Kunder över hela världen använder VialTweeter och VialPress för sitt dagliga provberedningsarbete i biologiska, biokemiska, medicinska och kliniska laboratorier. Den intelligenta programvaran och temperaturkontrollen hos UP200St-processorn, temperaturen kontrolleras på ett tillförlitligt sätt och värmeinducerad provnedbrytning undviks. Ultraljudsprovberedning med VialTweeter och VialPress ger mycket tillförlitliga och reproducerbara resultat!
Hitta den optimala ultraljudsstöraren för din lysapplikation
Hielscher Ultrasonics är sedan länge en erfaren tillverkare av högpresterande ultraljudscellstörare och homogenisatorer för laboratorier, bänkskivor och industriella skala. Storleken på din bakteriecellodling, ditt forsknings- eller produktionsmål och volymen av cell som ska bearbetas per timme eller dag är viktiga faktorer för att hitta rätt ultraljudscellstörare för din applikation.
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för samtidig ultraljudsbehandling av multi-prover (upp till 10 flaskor med VialTweeter) och massprover (dvs. mikrotiterplattor / ELISA-plattor med UIP400MTP), samt den klassiska sond-typ lab ultraljudsapparat med olika effektnivåer från 50 till 400 watt till fullt industriella ultraljudsprocessorer med upp till 16 000 watt per enhet för kommersiell cellstörning och proteinutvinning i stor produktion. Alla Hielscher ultraljudsapparater är byggda för 24/7/365 drift under full belastning. Robusthet och tillförlitlighet är kärnfunktionerna i våra ultraljudsenheter.
Alla digitala ultraljudshomogenisatorer är utrustade med smart programvara, färgad pekskärm och automatisk dataprotokollering, vilket gör ultraljudsenheten till ett bekvämt arbetsredskap i laboratorier och produktionsanläggningar.
Låt oss veta vilken typ av celler, vilken volym, med vilken frekvens och med vilket mål du måste bearbeta dina biologiska prover. Vi kommer att rekommendera dig den mest lämpliga ultraljudscellstöraren för dina processkrav.
Tabellen nedan ger dig en indikation på den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem, från kompakta handhållna homogenisatorer och MultiSample ultraljudsprocessorer till industriella ultraljudsprocessorer för kommersiella applikationer:
| Batchvolym | Flöde | Rekommenderade enheter |
|---|---|---|
| 96-brunnar / mikrotiterplattor | N.A. | UIP400MTP |
| 10 injektionsflaskor à 0,5 till 1,5 ml | N.A. | VialTweeter på UP200St |
| 0.01 till 250 ml | 5 till 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 till 500 ml | 10 till 200 ml/min | UP100H |
| 10 till 2000 ml | 20 till 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 till 20L | 0.2 till 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 till 100L | 2 till 10L/min | UIP4000hdT |
| N.A. | 10 till 100 L/min | UIP16000 |
| N.A. | Större | kluster av UIP16000 |
Kontakta oss! / Fråga oss!
UIP400MTP platta ultraljudsbehandling för cellstörningar med hög genomströmning i plattor med 96 brunnar
ultraljud UP200Ht med 2mm microtip S26d2 för ultraljudsbehandling av små prover
Läs mer om hur du kan använda din ultraljudshomogenisator för effektiv och tillförlitlig beredning av buffertlösningar!
Fakta som är värda att veta
Escherichia coli bakterier
Escherichia coli är en bakterietyp, som är icke-sporbildande, gramnegativ och kännetecknas av sin form av en rak stav. E.coli-bakterier finns i miljön, livsmedel och tarmar hos människor och djur. E. coli är vanligtvis rörlig genom att använda peritrika flageller, men det finns också icke-rörliga typer. E.coli är så kallade fakultativt anaeroba kemoorganotrofa organismer, vilket innebär att de är kapabla till både respiratorisk och fermentativ metabolism. De flesta E.coli-typer är godartade och fyller användbara funktioner i kroppen, t.ex. att undertrycka tillväxten av skadliga bakteriearter, syntetisera vitaminer etc.
Escherichia coli-bakterieceller av så kallad B-typ är en speciell kategori av E.coli-stammar, som används i stor utsträckning inom forskning för att undersöka mekanismer som bakteriofagkänslighet eller restriktionsmodifieringssystem. Dessutom värderas E.coli-bakterier som pålitliga arbetshästar för proteinuttryck i bioteknik- och biovetenskapliga laboratorier. Till exempel används E.coli för att syntetisera föreningar som proteiner och oligosackarider i industriell skala. På grund av specifika egenskaper som proteasbrist, låg acetatproduktion vid en hög glukosnivå och förbättrad permeabilitet är E. coli B-celler de mest använda värdcellerna för produktion av genetiskt modifierade proteiner.
Rekombinant protein
Rekombinanta proteiner (rProt) får allt större betydelse inom många olika branscher, bland annat inom kemisk produktion, läkemedel, kosmetika, human- och djurmedicin, jordbruk, livsmedel samt avfallshantering.
Produktionen av rekombinant protein kräver användning av ett expressionssystem. Som uttryckande cellsystem för produktion av rekombinant DNA kan både prokaryota och eukaryota celler användas. Medan bakterieceller används mest för proteinuttryck på grund av faktorer som låg kostnad, enkel skalbarhet och enkla medieförhållanden, är däggdjurs-, jäst-, alger-, insekts- och cellfria system etablerade alternativ. Proteintypen, den funktionella aktiviteten och det erforderliga utbytet av uttryckt protein påverkar valet av det cellsystem som används för proteinuttryck.
För att kunna uttrycka rekombinant protein måste en viss cell transfekteras med en DNA-vektor som innehåller mallen för rekombinant DNA. Cellerna som transfekterats med mallen odlas sedan. Som en konsekvens av den cellulära mekanismen transkriberar och översätter cellerna det protein som är av intresse och producerar därigenom det riktade proteinet.
Eftersom de uttryckta proteinerna är instängda i den cellulära matrisen måste cellen lyseras (störas och brytas) för att proteinerna ska frisättas. I ett efterföljande reningssteg separeras och renas proteinet.
Det första rekombinanta proteinet som användes i behandlingen var rekombinant humant insulin 1982. Idag produceras mer än 170 typer av rekombinanta proteiner över hela världen för medicinska behandlingar. Vanligt förekommande rekombinanta proteiner som används inom medicinen är till exempel rekombinanta hormoner, interferoner, interleukiner, tillväxtfaktorer, tumörnekrosfaktorer, blodkoagulationsfaktorer, trombolytiska läkemedel och enzymer för behandling av allvarliga sjukdomar som diabetes, dvärgväxt, hjärtinfarkt, kronisk hjärtsvikt, cerebral apoplexi, multipel skleros, neutropeni, trombocytopeni, anemi, hepatit, reumatoid artrit, astma, Crohns sjukdom och cancerbehandlingar. (jfr Phuc V. Pham, i Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Litteratur / Referenser
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter ultraljudsapparat för samtidig ultraljudsbehandling av 10 prover, t.ex. för att störa BL21-celler
Högpresterande ultraljud! Hielschers produktsortiment täcker hela spektrumet från den kompakta laboratorieultraljudsapparaten över bänkenheter till fullindustriella ultraljudssystem.