Cellys av BL21-celler med ultraljud

BL21-celler är en stam av E. coli som används i stor utsträckning i forskningslaboratorier, bioteknik och industriell produktion tack vare sin förmåga att uttrycka proteiner mycket effektivt. Cellsönderdelning, lys och proteinextraktion med ultraljud är den vanliga metoden för att isolera och samla in målproteinerna från BL21-cellernas inre. Ultraljudsbehandling sönderdelar cellen fullständigt och frigör alla inneslutna proteiner, vilket gör 100% av proteinet tillgängligt.

BL21-celler för proteinuttryck

BL21 är en kemiskt kompetent E. coli-bakteriestam som lämpar sig för transformation och proteinuttryck på hög nivå med hjälp av ett induktionssystem med T7-RNA-polymeras och IPTG. BL21-celler möjliggör högeffektivt proteinuttryck från vilken gen som helst som står under kontroll av en T7-promotor. E. coli-stammen BL21(DE3) är en stam för proteinproduktion baserad på T7-RNA-polymeras som kombineras med expressionsvektorer baserade på T7-promotorn och används i stor utsträckning i laboratorier och industri för att producera rekombinanta proteiner. I BL21(DE3) transkriberas genen som kodar för det rekombinanta proteinet av det kromosomalt kodade T7-RNA-polymeraset (T7 RNAP), som transkriberar åtta gånger snabbare än konventionellt E. coli-RNAP. Detta gör stammen BL21(DE3) mycket effektiv och till ett av de mest föredragna cellsystemen för proteinuttryck.

Protokoll för lys och proteinextraktion från BL21-celler med ultraljud

Cellys av BL21-celler utförs oftast med ultraljudsbehandling i kombination med natriumlauroylsarkosinat (även känt som sarkosyl) som lysbuffert. Fördelarna med cellsönderdelning och proteinextraktion med ultraljud är tillförlitligheten och reproducerbarheten samt den enkla, säkra och snabba användningen av ultraljudsapparater. Protokollet nedan ger stegvisa anvisningar för lys av BL21-celler med ultraljud:

• För att avlägsna chaperonproteinerna resuspenderades BL21-bakteriepelletarna i 50 ml iskall natrium-Tris-EDTA-buffert (STE) (bestående av 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl med tillsats av 100 mM PMSF).
• Därefter tillsätts 500 ul lysozym (10 mg/ ml) och cellerna inkuberas på is i 15 min.
• Sedan tillsätts 500 ul DTT och 7 ml sarkosyl (10% (w/v), berett i STE-buffert).
• Det är nödvändigt att hålla alla reningsbuffertar iskalla och att hela tiden hålla proverna på is. Alla reningssteg bör om möjligt utföras i kylrum.



• För lys och proteinextraktion med ultraljud behandlas proverna med ultraljud i VialTweeter MultiSample Ultrasonicator i 4 x 30 sek vid 100% amplitud med ett intervall på 2 min mellan varje ultraljudsbehandling. Alternativt kan en ultraljudshomogenisator av sondtyp med mikrospets, t.ex. UP200Ht med S26d2 (3 x 30 sek, 2 min. paus mellan ultraljudscyklerna, 80% amplitud), användas.
• Inför ytterligare reningssteg måste proverna hållas på is eller alternativt förvaras vid -80°C fram till vidare bearbetning.

Ultraljudslys under exakt temperaturkontroll

Exakt och tillförlitlig temperaturkontroll är avgörande vid hantering av biologiska prover. Höga temperaturer initierar termiskt inducerad proteinnedbrytning i proverna.
Liksom alla mekaniska provberedningstekniker alstrar ultraljudsbehandling värme. Provernas temperatur kan dock kontrolleras väl när VialTweeter används. Vi presenterar olika alternativ för att övervaka och kontrollera temperaturen i dina prover medan du bereder dem med VialTweeter och VialPress inför analys.

1. Övervakning av provtemperaturen: Ultraljudsprocessorn UP200St, som driver VialTweeter, är utrustad med intelligent programvara och en anslutningsbar temperatursensor. Anslut temperatursensorn till UP200St och för in temperatursensorns spets i ett av provrören. Via den digitala pekskärmen i färg kan du i menyn på UP200St ställa in ett specifikt temperaturintervall för ultraljudsbehandlingen av dina prover. Ultraljudsapparaten stannar automatiskt när den maximala temperaturen uppnås och pausar tills provtemperaturen har sjunkit till det lägre värdet i det inställda temperaturintervallet ∆. Därefter startar ultraljudsbehandlingen automatiskt igen. Denna smarta funktion förhindrar värmeinducerad nedbrytning.
2. VialTweeter-blocket kan förkylas. Placera VialTweeter-blocket (endast sonotroden utan omvandlare!) i kylen eller frysen för att förkyla titanblocket, vilket hjälper till att fördröja temperaturökningen i provet. Om möjligt kan även själva provet förkylas.
3. Använd torris för kylning under ultraljudsbehandlingen. Använd en grund bricka fylld med torris och placera VialTweeter på torrisen så att värmen snabbt kan avledas.

Kunder över hela världen använder VialTweeter och VialPress för sitt dagliga provberedningsarbete i biologiska, biokemiska, medicinska och kliniska laboratorier. Med UP200St-processorns intelligenta programvara och temperaturreglering regleras temperaturen tillförlitligt och värmeinducerad nedbrytning av prover undviks. Provberedning med ultraljud med VialTweeter och VialPress ger mycket tillförlitliga och reproducerbara resultat!
 

Hitta den optimala ultraljudscelldisruptorn för din lysapplikation

Hielscher Ultrasonics är en tillverkare med lång erfarenhet av högpresterande ultraljudscelldisruptorer och homogenisatorer för laboratorier, bänksystem och system i industriell skala. Storleken på din bakteriecellodling, ditt forsknings- eller produktionsmål och den cellvolym som ska bearbetas per timme eller dag är avgörande faktorer för att hitta rätt ultraljudscelldisruptor för din applikation.
Hielscher Ultrasonics erbjuder olika lösningar för samtidig ultraljudsbehandling av flera prover (upp till 10 provflaskor med VialTweeter) och stora provmängder (dvs. mikrotiterplattor / ELISA-plattor med UIP400MTP), liksom den klassiska sondbaserade ultraljudsapparaten för laboratorier med olika effektnivåer från 50 till 400 watt, ända upp till helt industriella ultraljudsprocessorer med upp till 16 000 watt per enhet för kommersiell cellsönderdelning och proteinextraktion i storskalig produktion. Alla ultraljudsapparater från Hielscher är byggda för drift 24/7/365 under full belastning. Robusthet och tillförlitlighet är centrala egenskaper hos våra ultraljudsapparater.
Alla digitala ultraljudshomogenisatorer är utrustade med smart programvara, pekskärm i färg och automatisk dataloggning, vilket gör ultraljudsapparaten till ett praktiskt arbetsredskap i laboratorier och produktionsanläggningar.
Berätta för oss vilken typ av celler, vilken volym, hur ofta och med vilket mål du behöver bearbeta dina biologiska prover. Vi rekommenderar den ultraljudscelldisruptor som är bäst lämpad för dina processkrav.

Tabellen nedan ger dig en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudssystem, från kompakta handhållna homogenisatorer och MultiSample Ultrasonicators till industriella ultraljudsprocessorer för kommersiella applikationer:

Litteratur / Referenser

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.